CN114173802A

CN114173802A - 用于治疗非渗出性黄斑变性和其他眼睛病症的肽

Info

Publication number: CN114173802A
Application number: CN202080053625.8A
Authority: CN
Inventors: H·L·卡拉戈齐安; J·Y·帕克; V·H·卡拉戈齐安
Original assignee: Rapid Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Rapid Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2022-03-11
Also published as: WO2021021668A1; CA3145870A1; MX2022001062A; US20220031800A1; JP2022541851A; EP4003392A1; KR20220054598A; IL290074A; EP4003392A4

Abstract

使用抗整合素肽的方法，其用于a)改善患有非渗出性年龄相关性黄斑变性的受试者的眼睛的最佳矫正视力和/或b)改善患有色觉受损的受试者的眼睛的色觉和/或用于治疗其他病症。

Description

用于治疗非渗出性黄斑变性和其他眼睛病症的肽

相关申请

本专利申请要求于2019年7月26日提交的题为“用于治疗干性黄斑变性和其他眼睛病症的肽”的美国临时专利申请第62/879,281号的优先权，其全部公开内容明确并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及化学、生命科学、药学和医学领域，并且更具体地涉及药物制剂及其在治疗眼睛障碍中的用途。

背景技术

根据37 CFR 1.71(e)，本专利文件包含受版权保护的材料，并且本专利文件的所有人保留所有版权。

在本专利申请中，范围可被指定为“值1至值2”。除非另有规定，否则在这种背景下，“至”字的使用应被解释为包括定义该范围的所述上值和下值。因此，除非另有规定，否则定义为从值1延伸“至”值2的范围应解释为包括值1、值2和其间的所有值。

另外，在本专利申请中，氨基酸可以使用下表所列的名称、三字母代码和/或单字母代码来互换提及。

氨基酸	三字母代码	单字母代码

丙氨酸	Ala	A
			精氨酸	Arg	R
天冬酰胺	Asn	N
			天冬氨酸	Asp	D
半胱氨酸	Cys	C
			磺基丙氨酸	Cys(酸)	-
谷氨酸	Glu	E
			谷氨酰胺	Gln	Q
甘氨酸	Gly	G
			组氨酸	His	H
异亮氨酸	Ile	I
			亮氨酸	Leu	L
赖氨酸	Lys	K
			蛋氨酸	Met	M
苯丙氨酸	Phe	F
			脯氨酸	Pro	P
丝氨酸	Ser	S
			苏氨酸	Thr	T
酪氨酸	Tyr	Y
			缬氨酸	Val	V

申请人正在开发Risuteganib，一种具有分子式C22-H39-N9-O11-S和以下结构式的非天然肽：

Risuteganib和含有risuteganib的制剂还由其他名称、命名和指定提及，包括：risuteganib；甘氨酰-L-精氨酰甘氨酰-3-磺基-L-丙氨酰-L-苏氨酰-L-脯氨酸；Arg-Gly-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH；ALG-1001和

(Allegro Ophthalmics,LLC，San JuanCapistrano,CA)。

Risuteganib是一种抑制氧化应激途径上游的许多整合素的抗整合素肽。Risuteganib广泛地用于下调多种血管生成和炎性过程，包括与缺氧和氧化应激有关的那些过程。

在美国专利号9,018,352；9,872,886；9,896,480；和10,307,460以及美国专利申请公开号2018/0207227和2019/0062371中提供了有关Risuteganib的额外描述和信息，上述专利和专利申请中的每个的全部公开内容通过引用明确并入本文。

年龄相关性黄斑变性有两种基本类型：非渗出性或“干性”和渗出性或“湿性”。与渗出性或“湿性”形式的疾病相比，非渗出性年龄相关性黄斑变性(下文称为“干性AMD”)不涉及血液或血清从视网膜的小血管渗出。在一些患者中，干性AMD可能会发展成湿性AMD。患有干性AMD的患者通常会经历黄斑变薄导致的视力逐渐丧失，黄斑是视网膜的中心部分。

在干性AMD中，称为玻璃膜疣的无定形黄色碎片沉积物通常在视网膜色素上皮的基底膜附近形成。这导致了黄斑的变薄和干燥，进而导致中心视力的丧失。患有干性AMD的患者通常会经历黄斑变薄导致的视力逐渐丧失，黄斑是视网膜的中心部分。

在过去，对于干性AMD没有已知的治疗方法。干性AMD的治疗通常包括使用年龄相关性眼病研究2(AREDS2)推荐的营养补充剂，以及控制饮食、体重、血压和吸烟，以及暴露于蓝光和紫外光。虽然这些治疗方式可以减缓干性AMD的进展，但它们并不被认为有效地实际逆转由于干性AMD而已经发生的视觉损失。

Risuteganib以前被认为通过减少炎症并阻止病理性新生血管的发生而在治疗年龄相关性黄斑变性方面具有实用性，病理性新生血管的发生是干性(非渗出性)AMD进展到湿性(渗出性)AMD的标志。

如本文所公开的，申请人已经产生了表明向患有干性AMD(尚未进展为湿性AMD)的受试者施用risuteganib不仅可以减少炎症和延迟病理性新生血管的潜在发生而且还可以提供可测量的视力和光学解剖学的改善的日期。

发明内容

本公开描述了用于治疗眼睛病症和改善患有干性AMD的受试者的最佳矫正视力和/或改善患有色觉受损的受试者的色觉的方法和组合物。

根据本公开的一个方面，提供了用于a)改善患有非渗出性年龄相关性黄斑变性的受试者的眼睛的最佳矫正视力和/或b)改善患有色觉受损的受试者的眼睛的色觉的方法，所述方法包括以有效改善所述眼睛的最佳矫正视力和/或色觉的量向所述受试者施用抗整合素肽的步骤。

在本文所公开的方法的一些实施例中，肽是线性或环状的，并包括甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-苏氨酰-脯氨酸-COOH或其片段、同系物、衍生物、药学上可接受的盐、水合物、异构体、多聚体、环状形式、线性形式、缀合物、衍生物或其他修饰形式。

在本文所公开的方法的一些中，该肽包括risuteganib。

在本文所公开的方法的一些中，该肽可具有下式：

X1-R-G-磺基丙氨酸-X

其中X和X1独立地选自：Phe-Val-Ala、-Phe-Leu-Ala、-Phe-Val-Gly、-Phe-Leu-Gly、-Phe-Pro-Gly、-Phe-Pro-Ala、-Phe-Val；或选自Arg、Gly、磺基丙氨酸、Phe、Val、Ala、Leu、Pro、Thr及其盐、组合、D-异构体和L-异构体。

在本文所公开的方法的一些中，该肽可具有下式：

Y-X-Z

其中：Y＝R、H、K、Cys(酸)、G或D；X＝G、A、Cys(酸)、R、G、D或E；以及Z＝Cys(酸)、G、C、R、D、N或E。

在本文所公开的方法的一些中，该肽可包括选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：R-G-Cys(酸)、R-R-Cys、R-Cys酸)-G、Cys(酸)-R-G、Cys(酸)-G-R、R-G-D、R-G-Cys(酸).H-G-Cys(酸)、R-G-N、D-G-R、R-D-G、R-A-E、K-G-D、R-G–Cys(酸)-G-G-G-D-G、环-{R-G-Cys(酸)-F-N-Me-V}、R-A-Cys(酸)、R-G-C、K-G-D、Cys(酸)-R-G、Cys(酸)-G-R、环-{R-G-D-D-F-NMe-V}、H-G-Cys(酸)及其盐。

在本文所公开的方法的一些中，肽玻璃体内施用，或通过任何其他有效的施用途径施用，包括但不限于局部和全身途径(例如，滴眼剂、口服、静脉内、肌肉内、皮下、鼻内、颊、透皮等)或通过从合适的药物递送植入物质或装置释放来施用。

在本文所公开的方法的一些中，肽可包括玻璃体内施用的risuteganib，剂量范围为0.01mg risuteganib至10.0mg risuteganib；或剂量范围为0.05mg risuteganib至5.0mg risuteganib；或剂量范围为1.0mg risuteganib至1.5mg risuteganib。

在本文所公开的方法的一些中，肽可只施用一次。

在本文所公开的方法的一些中，肽可施用多次。

在本文所公开的方法的一些中，肽可施用多次，施用肽之间的间隔为1周至20周；或施用肽之间的间隔为12周至16周。

在本文所公开的方法的一些中，肽包括玻璃体内施用一次或多次的risuteganib，其中每次玻璃体内施用递送1mg至1.5mg risuteganib的剂量。

在本文所公开的方法的一些中，抗整合素肽导致整合素αMβ2的下调。

在本文所公开的方法的一些中，抗整合素肽减少补体3受体的表达。

通过阅读下面阐述的详细描述和实例，将理解本发明的更进一步的方面和细节。

附图说明

下图包括在本专利申请中，并在以下详细描述中提及。这些图只是为了说明本公开的某些方面或实施例，并不以任何方式限制本公开的范围。

图1是显示在患有干性AMD的人类受试者的研究中BCVA访问的平均变化的图。

图2A是显示在玻璃体内注射1mg risuteganib后，干性AMD眼睛在第12周时总错误评分色调样式的变化以及读取字母自基线的变化的图。

图2B是显示在假手术注射后，干性AMD眼睛在第12周时总错误评分色调样式的变化以及读取字母自基线的变化的图。

图3是显示risuteganib响应者(32周时)与假手术响应者(12周时)的总错误评分色调样式变化的图。

图4A是显示在玻璃体内注射1mg risuteganib后，干性AMD眼睛在第12周时平均视网膜敏感度的变化以及读取字母自基线的变化的图。

图4B是显示在假手术注射后，干性AMD眼睛在第12周时平均视网膜敏感度的变化以及读取字母自基线的变化的图。

图5是显示risuteganib响应者(32周时)与假手术响应者(12周时)的平均视网膜敏感度变化的图。

图6A是显示在玻璃体内注射1mg risuteganib后，干性AMD眼睛在第12周时由总基因座数测量的微视野检查的变化以及读取字母数自基线的变化的图。

图6B是显示在假手术注射后，干性AMD眼睛在第12周时由总基因座数测量的微视野检查的变化以及读取字母数自基线的变化的图。

图7是显示risuteganib响应者(32周时)与假手术响应者(12周时)的由总基因座数测量的微视野检查的变化的图。

图8A显示了第1组眼睛在基线(处理前)的地理萎缩(GA)的位置和发生率。

图8B显示了第2组眼睛在基线(处理前)的地理萎缩(GA)的位置和发生率。

图9A显示了中央1-mm和2-mm子域的外部限制膜图，没有显示出破坏。

图9B显示了中央1-mm和2-mm子域的外部限制膜图，显示出节段性破坏。

图9C显示了中央1-mm和2-mm子域的外部限制膜图，显示出影响中央凹的弥漫性破坏。

图10A显示了取自risuteganib响应者眼睛的OCT图像(灰度)。

图10B显示了取自risuteganib响应者眼睛的OCT图像(灰度)，其中叠加了各个视网膜层的映射。

图10C显示了risuteganib响应者眼睛的ILM-RPE图。

图10D显示了risuteganib响应者眼睛的EZ-RPE图。

图10E显示了risuteganib响应者眼睛的RPE-BM图。

图11A显示了取自risuteganib无响应者眼睛的OCT图像(灰度)。

图11B显示了取自risuteganib无响应者眼睛的OCT图像(灰度)，其中叠加了各个视网膜层的映射。

图11C显示了risuteganib无响应者眼睛的ILM-RPE图。

图11D显示了risuteganib无响应者眼睛的EZ-RPE图。

图11E显示了risuteganib无响应者眼睛的RPE-BM图。

图12A是在ITGAM和ITGB2条件下在早产儿视网膜炎(ROP)小鼠中比较risuteganib与对照对基因表达的影响的条形图。

图12B是显示在ROP小鼠中risuteganib与对照对与补体、细胞粘附和白细胞迁移相关的基因表达的影响的条形图。

图13A是显示在暴露于红藻氨酸后risuteganib与对照对视网膜神经元细胞存活的影响的条形图。

图13B是显示在暴露于红藻氨酸后risuteganib与对照对视网膜Muller细胞存活的影响的条形图。

图13C是显示在暴露于过氧化物后risuteganib与对照对视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响的条形图。

图14是显示细胞毒性应激和risuteganib处理后小鼠Müller细胞活力的条形图。

图15是显示细胞毒性应激和risuteganib处理后小鼠视网膜神经元细胞活力的条形图。

图16是显示细胞毒性应激和risuteganib处理后小鼠RPE细胞活力的条形图。

图17是显示在三种剂量水平的risuteganib处理后与对照相比的人(MIO-M1)Muller细胞活力的条形图。

图18是显示用抗VEGF剂(Lucentis、Avastin和Eylea)处理和risuteganib(Luminate)处理后的人(MIO-M1)Muller细胞活力的条形图。

图19(4-9)是显示用抗VEGF剂(Lucentis、Avastin和Eylea)处理和risuteganib(Luminate)处理后人(MIO-M1)Muller细胞中的活性氧(ROS)水平的条形图。

图20(4-10)是显示用抗VEGF剂(Lucentis、Avastin和Eylea)处理和risuteganib(Luminate)处理后人(MIO-M1)Muller细胞中的线粒体膜电位的条形图。

图21A是比较对照与氢醌与氢醌+risuteganib对RPE细胞中线粒体膜电位的影响的条形图。

图21B是比较对照与氢醌与氢醌+risuteganib对RPE细胞中活性氧(ROS)产生的影响的条形图。

图21C是比较对照对氢醌对氢醌+risuteganib对RPE细胞活力的影响的条形图。

具体实施方式

以下详细描述及其所参考的附图旨在描述本发明的一些但不一定是全部的实例或实施例。所描述的实施例在所有方面仅被认为是说明性的而非限制性的。该详细描述和附图的内容不以任何方式限制本发明的范围。

如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指人类或非人类动物，例如人类、灵长类、哺乳动物和脊椎动物。

如本文所用，术语“治疗(treat或treating)”是指预防、消除、治愈、阻止、降低病症、疾病或障碍的严重程度或减少病症、疾病或障碍的至少一种症状。

如本文所用，短语“有效量”或“有效的量”是指以合理的收益/风险比产生一些所需效果的药剂的量。在某些实施例中，该术语是指治疗干性AMD或导致患有干性AMD的受试者恢复先前丧失的视力所必需或足够的量。有效量可以根据诸如所治疗的疾病或病况、所施用的特定组合物或疾病或病况的严重程度的因素而变化。本领域技术人员可以凭经验确定特定试剂的有效量，而无需过度实验。

本申请公开了Risuteganib的其他数据、信息和治疗用途。Risuteganib被证明会引起许多影响，包括以下内容：

·通过下调VEGF和其他促血管生成生长因子(包括ANG-2)的产生来阻止血管生成和新生血管的可能消退；在OIR、CNV和hVEGF小鼠模型中抑制视网膜血管生成；抑制基质涂层表面上的内皮粘附和迁移并抑制内皮细胞增殖

·通过抑制VEGF和炎性介质的产生减少血管渗漏；

·至少部分通过靶向多个整合素亚基减少炎症；减少补体3受体(也称为整合素αMβ2)的表达；减少白细胞粘附；减少跨内皮白细胞迁移；以及减少人类免疫细胞2中TNF-α通路基因的表达；降低促炎细胞因子水平(例如，在角膜组织中)。

·神经保护/神经再生/通过减少细胞凋亡、增加细胞存活(例如，在ROP模型中)来恢复丧失或受损的神经功能；减少自由基氧的产生；增强线粒体健康；稳定和阻止自线粒体细胞膜的渗漏；改善视网膜和/或视神经功能；改善视觉；改善患有视网膜和/或视神经变性或损伤(例如，由于干性黄斑变性、青光眼、遗传性或家族性视网膜和/或黄斑病症，包括但不限于莱伯先天性黑蒙、无脉络膜症、Stargardt病、Usher综合征和全色盲；影响中央视网膜的其他遗传性营养不良；由于负责脉络膜(例如，无脉络膜症)或视网膜色素上皮(RPE)(例如，Stargardt病)变化的基因突变导致的视网膜和/或视神经变性))的受试者的视觉或恢复先前丧失的视力；治疗光感受器外节的退化(例如，Stargardt病)；治疗受损的色觉；治疗双极细胞和/或Mueller细胞的退化(例如，x-连锁视网膜劈裂症)；增加线粒体膜电位；改善线粒体生物能量学；在机械、氧化、低氧、缺氧、化学、化学毒性或其他应激下(例如，在H2O2和氢醌暴露后的视网膜组织中)减少组织中的线粒体活性氧(ROS)。

人类受试者中干性AMD的Risuteganib治疗

已被诊断患有需要治疗的中度非渗出性AMD的合格受试者被纳入并随机分配到第1组或第2组。二十五名受试者被分配到第1组，和十五(15)名受试者被分配到第2组。如下对第1组和第2组的受试者施用研究治疗：

·分配到第1组的每个受试者在研究的第1天接受了由在研究眼睛中假手术注射组成的第一次治疗，然后在研究的第16周期间交叉接受由向研究眼睛中玻璃体内注射1.0mg/50μL risuteganib组成的第二次治疗。

·分配到第2组的每个受试者在研究的第1天接受了由向研究眼睛中玻璃体内注射1.0mg/50μL risuteganib(即1.0mg，在50μL等渗盐水溶液中)组成的第一次治疗，和在研究的第16周期间接受向研究眼睛中玻璃体内注射1.0mg/50μLrisuteganib组成的第二次治疗。

第1组和第2组中的受试者接受以下治疗：因此，第1组中的受试者在研究眼睛中接受初始假手术注射，然后在研究眼睛中接受单次1mg剂量的risuteganib。第2组中的受试者在研究眼睛中接受总共两(2)剂risuteganib(每剂1mg)。

在整个研究的不同时间点进行了大量的研究评估。这些研究评估包括：屈光眼检查、BCVA和低亮度BCVA测定、Lanthony D-15色觉测试、眼内压(IOP)测量、间接检眼镜检查/扩张眼底检查和频域光学相干断层扫描(SD-OCT)。此外，从每个受试者获得血液和唾液样本用于遗传分析。上述研究评估在下表1所示的时间点进行，如下所示：

表1

访问和评估时间表

主要功效结果：

对于这项研究，主要功效终点被认为是BCVA改善至少8个字母(1.5行)BCVA的群体百分比。下面的表2总结了在第12周表现出这种主要功效结果的第2组受试者的比例和在研究的第28周表现出这种主要功效结果的第1组受试者的比例：

表2

在主要终点周增加8个或更多BCVA个字母读取的受试者比例

缩写：CI，置信区间；max，最大值；min，最小值；SD，标准偏差。

主要终点周是假手术组的第12周和risuteganib组的第28周。

确定在基线时，没有解剖测量显示出risuteganib无响应者眼睛和假手术眼睛之间的显著差异。

图1是显示在患有干性AMD的人类受试者的研究中BCVA访问的平均变化的图。在第28周，第2组中增加至少8个BCVA字母读取的受试者比例为48％，相比之下，第1组在第12周时该比例为7.1％。虽然没有计划进行假设检验，但使用2面Fisher精确检验的事后分析表明，在组间存在统计学上的显著差异(P＝.013)。

进行了额外的事后分析以评估risuteganib治疗受试者中中央凹地理萎缩(GA)的存在是否影响BCVA改善的程度。第2组受试者分为2个亚组：眼睛在中央6-mm子域中没有中央凹地理萎缩(GA)的那些(“无GA亚组”)和在中央6-mm子域中有GA的那些(“GA亚组”)。与GA亚组相比时，在无GA亚组中，增加至少8个BCVA字母读取的risuteganib治疗受试者的比例更高(80％对40％)。

次要功效结果：

次要功效结果被认为如下：

·第12周第1组和第28周第2组之间观察到的平均BCVA变化；

·第12周第1组和第2组之间观察到的平均BCVA变化；

·第1组和第2组之间观察到的最大BCVA变化；和

·表现出BCVA改善至少8个字母(1.5行)BCVA的所有受试者的百分比。

下面的表3总结了达到或超过主要终点标准的受试者子集的平均BCVA随时间的变化：

表3

在主要终点周增加8个或更多BCVA字母读取的受试者子集中的平均BCVA随时间变化

(表3接下页)

缩写：CI，置信区间；max，最大值；min，最小值；NA；不适用；SD，标准偏差。

下面的表4总结了研究中任何一周的BCVA随时间的变化：

表4

在任何一周增加8个或更多BCVA字母读取的受试者子集中的平均BCVA随时间变化

(表4接下页)

色觉测试

研究受试者的色觉测试结果总结在下表5中。

表5

由总错误评分色调样式测量的色觉

如上表5所示，第1组受试者在筛选(治疗前)时的平均总色觉错误评分为50.52。在第12周，第1组受试者的平均色觉评分增加了1.97(色觉恶化)。在交叉和施用单剂量risuteganib后，在第32周，第1组受试者的平均总色觉错误评分下降了(色觉改善)1.76。

如上表5所示，第2组受试者在色觉测试中的平均总错误评分在筛选时为43.27。第2组受试者的该评分在第12周增加了(色觉恶化)2.41，然后在第32周降低了(色觉改善)4.36。

图2A和2B显示了在第12周时总错误评分变化以及BCVA字母读取自基线变化的散点图的分析。图2A显示了第2组受试者在其初始risuteganib剂量后12周的负相关(色觉评分降低与增加的BCVA相关)，并且图2B显示了第1组受试者在其初始假手术注射后12周的轻微正相关。

通过响应者状态(有或没有≥8个字母BCVA增加的受试者)检查总错误评分的变化表明，在第32周，risuteganib响应者的色觉下降了(改善)13.03，相比之下，假手术响应者在第12周的色觉增加了(恶化)2.98，如图3的条形图所示。

视野检查Humphrey视野评估的改进

下面的表6显示了来自Humphrey视野评估的平均偏差(MD)评分，该评估将受试者的表现与年龄匹配的规范数据库进行了比较。

表6

用平均偏差测量的Humphrey视野

缩写：CI，置信区间；dB，分贝；max，最大值；min，最小值；SD，标准偏差。

注意：仅包括“可接受”质量的测量。

在假手术组中，筛选时的平均MD评分为-4.074dB。该评分在第12周增加了(改善)0.561dB；交叉至1次risuteganib注射后，该评分在第32周增加了0.158dB。在risuteganib组中，筛选时的平均MD评分为-4.557dB。该评分在第12周增加了0.302dB，并且在第32周增加了0.191dB。

下面的表7显示了来自Humphrey视野评估的模式标准偏差(PSD)评分，它可以识别焦点缺陷。

表7

由模式标准偏差测量的Humphrey视野

注意：仅包括“可接受”质量的测量。

在第1组受试者中，筛选时(治疗前)的平均PSD评分为2.401dB。第1组受试者的这个分数在第12周增加了0.447dB。在交叉和视野单次risuteganib注射后，第1组受试者的这个分数在第32周增加了0.469dB。

在第2组受试者中，筛选时(治疗前)的平均PSD评分为3.352dB。该分数在第12周下降了0.340dB，并且在第32周增加了0.115dB。

视网膜敏感度

下面的表8显示了由微视野检查测量的平均视网膜敏感度。

表8

由平均敏感度测量的微视野检查

如上表8所示，第1组受试者的平均视网膜敏感度在筛选时(治疗前)为12.43dB。第1组受试者的该分数在第12周下降了(恶化)1.49dB。在向第1组受试者交叉和施用单次risuteganib注射后，那些受试者的平均视网膜敏感度评分在第32周下降了2.16dB。

在第2组受试者中，筛查时(治疗前)的平均视网膜敏感度为8.52dB。第2组受试者的该分数在第12周下降了0.85dB，并且在第32周进一步下降了0.53dB。

图4A和4B显示了在第12周时平均敏感度变化以及BCVA字母读取自基线的变化的散点图。图4A显示了第2组受试者在其初始risuteganib剂量后的正相关(平均敏感度增加与BCVA增加相关)和图4B显示了第1组受试者在其初始假手术注射后的轻微负相关。

响应者状态对平均敏感度变化的检查表明，risuteganib响应者在第32周时增加了(改善)2.2dB，相比之下，假手术响应者在第12周时减少了(恶化)1.9dB，如图5中的条形图所示。

下面的表9总结了在使用20-dB阈值、11-dB阈值和通过测量绝对暗点的评估中求和的具有降低的视网膜敏感度的基因座的数量。

表9

由总基因座数测量的微视野检查

(表9接下页)

在假手术组中，筛选时敏感度降低的平均基因座总数为65.4。该分数在第12周增加了(恶化)5.1；交叉至1次risuteganib注射后，该分数在第32周增加了7.9。在risuteganib组中，筛选时敏感度降低的平均基因座总数为81.4。该分数在第12周增加了6.1，并且在第32周增加了1.0。

图6A和6B显示了在第12周时视网膜敏感度降低的基因座数量变化以及BCVA字母读取自基线的变化的散点图。图6A显示了第2组受试者在其初始risuteganib注射后的负相关(敏感度降低的总基因座数降低与BCVA增加相关)，并且图6B显示了第1组受试者在其初始假手术注射后的轻微正相关。错误！未找到参考来源。

通过响应者状态检查具有降低的视网膜敏感度的总基因座数量的变化表明，risuteganib响应者在第32周时减少了(改善)17.75，相比之下，假手术响应者在第12周时增加了(恶化)11.71，如图7的条形图所示。(P＝0.014)。

低亮度视力

下面的表10总结了研究受试者的低亮度视力。

表10

通过访问改善低亮度视力

如上表10所示，第1组受试者的平均低亮度视力在筛选时(治疗前)为48.1个字母读取。在第12周，第1组受试者的该评分增加了(改善)0.9个字母。在向第1组受试者交叉和施用单次risuteganib注射后，该分数在第32周额外增加了2.6个字母。

此外，如上表10所示，第2组受试者的平均低亮度视力在筛选时为47.4个字母读取。第2组受试者的该分数在第12周降低了(恶化)1.0个字母，此后在第32周增加了2.0个字母。

光学相干断层扫描(OCT)进行的视网膜检查

OCT扫描由两(2)位不相关的专家分析。

OCT分析1：

在筛选(治疗前)和第12周对第1组受试者和第32周对第2组受试者分析视网膜子域和层段的平均厚度和平均体积。测试结果总结在下表11中。

表11

Risuteganib无响应者眼睛与响应者眼睛的基线定量解剖测量

缩写：EZ，椭圆体区；RPEDC，视网膜色素上皮-玻璃膜疣复合体。

在基线时，与不响应risuteganib的眼睛相比，那些响应risuteganib的眼睛的外层视网膜的中央子域的平均厚度显著更大(139.600vs 113.917μm；P＝0.001)；与未响应者眼睛相比，响应者眼睛在基线时的光感受器层的中央子域的平均厚度也显著更大(49.300vs 45.083μm；P＝0.015；表11)。与未响应者眼睛相比，响应者眼睛在基线时的相同解剖位置体积也显著更大(外层视网膜的中央子域，0.110vs 0.090mm³；P＝0.001，和光感受器层的中央子域，0.039vs 0.035mm³；P＝0.011)。此外，响应者眼睛的EZ缺陷面积在基线时显著小于未响应者(0.111vs 0.308mm²；P＝0.012)。其他解剖学测量没有显示出risuteganib响应者和未响应者眼睛在基线时的显著差异。

除了对OCT图像进行定量分析外，还对基线(治疗前)的OCT图像进行了定性评估，以鉴定视网膜的中央凹(1-mm中央子域)以及中央凹中心的任何地方的GA。

在基线(治疗前)，第2组受试者的25只眼睛中有7只(28％)有GA，其中6只(24％)影响了中央凹，并且其中2只(8％)涉及中央凹中心，如图8A所示。此外，如图8B所示，在基线(治疗前)，第1组受试者的14只眼睛中有5只(36％)有GA，其中3只(26％)涉及中央凹，并且其中1只(7％)影响中央凹中心。以下表12和表13分别探讨了功能性视力结果与基线GA存在或不存在之间的关系：

表12

在基线时有地理萎缩的研究眼睛的视力功能结果

表13

在基线时没有地理萎缩的研究眼睛的视力功能结果

由于只有一只假手术治疗的眼睛的视力有至少8个字母的改善，所以不可能用假手术组来确定GA的存在或不存在对功能结果的影响。因此，下面的讨论集中在risuteganib组。

当使用8个字母的改善阈值时，基线时没有任何GA的risuteganib治疗眼睛(n＝18)的应答率为56％，相比之下，基线时有任何GA的risuteganib治疗眼睛(n＝7)的应答率为29％。当使用10个字母的改善(分别为44％vs 29％)或15个字母的改善(分别为22％vs14％)作为视力阈值时，也保持同样的模式。

基线时在中央凹没有GA的risuteganib治疗眼睛(n＝19)的应答率(≥8个字母的改善阈值)为58％，相比之下，基线时在中央凹有GA的risuteganib眼睛(n＝6)的应答率为17％。当使用10个字母的改善(分别为37％vs 17％)或15个字母的改善(分别为26％vs0％)作为视力阈值时，也保持同样的模式。

基线时中央凹中心没有GA的risuteganib治疗眼睛(n＝23)的应答率(≥8个字母的改善阈值)为48％，相比之下，基线时中央凹中心有GA的risuteganib眼睛(n＝2)的应答率为50％。然而，由于只有2只眼睛在中央凹中心有GA，所以这些眼睛的50％应答率并不具有参考价值，并且在这种情况下不能得出关于GA的重要性的结论。

总的来说，这些结果表明，在视网膜的任何地方或至少在中央1mm(负责BCVA的视网膜区域)没有GA会增加对risuteganib响应的可能性。

还对OCT图像进行了定量分析，以测量解剖学测量随时间的变化。这种分析总结在下面的表14中：

表14

Risuteganib未应答者眼睛与应答者眼睛在第32周时的定量解剖测量自基线的变化

从基线到第32周，risuteganib响应者眼睛的内层视网膜中央子域的厚度自基线增加显著更大(差异为7.450μm；P＝0.042)，并且体积自基线增加显著更大(差异为0.006mm³；P＝0.033)，与risuteganib未响应者眼睛相比。其他解剖测量都未显示随时间推移，响应者和未响应者眼睛之间的显著差异。

与假手术眼睛从基线到第12周的平均变化相比，观察到risuteganib眼睛的内层视网膜的中央凹中心(差异为15.404μm；P＝0.011)，外层视网膜的中央凹中心和中央子域(分别地，差异为-14.794μm；P＝0.007和差异为-3.812μm；P＝0.042)，以及光感受器层的中央子域(差异为-2.545μm；P＝0.007)的平均厚度从基线到第32周的平均变化有显著差异。这总结在下面的表15中：

表15

risuteganib组在第32周时定量解剖测量自基线的变化与假手术组在第12周时定量解剖测量自基线的变化

如上表15所示，与假手术眼睛从基线到第12周的平均变化相比，还观察到risuteganib眼睛的外层视网膜的中央子域(差异为-0.003mm³；P＝0.035)，以及光感受器层的中央和下部子域(分别地，差异为-0.002mm³；P＝0.009和差异为-0.002mm³；P＝0.041)从基线到第32周的总体积的平均变化有显著差异。在这些中的大多数情况下，risuteganib眼睛的厚度或体积随时间推移的减少较大，假手术眼睛显示出测量减少或增加较小；但是，假手术眼睛的内层视网膜中央凹中心的平均厚度减少较大。

其他解剖测量均未显示risuteganib和假手术眼睛之间随着时间推移的显著差异。

OCT分析2：

在分析#2中，对研究眼睛的OCT图像进行分析，以确定假手术眼睛在基线和第12周时以及risuteganib眼睛在基线和第32周时众多视网膜子域和层段的平均厚度和平均体积，以记录基于基线测量或那些测量自基线变化的眼睛组之间的任何显著差异。

risuteganib响应者状态的基线解剖测量。在基线时，与不响应risuteganib的眼睛相比，那些响应risuteganib的眼睛在7个不同的视网膜指标上的平均厚度显著更大：平均总视网膜中央子域厚度(256.11vs 221.13μm；P＝0.011)，平均总视网膜中间子域(中央2mm)厚度(294.80vs 265.73μm；P＝0.004)，平均ONL-RPE中央凹厚度(170.66vs 136.07μm；P＝0.020)，平均ONL-RPE中央子域厚度(149.43vs 123.33μm；P＝0.003)，平均ONL-RPE中间子域厚度(130.07vs 112.01μm；P＝0.023)，平均ONL-EZ中央子域厚度(116.17vs 101.31μm；P＝0.021)，平均ONL-EZ中间子域厚度(95.43vs 86.15μm；P＝0.032)这些数据总结在下面的表16：

表16

Risuteganib未响应者眼睛与响应者眼睛的基线定量解剖测量

缩写：ELM-EZ，外界膜-椭圆体区；ELM-RPE，外界膜-视网膜色素上皮；EZ，椭圆体区；EZ-RPE，椭圆体区-视网膜色素上皮；ONL-EZ，外核层-椭圆体区；ONL-RPE，外核层-视网膜色素上皮；RPE-BM，视网膜色素上皮Bruch膜。

与risuteganib未响应者眼睛相比，risuteganib响应者眼睛的7个相同指标中，有6个指标在基线时的体积也明显较大：总视网膜中央子域体积(0.20vs 0.17mm³；P＝0.010)，总视网膜中间子域体积(0.93vs 0.83mm³；P＝0.004)，ONL-RPE中央子域体积(0.12vs 0.10mm³；P＝0.003)，ONL-RPE中间子域体积(0.41vs 0.35mm³；P＝0.022)，ONL-EZ中央子域体积(0.09vs 0.08mm³；P＝0.021)，以及ONL-EZ中间子域体积(0.30vs 0.27mm³；P＝0.030)。

在基线时，其他解剖测量均未显示出响应者和未响应者眼睛之间的显著差异。

除了OCT图像的定量分析外，OCT分析#2还包括对OCT图像的定性评估，以鉴定GA、假性玻璃膜疣以及ELM和EZ层的破坏情况。图9A、9B和9C说明了也进行了评估的基于定量映射的ELM内不同的病理水平，图9A(左)显示没有ELM破坏，图9B(中)显示节段性破坏，和图9C显示弥漫性破坏。

定性评估显示，除了EZ层中央1-mm象限的弥漫性破坏外，risuteganib响应者和未响应者眼睛在基线时的解剖特征没有显著差异(P＝0.027)。

图10A至10E和图11A至11E分别显示了risuteganib响应者眼睛和未响应者眼睛在基线时的OCT和图图像。两个ILM-RPE图(图10C和11C)都显示了主要的正常图像。然而，在图10D的EZ-RPE图和图10D的RPE-BM图中，risuteganib响应者眼睛只显示小面积的衰减/萎缩，而在图11D的EZ-RPE图和图11D的RPE-BM图中未响应者眼睛显示弥漫性衰减/萎缩。

risuteganib响应者状态的基线解剖测量。在基线时，与risuteganib未响应者眼睛相比，响应risuteganib的有至少11个字母改善的八(8)只眼睛(以下称为“超级响应者”)在7个不同的视网膜指标中平均厚度显著更大：平均总视网膜中央子域厚度(255.74vs221.13μm；P＝0.046)，平均总视网膜中间子域厚度(293.59vs 265.73μm；P＝0.021)，平均ONL-RPE中央窝厚度(167.75vs 136.07μm；P＝0.044)，平均ONL-RPE中央子域厚度(150.31vs 123.33μm；P＝0.014)，平均ONL-RPE中间子域厚度(130.85vs 112.01μm；P＝0.040)，平均ONL-EZ中央子域厚度(117.93vs 101.31μm；P＝0.023)，以及平均ONL-EZ中间子域厚度(97.92vs 86.15μm；P＝0.010)。这些数据总结在下面的表17：

表17

risuteganib响应者眼睛与超级响应者眼睛的基线定量解剖测量

与未响应者眼睛相比，超级响应者的7个相同指标中的6个指标在基线时也有显著更大的体积：总视网膜中央子域体积(0.20vs 0.17mm³；P＝0.045)，总视网膜中间子域体积(0.92vs 0.83mm³；P＝0.021)，ONL-RPE中央子域体积(0.12vs 0.10mm³；P＝0.013)，ONL-RPE中间子域体积(0.41vs 0.35mm³；P＝0.039)，ONL-EZ中央子域体积(0.09vs 0.08mm³；P＝0.023)，以及ONL-EZ中间子域体积(0.31vs 0.27mm³；P＝0.010)。除了这些注意到的体积差异外，如上表17所示，观察到risuteganib超级响应者和未响应者眼睛之间在基线的解剖特征没有显著差异。

包括图覆盖在内的其他解剖测量在基线时没有显示出超级响应者和未响应者眼睛之间的显著差异。

Risuteganib亚组与假手术组基线的解剖测量。在基线时，解剖测量均未显示出risuteganib未响应者眼睛和假手术眼睛之间的显著差异。这总结在下面的表18中：

表18

risuteganib未响应者眼睛与假手术眼睛的基线定量解剖测量

与假手术眼睛相比，risuteganib响应者眼睛在基线时总视网膜中央凹中心的平均厚度显著更大(204.31vs 167.20μm；P＝0.036)。这总结在下面的表19中。其他解剖测量均没有显示出risuteganib响应者眼睛和假手术眼睛之间在基线时的显著差异。

表19

risuteganib响应者眼睛与假手术眼睛的基线定量解剖测量

治疗组的基线解剖测量。在基线时，解剖测量均未显示出risuteganib组和假手术组之间的显著差异。这总结在下面的表20中。

表20

Risuteganib组与假手术组的基线定量解剖测量

除了RPE-BM体积的变化(-0.049vs 0.037mm³；P＝0.034)(其中响应者眼睛显示出下降且未响应者眼睛显示出增加)外，解剖测量均未显示出risuteganib响应者眼睛和未响应者眼睛之间在第32周时自基线变化的显著差异，如下表21所总结的：

表21

Risuteganib未响应者眼睛与响应者眼睛在第32周时的定量解剖测量自基线的变化

risuteganib未响应者组的一名受试者因缺少终点图像而被排除。

解剖测量均未显示出risuteganib超级响应者眼睛和未响应者眼睛之间在第32周时自基线变化的显著差异，如下表22所总结的：

表22

Risuteganib未响应者眼睛与超级Risuteganib眼睛在第32周时的定量解剖测量自基线的变化

注：risuteganib未响应者组的一名受试者因缺少终点图像而被排除。

Risuteganib亚组与假手术组的解剖测量随时间的变化。与risuteganib未响应者眼睛在第32周时自基线的变化相比，假手术眼睛在3个不同视网膜指标中在第12周时自基线的平均厚度变化显著更大：平均总视网膜中央子域厚度(1.659vs-5.981μm；P＝0.043)，平均总视网膜中间子域厚度(1.281vs-4.046μm；P＝0.016)，和平均ONL-RPE中间子域厚度(0.778vs-6.320μm；P＝0.047)。这总结在下面的表23中。

表23

Risuteganib未响应者眼睛在第32周时定量解剖测量自基线的变化与假手术眼睛在第12周时定量解剖测量自基线的变化

注：risuteganib未响应者组的一名受试者和假手术组的一名受试者因缺少终点图像而被排除。

与risuteganib未响应者眼睛在第32周时自基线的变化相比，假手术眼睛的相同指标在第12周时自基线的体积变化也显著更大：总视网膜中央子域体积(0.002vs-0.004mm³；P＝0.047)，总视网膜中间子域体积(0.005vs-0.012mm³；P＝0.020)，和ONL-RPE中间子域体积(0.003vs-0.020mm³；P＝0.046)。此外，假手术眼睛的总视网膜体积(-0.464vs0.091mm³；P＝0.028)和RPE-BM体积(-0.071vs 0.037mm³；P＝0.003)在第12周时自基线的变化与未响应者眼睛在第32周时自基线的变化相比显著较小。

解剖测量均未显示出risuteganib未响应者眼睛和假手术眼睛之间在第32周时自基线变化的显著差异。

解剖测量均未显示出risuteganib响应者眼睛在第32周时自基线变化和假手术眼睛在第12周时自基线变化之间的显著差异，如下表24所总结的：

表24

Risuteganib响应者眼睛在第32周时定量解剖测量的自基线变化和假手术眼睛在第12周时定量解剖测量的自基线变化

注：假手术组的一名受试者因缺少终点图像而被排除。

治疗组的解剖测量随时间的变化。在统计学上，与用risuteganib治疗的眼睛在第32周时平均总视网膜中间子域厚度(1.281vs-2.548μm；P＝0.048)和平均ONL-RPE中间子域厚度(0.778vs-6.441μm；P＝0.036)的自基线变化相比，假手术治疗的眼睛在第12周时平均厚度自基线变化显著更大。这总结在下面的表25中。

表25

Risuteganib组在第32周时定量解剖测量的自基线变化与假手术组在第12周时定量解剖测量的自基线变化

注：risuteganib组的一名受试者和假手术组的一名受试者因缺少终点图像而被排除。

与risuteganib眼睛在第32周时的自基线变化相比，假手术眼睛的相同指标在第12周时自基线的体积变化也显著更大：总视网膜中间子域体积(0.005vs-0.008mm³；P＝0.049)和ONL-RPE中间子域体积(0.003vs-0.020mm³；P＝0.033)。

其他解剖测量均未显示出risuteganib眼睛在第32周时自基线变化与假手术眼睛在第12周时自基线变化之间的显著差异。

Risuteganib响应者组内解剖测量随时间的变化

配对眼睛分析显示，risuteganib未响应者眼睛的平均总视网膜中间子域厚度(-4.046μm；P＝0.019)和平均ONL-RPE中间子域厚度(-6.320μm；P＝0.041)在第32周时的平均厚度自基线显著下降，并且risuteganib响应者和超级响应者眼睛的平均ELM-RPE中央子域厚度在第32周时的平均厚度自基线显著下降(分别为-3.102μm；P＝0.018和-3.461μm；P＝0.047)，如下表26所总结的。

表26

Risuteganib响应者组基线和第32周时的定量配对解剖测量

在相同眼睛组中相同指标在第32周时体积自基线也显著下降：响应者眼睛的总视网膜中间子域体积(-0.012mm³；P＝0.027)和ONL-RPE中间子域体积(-0.020mm³；P＝0.044)，并且响应者和超级响应者眼睛的ELM-RPE中央子域体积(分别为-0.002mm³；P＝0.021和-0.003mm³；P＝0.048)。

在risuteganib未响应者眼睛<20μm EZ(+1.288％；P＝0.027)和<10μm EZ(+1.332％；P＝0.044)，在响应者眼睛150μm RPE-BM(3.335％；P＝0.003)和50μmRPE-BM(-3.494％；P＝0.006)，以及在超级响应者眼睛150μm RPE-BM(+2.943％；P＝0.037)中观察到在第32周时图覆盖自基线的显著差异。

眼睛的任何risuteganib响应者组的其他解剖测量均未显示出在第32周时自基线的显著差异。

治疗组内解剖测量随时间的变化。配对眼睛分析显示，risuteganib组的平均总视网膜中间子域厚度(-2.548μm；P＝0.040)，平均ONL-RPE中央子域厚度(-7.216μm；P＝0.026)，平均ONL-RPE中央子域厚度(-6.441μm；P＝0.025)，以及平均ELM-RPE中央子域厚度(-2.912μm；P＝0.010)在第32周时平均厚度自基线显著下降。这总结在下面的表27中：

表27

Risuteganib组在基线和第32周以及假手术组在基线和第12周的定量配对解剖测量

注：假手术组的一名受试者因缺少终点图像而被排除。

在risuteganib组的ONL-RPE中央子域体积(-0.005mm³；P＝0.035)、ONL-RPE中间子域体积(-0.020mm³；P＝0.025)和ELM-RPE中间子域体积(-0.002mm³；P＝0.016)中观察到在第32周时体积自基线的显著下降，并且在假手术组的总视网膜体积(-0.464mm³；P＝0.036)和RPE-BM体积(-0.071mm³；P＝0.016)中观察到在第12周时体积自基线的显著下降。

在risuteganib组的150μm RPE-BM(2.739％；P＝0.001)、50μm RPE-BM(-2.644％；P＝0.001)和0μm RPE-BM(1.282％；P＝0.037)中观察到在第32周时图覆盖自基线的显著差异，并且在假手术组的150μm RPE-BM(3.376％；P＝0.037)和50μm RPE-BM(-3.674％；P＝0.022)中观察到在第12周时图覆盖自基线的显著差异。

虽然这些测量是统计学上显著的，但这些变化的绝对值相当小，并且不清楚它们是否具有临床意义。其他解剖学测量均未显示出risuteganib组在第32周时自基线的显著差异，或者假手术组在第12周时自基线的显著差异。

在这项前瞻性、随机、双盲美国临床试验中，我们已经证明，与假手术相比，接受risuteganib 2次玻璃体内注射后，获得8个字母或更多的受试者的比例在统计学上显著更高。这是第一次有治疗药物显示出逆转干性AMD的视觉损失。支持性评估如微视野检查和色觉显示出与BCVA结果相印证的趋势，尽管它们在统计学上不是显著的。

单次注射risuteganib显示出温和的疗效，见于2个队列，即在第0周接受risuteganib的受试者和在第16周交叉且接受risuteganib的假手术组受试者。两次注射risuteganib显示出累加效应，BCVA进一步改善。

治疗后12周，药物的峰值效果明显，16周时治疗效果轻微下降。重复给药显示了前一剂量效应的累加效应，在12周达到峰值，并且在16周后治疗效果再次轻微下降。这些发现与2期DME研究中risuteganib观察到的12周峰值效果相似。

基线视网膜解剖学似乎是响应的重要预示物。在中央6mm没有GA的受试者和在中央凹有完整的外界膜的受试者，在2次risuteganib注射下，视觉始终显示出显著改善。因此，基线解剖学较差的受试者在超过2次risuteganib注射下是否会显示出改善尚不清楚。然而，这一受试者群体将在未来的临床研究中被研究。

该药物的耐受性良好，没有与药物相关的严重不良事件(SAE)。在一些受试者中观察到飞蚊症，恢复后没有后遗症。

抑制OIR小鼠视网膜中血管生成和炎性基因水平

目的：本研究使用RNA-seq来鉴定risuteganib玻璃体内注射后小鼠视网膜中受调控的基因。分析受risuteganib调控的特定基因使得能够鉴定受寡肽调控的生物过程和途径。这项研究的结果总结在图12A和12B中。这项研究表明，risuteganib的抗炎作用至少部分由整合素αMβ2的下调介导。Risuteganib导致白细胞粘附减少，白细胞跨内皮迁移减少，以及补体3受体的表达减少。

方法：OIR小鼠幼崽接受了5天的高氧(75％的氧气)，以使发育中的视网膜血管消失。在它们回到室内空气中后，由于氧气供应和需求的不平衡，视网膜新生血管开始发展。在回到室内空气时，OIR幼崽的两只眼睛都接受了媒介物注射或单次玻璃体内注射浓度为10μg/1μL的risuteganib溶液。一个单独的在室内空气下饲养的幼鼠组用作对照，并且接受与OIR小鼠组一致的媒介物或risuteganib溶液注射。注射后5天，在OIR小鼠的视网膜新生血管的高度，处死所有小鼠，提取视网膜组织进行RNA分离和RNA-seq。然后将生成的读数与小鼠参考基因组/转录组进行比对，并对基因表达进行量化，以进行差异表达分析和倍数变化计算。然后提交受调控的基因列表，以鉴定在OIR小鼠或对照小鼠中，与媒介物对照相比，risuteganib暴露后受调控的生物过程和途径，以及在OIR视网膜中与都接受媒介物注射的对照视网膜相比，受调控的生物过程和途径。

结果/讨论：Risuteganib暴露在统计学上显著地调控OIR视网膜中约600个基因，包括6个整合素亚基被下调：α5、α6、αM、β1、β2和β5。这些整合素参与了不同组的生物功能，包括OIR视网膜中缺血激活的血管生成和炎症期间的细胞通讯和粘附。特别地，整合素αM和β2亚基形成补体受体3蛋白，其在白细胞上表达，并在白细胞粘附、迁移和吞噬中发挥作用。此外，α5β1、α6β1和αvβ5整合素都涉及在血管生成期间调节细胞生长、存活和迁移。

当考虑整个受控基因列表时，risuteganib似乎在缓和血管生成和炎症相关途径中缺氧激活的基因表达方面有普遍的效果。在risuteganib下调的11条生物途径中，有10条被发现在OIR视网膜中上调。这些途径中有许多与血管生成和炎症有关，如PI3K-Akt信号传导通路和ECM-受体相互作用。此外，几个免疫相关途径被risuteganib抑制，包括补体和凝血级联以及白细胞跨内皮迁移途径。重要的是，当考虑特定的受控基因时，值得注意的是，许多在OIR视网膜中激活的相同基因被risuteganib抑制。总的来说，这种无偏见的转录组分析表明，risuteganib溶液注射能够缓和OIR视网膜中激活的许多基因和生物途径，其中缺血产生的血管生成和炎性病况类似于诸如DR和AMD的视网膜疾病。

结论：无偏见的转录组分析显示，risuteganib溶液注射缓和了缺氧激活的血管生成和炎症相关的基因表达。

原代小鼠Müller细胞的神经保护作用

目的：研究risuteganib在暴露于红藻氨酸的原代小鼠Müller细胞中的神经保护作用，红藻氨酸是一种激活谷氨酸受体的神经兴奋性化合物，导致过度刺激和细胞死亡。视网膜Müller细胞支持神经元的正常功能，并且其失调可导致内稳态的丧失和神经元细胞的死亡。本研究的结果总结于图

方法：从CD1小鼠收集新鲜的视网膜，然后用无菌巴斯德移液管机械解离成小的聚集体，并接种到35mm培养皿中。所有的培养物首先放置5-6天不动，然后每3-4天补充一次。当细胞生长达到约80％汇合度时，通过培养基清洗去除视网膜聚集体和碎片以形成纯化的细胞单层。然后将细胞暴露在以下实验条件下：(1)未处理的对照，(2)1.0mg/mLrisuteganib，(3)500μM红藻氨酸(KA)，和(4)在500μM红藻氨酸暴露前24小时1.0mg/mLrisuteganib。红藻氨酸处理后48小时，在血细胞计数器上用台盼蓝排斥测定测量死细胞和活细胞数量。

结果/讨论：Risuteganib单独处理并没有引起细胞活力的可检测变化。如图14所示，单独的红藻氨酸处理使Muller细胞活力下降32％，从而确定其对Müller细胞的毒性，但risuteganib预处理通过将Muller细胞活力的损失从32％降至10％显示出保护作用。

结论：单独risuteganib不改变细胞活力，而预处理则显示出对原代小鼠Müller细胞中基于红藻氨酸的细胞毒性的可测量的保护。

原代小鼠视网膜神经元细胞中的神经保护作用

目的：研究risuteganib在暴露于红藻氨酸的原代小鼠视网膜神经元细胞中的神经保护性质，红藻氨酸是一种激活谷氨酸受体的神经兴奋性化合物，导致过度刺激和细胞死亡。

方法：从CD1小鼠收集新鲜的视网膜，然后用无菌巴斯德移液管机械解离。然后将细胞悬液分配到陪替氏培养皿中并孵育6小时。然后将细胞暴露在以下实验条件下：(1)未处理的对照，(2)1.0mg/mL risuteganib，(3)500μM红藻氨酸(KA)，和(4)在500μM红藻氨酸暴露前24小时1.0mg/mL risuteganib。红藻氨酸处理后8小时，在血细胞计数器上用台盼蓝排斥测定测量死细胞和活细胞数量。

结果/讨论：如图15以图表显示的，Risuteganib(Luminate)单独处理并没有引起细胞活力的可检测的变化。然而，单独用红藻氨酸处理将细胞活力降低了42％，确定其对视网膜神经元细胞的毒性。Risuteganib预处理通过将细胞活力的损失从42％减少到18％显示了保护作用。

结论：单独risuteganib并不改变细胞活力，而预处理则对原代小鼠视网膜神经元细胞中基于红藻氨酸的细胞毒性显示出可测量的保护。

人类RPE细胞(ARPE-19)中的细胞保护作用

目的：研究risuteganib在暴露于过氧化氢的人类RPE细胞(ARPE-19)中的细胞保护性质，过氧化氢是一种在高水平时可诱发细胞死亡的活性氧。方法：将ARPE-19细胞在涂有层粘连蛋白的trans-well中培养2周以诱导分化。然后将细胞暴露在以下实验条件下：(1)未处理的对照，(2)1.0mg/mL risuteganib，(3)100μM过氧化氢(H₂O₂)，和(4)在100μMH₂O₂暴露前24小时1.0mg/mL risuteganib。H₂O₂处理后8小时，在血细胞计数器上用台盼蓝排斥测定测量死细胞和活细胞数量。

结果/讨论：如图16以图表显示的，risuteganib单独处理并没有引起细胞活力的可检测的变化，而H₂O₂处理则将细胞活力适度降低了22％。Risuteganib预处理通过将细胞活力的损失从22％减少到10％显示出保护作用。

结论：单独Risuteganib并不改变细胞活力，而预处理显示出对人类RPE细胞中基于H₂O₂的细胞毒性的可测量的保护。

Risuteganib和各种抗VEGF药物在人类(MIO M1)Müller细胞中的细胞保护作用

目的：确定risuteganib和抗VEGF药物对培养的人类视网膜Müller细胞(MIO-M1)的细胞活力的影响。

方法：永生化的人类视网膜Müller细胞系(MIO-M1)获自伦敦大学学院细胞生物学系。在0.5倍、1倍或2倍浓度的1mg/50μL risuteganib，或1倍的雷珠单抗、贝伐单抗或阿柏西普处理之前，将细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养，并在96孔板中铺板24小时。剂量基于每种化合物的临床剂量。实验重复3次，每次7-8个重复。药物处理24小时后，使用MTT NAD(P)H依赖性比色测定来评估培养物中存在的活细胞数。吸光度比值归一化至未经处理的对照(为100％)。统计分析在GraphPad Prism软件程序中进行。

结果/讨论：如图17以图表显示的，与未经处理的培养物相比，用0.5倍risuteganib处理的MIO-M1细胞显示出增加的细胞活力(111.3±2.189对100±0.29，p＝0.0058)。用1倍(113.5±13.5，p＝0.37)和2倍(100.3±7.8，p＝0.92)risuteganib处理的MIO-M1培养物显示出与未经处理的MIO-M1培养物类似的细胞活力水平。这与显示出用1倍浓度的雷珠单抗

贝伐单抗

和阿柏西普

处理的MIO-M1细胞的细胞活力下降的实验形成对比，如图18以图表所总结的。

结论：与未经处理的对照相比，risuteganib处理显著增加或不改变MIO-M1细胞活力，而抗VEGF药物则显著降低细胞活力。

Risuteganib和各种抗VEGF药物对人类(MIO-M1)Müller细胞中活性氧水平的影响

目的：确定risuteganib和抗VEGF药物对培养的人类视网膜Müller细胞(MIO-M1)中活性氧(ROS)水平的影响。ROS水平升高可破坏细胞的正常功能，导致细胞健康状况下降，并可能导致细胞死亡。

方法：永生化的人类视网膜Müller细胞系(MIO-M1)获自伦敦大学学院的细胞生物学系。在1倍浓度的1mg/50μL ALG-1001、雷珠单抗、贝伐单抗或阿柏西普处理之前，将细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养，并在24孔板中铺板24小时。剂量基于每种化合物的临床剂量。实验重复3次，每次6个重复。24小时药物处理后，使用荧光染料2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯测量ROS水平。使用Biotek Synergy HT读板仪读取信号，EX滤光片在482nm，并且EM滤光片在520nm。结果归一化至未经处理的对照(为100％)。统计分析在GraphPad Prism软件程序中进行。

结果/讨论：如图19以图表显示的，与未经处理的对照培养物相比，用1倍的risuteganib处理的MIO-M1细胞显示出统计学上显著降低的ROS水平(-19％，p＝0.016)。相比之下，1倍的抗VEGF药物使ROS水平显著增加了37％

24％

和29％

结论：与未经治疗的对照相比，risutiganib处理显著降低了MIO-M1 ROS水平，而抗VEGF药物显著增加了ROS水平。

Risuteganib和各种抗VRGF药物对人类(MIO-M1)Müller细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的影响

目的：确定risutiganib对培养的人类视网膜Müller细胞(MIO-M1)的线粒体膜电位(ΔΨm)的影响。ΔΨm的丧失是早期细胞死亡的标志物。

方法：永生化的人类视网膜Müller细胞系(MIO-M1)获自伦敦大学学院细胞生物学系。在1倍浓度的1mg/50μL risuteganib、雷珠单抗、贝伐单抗或阿柏西普处理之前，将细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养，并在24孔板中铺板24小时。剂量基于每种化合物的临床剂量。实验重复3次，每次6个重复。24小时药物处理后，使用JC-1试剂盒测量ΔΨm，JC-1试剂盒是一种在健康活细胞的线粒体内发出红色荧光的阳离子染料。在应激或凋亡的细胞中，线粒体膜电位暴跌，并且阳离子染料发出绿色荧光。首先，用新鲜培养基冲洗细胞，然后用JC-1试剂在37℃下孵育15分钟。然后去除染料，并在每个孔中加入磷酸盐缓冲盐水。红色荧光(活细胞)在EX 550nm和EM 600nm处读取。绿色荧光(凋亡细胞)在EX 483nm和EM 535nm处读取。ΔΨm的变化通过红绿荧光的比率计算。结果归一化至未经处理的对照(为100％)。统计分析在GraphPad Prism软件程序中进行。

结果/讨论：如图20以图表显示的，与未经处理的对照培养物相比，用1xrisuteganib(109.3±4.91，p＝0.038)处理的MIO-M1细胞显示线粒体膜电位升高。这与用1x阿柏西普(

p＝0.0093)处理的MIO-M1细胞的ΔΨm下降形成对比。与未经处理的对照培养物相比，测试的其他抗VEGF药物并没有引起线粒体膜电位的显著变化。线粒体膜电位的升高被认为与线粒体的细胞功能改善有关。

结论：与未经处理的对照相比，Risuteganib处理显著增加了MIO-M1线粒体膜电位，而

显著降低了线粒体膜电位。

原代人类RPE细胞中活性氧水平、线粒体膜电位和细胞活力的调节

目的：确定risuteganib是否保护培养的人类RPE细胞免受氢醌(HQ)介导的细胞损伤、ROS水平升高和线粒体膜电位(Δψm)降低。ROS水平的升高增加了细胞中的氧化应激，导致细胞健康状况下降和细胞死亡。ΔΨm的丧失是早期细胞死亡的标志。

方法：将原代人类RPE细胞分别以8K、10K和17K细胞/孔的速度接种在涂有胶原蛋白的96孔板上，一式三份。细胞在铺板后24小时达到80％至100％汇合度，然后汇合细胞再生长4或5天，直到密度抑制生长。在铺板后的第6天，在37℃下，用20μM CM-H2DCFDA(测量ROS水平)加载板上半部的细胞，并且用10μM JC-1(测量Δψm)加载下半部的细胞，持续30分钟。细胞用培养基洗涤两次，并且在有或没有0.4mM risuteganib的情况下用剂量在125-180uM之间的HQ处理3-4小时。对于ROS和Δψm测定，使用荧光读板仪分别对ROS产生(490-nm激发，522-nm发射)以及JC-1的绿色单体(490-nm激发，522-nm发射)和红色JC-1聚集体(535-nm激发，590-nm发射)进行量化。对于WST-1测定，处理后4小时或5小时，去除培养基，并将新鲜培养基加入细胞中，并在37℃下用WST-1溶液孵育20分钟。用读板仪在440nm和参考波长在690nm处对WST试剂进行量化。数据归一化至未经处理的对照(为100％)，并且以平均值±SD表示。使用学生t检验来确定处理组之间是否有统计学上的显著差异。

结果/讨论：本研究的结果以图表总结在图21A、21B和21C中。与未经处理的细胞相比，HQ暴露显著降低了Δψm(-53％)(图21A)和细胞活力(-82％)(图21C)，但增加了ROS水平(78％)(图21B)。Risuteganib联合处理显著改善了HQ减少的Δψm(改善16％)(图21A)和细胞活力(改善16％)(图21C)，同时抑制了HQ诱导的ROS产生(减少61％)(图21B)。在来自3个不同供体的RPE细胞中重复测定并观察到类似的结果。

结论：risuteganib缓和了氢醌诱导的ROS水平升高，Δψm减少，并防止氢醌介导的人类RPE细胞损伤。

预计具有与risuteganib相似效果的其他肽

本专利申请中提到的效果和作用机制不一定限于risuteganib。其他肽，包括上面并入的美国专利第9,018,352号；第9,872,886号；第9,896,480号和第10,307,460号以及美国专利申请公开第2018/0207227号和第2019/0062371号中描述的肽，可以合理地预期也表现出本文所述的效果和/或作用机制。被认为表现出部分或全部这些效果或机制的其他肽的具体实例包括，但不一定限于，包含由具有下式的氨基酸序列组成或包括具有下式的氨基酸序列的肽。

Y-X-Z

其中：

Y＝R,H,K,Cys(酸)、G或D；

X＝G、A、Cys(酸)、R G、D或E；和

Z＝Cys(酸)、G、C、R、D、N或E。

其中：

另外，此类肽可以包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成；R-G-Cys(酸)、R-R-Cys、R-Cys酸)-G、Cys(酸)-R-G、Cys(酸)-G-R、R-G-D、R-G-Cys(酸).H-G-Cys(酸)、R-G-N、D-G-R、R-D-G、R-A-E、K-G-D、R-G-Cys(酸)-G-G-G-D-G、环-{R-G-Cys(酸)-F-N-Me-V}、R-A-Cys(酸)、R-G-C、K-G-D、Cys(酸)-R-G、Cys(酸)-G-R、环-{R-G-D-D-F-NMe-V}、H-G-Cys(酸)及其盐。可能的盐包括但不限于乙酸盐、三氟乙酸盐(TFA)和盐酸盐。此类肽至少对抑制人类或动物受试者的病理或异常血管的发展的新生血管是有用的。此类肽的实例，以及它们各自在抑制小鼠视网膜新生血管方面的活性水平的指示，显示在上面并入的美国专利申请公开第2019/0062371号的表27中，该表复制如下：

表27

其他肽

其他可能可用的肽的其他实例包括，但不一定限于，在上面并入的美国专利第9,018,352号；第9,872,886号；第9,896,480号和第10,307,460号中与risuteganib(ALG-1001)一起描述的那些。这些包括包含甘氨酰-精氨酸-甘氨酰-磺基丙氨酸-苏氨酰-脯氨酸-COOH的肽，或具有下式的肽。

X1-Arg-Gly-磺基丙氨酸-X

其中X和X1独立地选自：Phe-Val-Ala、-Phe-Leu-Ala、-Phe-Val-Gly、-Phe-Leu-Gly、-Phe-Pro-Gly、-Phe-Pro-Ala、-Phe-Val；或选自或选自Arg、Gly、磺基丙氨酸、Phe、Val、Ala、Leu、Pro、Thr及其盐、组合、D-异构体和L-异构体

需要理解的是，尽管本专利申请包含了具体的研究实例，其中抗整合素肽通过玻璃体内注射施用，但需要理解的是，任何替代的有效施用途径包括但不限于局部和全身途径(例如滴眼剂、口服、静脉内、肌肉内、皮下、鼻内、颊、透皮等)或通过从合适的药物递送植入物质或装置中释放。此外，尽管上述内容包括参考某些实例或实施例，但在不背离本公开的预期精神和范围的情况下，可以对这些描述的实例和实施例进行各种补充、删除、改变和修改。例如，一个实施例或实例的任何元素、步骤、成员、组分、组合物、反应物、部件或部分可以并入另一个实施例或实例中或与之一起使用，除非另有规定或除非这样做会使该实施例或实例不适合其预定用途。另外，如果方法或过程的步骤以特定的顺序描述或列出，则此类步骤的顺序可以改变，除非另有规定或除非这样做会使该方法或过程不适合其预期目的。此外，除非另有说明，否则本文所述的任何发明或实例的元素、步骤、成员、组分、组合物、反应物、部件或部分可以在没有或基本没有任何其他元素、步骤、成员、组分、组合物、反应物、部件或部分的情况下任选存在或利用。所有合理的补充、删除、改变和修改都将被视为所描述的实例和实施例的等价物，并将被纳入以下权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于a)改善患有非渗出性年龄相关性黄斑变性的受试者的眼睛的最佳矫正视力和/或b)改善患有色觉受损的受试者的眼睛的色觉的方法，所述方法包括以有效改善所述眼睛的最佳矫正视力和/或色觉的量向所述受试者施用抗整合素肽的步骤。

2.抗整合素肽用于a)改善患有非渗出性年龄相关性黄斑变性的受试者的眼睛的最佳矫正视力和/或b)改善患有色觉受损的受试者的眼睛的色觉的用途。

3.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肽是线性或环状的，并包括甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-苏氨酰-脯氨酸-COOH或其片段、同系物、衍生物、药学上可接受的盐、水合物、异构体、多聚体、环状形式、线性形式、缀合物、衍生物或其他修饰形式。

4.根据权利要求3所述的方法或用途，其中所述肽包括risuteganib。

5.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肽具有下式：

X1-R-G-磺基丙氨酸-X

6.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肽具有下列一般式：

Y-X-Z

其中：

Y＝R、H、K、Cys(酸)、G或D；

X＝G、A、Cys(酸)、R、G、D或E；以及

Z＝Cys(酸)、G、C、R、D、N或E。

7.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肽包括选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：R-G-Cys(酸)、R-R-Cys、R-Cys酸)-G、Cys(酸)-R-G、Cys(酸)-G-R、R-G-D、R-G-Cys(酸).H-G-Cys(酸)、R-G-N、D-G-R、R-D-G、R-A-E、K-G-D、R-G–Cys(酸)-G-G-G-D-G、环-{R-G-Cys(酸)-F-N-Me-V}、R-A-Cys(酸)、R-G-C、K-G-D、Cys(酸)-R-G、Cys(酸)-G-R、环-{R-G-D-D-F-NMe-V}、H-G-Cys(酸)及其盐。

8.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肽玻璃体内施用。

9.根据权利要求8所述的方法或用途，其中所述肽包括risuteganib，并且其中玻璃体施用范围为0.01mg risuteganib至10.0mg risuteganib的剂量。

10.根据权利要求8所述的方法或用途，其中所述肽包括risuteganib，并且其中玻璃体施用范围为0.05mg risuteganib至5.0mg risuteganib的剂量。

11.根据权利要求8所述的方法或用途，其中所述肽包括risuteganib，并且其中玻璃体施用1mg至1.5mg risuteganib。

12.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肽仅施用一次。

13.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肽施用多次。

14.根据权利要求13所述的方法或用途，其中肽施用之间存在1周至20周的间隔。

15.根据权利要求13所述的方法或用途，其中肽施用之间存在12周至16周的间隔。

16.根据权利要求13所述的方法或用途，其中所述肽包括risuteganib，并且其中每次玻璃体内施用肽递送1mg至1.5mg risuteganib的剂量。

17.根据权利要求1的方法或根据权利要求2的用途，其中所述抗整合素肽导致整合素αMβ2的下调。

18.根据权利要求1的方法或根据权利要求2的用途，其中所述抗整合素肽减少补体3受体的表达。