CN114166788B - 牛奶中游离氨基酸总含量的中红外快速批量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于奶牛性能测定和牛奶品质检测领域，具体涉及牛奶中游离氨基酸总含量的中红外光谱快速批量检测方法。申请人在特征波段的选择时使用人工手动选择+多次遍历的方法，最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性，经过比较确认选用了同一个牛奶样本测定第一次的MIR进行建模效果更好，选取了总游离氨基酸模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性，实现了原料奶中总游离氨基酸含量的快速、准确、低成本的检测。

Description

牛奶中游离氨基酸总含量的中红外快速批量检测方法
技术领域
本发明属于奶牛性能测定和牛奶品质检测领域，具体涉及牛奶中游离氨基酸总含量的中红外光谱快速批量检测方法。
背景技术
牛奶是最古老的天然饮料之一，被誉为“白色血液”。牛奶具有较高的食用价值，能提供大量有益于动物体的营养物质，如氨基酸、乳糖、矿物质等。牛奶中游离氨基酸组成含量与人奶相似，富含人体内不能合成的8种必需氨基酸及3种支链氨基酸，是较为优质的乳蛋白资源。
根据氨基酸的存在形式，可将牛奶中的氨基酸分为水解氨基酸和游离氨基酸。游离氨基酸又称非蛋白氨基酸，是指没有成蛋白质或肽，在生物体中游离存在的氨基酸，生鲜牛奶中游离氨基酸含量约为130～170mg/L；水解氨基酸是指已组成蛋白质或肽的氨基酸，相关文献表明，牛奶中水解氨基酸含量高于游离氨基酸含量，由此说明牛奶中的氨基酸主要以蛋白质或肽的形式存在[1]。牛奶中游离氨基酸含量虽然较低，但种类丰富，本发明中使用的含量即为牛奶中34种游离氨基酸含量的总和，包括磷酸丝氨酸、牛磺酸、磷乙醇胺、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、α-氨基已二酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β- 丙氨酸、β-氨基异丁酸、γ-氨基丁酸、组氨酸、3-甲基组氨酸、1-甲基组氨酸、肌肽、色氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸。
牛奶中游离氨基酸含量是反映牛奶品质和新鲜程度的重要指标。游离氨基酸可被人体直接吸收利用，参与人体的新陈代谢、生长、免疫等过程，当牛奶中游离氨基酸的组成与含量越接近人体氨基酸所需比例时，其生物学价值越高，品质越好[2]，然而，过高游离氨基酸水平表明牛奶品质较差。有研究表明，牛奶在贮存过程中产生的腐败气味可能是由牛奶中游离氨基酸在脱羧酶作用下生成生物胺所致，因此游离氨基酸含量也可作为衡量牛奶新鲜度的重要指标[3]。
关于牛奶游离氨基酸总含量的测定方法目前暂无国家标准，常用的方法有氨基酸自动分析仪分析法[4-6]、高效液相色谱法[7-8]、紫外分光光度法[9]等，但此类方法均存在成本高、耗时长及效率低等问题，因此很难在生产实践中快速批量化使用。中红外光谱由分子中基团原子振动跃迁时吸收红外光产生，中红外光谱技术可最大限度地获取物质的成份、结构及其他相关信息，将样品光谱数据与待测样品组份测量值之间建立数学关系，从而对待测样品组份含量进行预测[10]。中红外光谱技术作为一种高新分析技术，具有方便快捷、无污染、无破坏性、无前处理等优势，能准确反映牛奶的整体化学信息，提供待测物质的指纹图谱，是畜牧业检测领域研究的重要手段，目前已被广泛应用于畜产品的化学成份含量检测和质量评估。
我国现已通过中红外光谱技术对牛奶中蛋白总含量和脂肪总含量等指标进行检测，然而国内外都没有精度较高的游离氨基酸总含量的快速批量检测模型，但无适合于中国奶牛的牛奶游离氨基酸总含量的检测方法，实现牛奶中游离氨基酸总含量的快速、准确和无创测定，一方面用于高效监测和预警原料奶的品质安全，使乳及乳制品市场更加规范，使人民身体健康和生命安全得到保证；另一方面用于快速高效检测牛奶中游离氨基酸总含量，为特色奶牛的选育和生产提供表型数据。本发明的目的即建立牛奶中游离氨基酸总含量的快速检测技术，为中国奶牛业朝着健康高效、乳品业朝着营养鲜活的方向发展提供技术保障。
发明内容
本发明的目的在于提供了牛奶中总游离氨基酸的中红外光谱的快速批量检测方法，方法简单，快速，与真实值相比，准确率高。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
牛奶中总游离氨基酸的中红外光谱的快速批量检测方法，包括下述步骤：
1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：968.36cm-1-1157.40cm-1、1203.70cm-1-1577.92cm-1、1685.95cm-1-1952.15cm-1、2256.93cm-1-2341.81cm-1、2376.53 cm-1-3067.11cm-1与3634.24cm-1-3977.60cm-1中的MIR数据；
2.将测定所得到的MIR数据代入none+PLSR(n_component＝24)模型中，输出总游离氨基酸含量的预测结果。
以上所述的方法中，优选的，步骤1中每一段波段前后允许有两个波点的差距。
本发明的保护内容还包括：上述检测方法用于检测牛奶中总游离氨基酸的含量。
与现有技术相比，本发明优点在于：
1.在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择+多次遍历的方法。最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性。
2.经过比较确认选用了同一个牛奶样本测定第一次的MIR进行建模效果更好，提供了参考依据。
3.选取了总游离氨基酸模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性。
4.实现了原料奶中总游离氨基酸含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测，每一个样本的测定时间仅需10-15秒，提高了检测效率，具有较强的实用性，将可广泛应用于奶牛性能测定和牛奶质量品质检测。
附图说明
图1为未经处理的牛奶样品中红外光谱图(a)与平均光谱图(b)。
图2为选取的六个特征波段光谱总图(a)以及每个特征波段放大图(b)。
图3为模型牛奶数据真实值与预测值相关性与拟合直线图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
1.实验材料
试验材料来源于中国四个地区9个奶牛场的187头中国荷斯坦牛，每头牛采集一份奶样，奶样采集利用自动挤奶装置完成，先用消毒后的毛巾擦拭牛奶房，然后用碘甘油混合溶液对乳房消毒，挤掉前三把乳汁后，对挤奶全过程奶样进行采集，每份奶样采集40ml，分装到直径3.5cm，高9cm的圆柱形全新采样瓶里，依次编号，并向每个采样瓶里立即加入溴硝丙二醇防腐剂，缓慢摇晃使其充分溶解，运回途中在奶样周围放置冰袋(2-4℃)防止变质，样本到达实验室后立即进行光谱采集。所有牛奶样品均采集了两次光谱数据。
样本信息统计表
2.中红外光谱测定与采集
将样品倒入直径3.5cm，高9cm的圆柱形样品管中，在42℃水浴锅中水浴15-20min，使用FOSS公司的MilkoScanTM7RM乳成分检测仪，将固体光纤探头伸到液体中，对样品进行混匀后扫描。
3.牛奶游离氨基酸总含量的真实(参考)值检测方法
3.1仪器、设备和试剂
全自动氨基酸分析仪(德国Sykam S433D)；游离氨基酸分析柱(LCA K07/Li，4.6mm×150mm)；游离氨基酸分析除氨柱；针管过滤器；0.45μm尼龙滤膜；涡漩振荡器；离心机；进样瓶。
氨基酸标准溶液(34AA，PH游离，货号AA-S000031)；茚三酮(N105629-500g，阿拉丁)；缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、再生液D均购买于德国Sykam公司；LiOH×H2O；柠檬酸×H2O；HC1(浓度为37％)；辛酸；磺基水杨酸；其他试剂均为国产分析纯。
缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、再生液D、样品稀释液的配置
注：
(1)所有溶液均应用0.45μm膜过滤后使用；
(2)“*pH”表示可用此成份调解pH值；
(3)EDTA用于络合重金属，不加不影响试剂使用；
(4)辛酸是抑菌剂，延长试剂存放期，不加也不影响使用。
3.2实验方法
3.2.1中红外光谱的采集
利用MilkoScanTM FT+进行光谱采集，具体采集步骤为：将奶样分批放入45℃电热恒温水浴锅内预热5min，预热好的奶样放在检测架上上下摇晃数次使牛奶胶状溶液混合均匀，将检测架放在检测履带上，打开瓶盖，依次进行检测，采集完光谱后的奶样置于-20℃冷冻保存，用于后续牛奶中游离氨基酸总含量的测定。
3.2.2牛奶中游离氨基酸总含量的测定
(1)100nmol/mL标准液配制
取100μL标准液(Sykam公司原装PH型氨基酸标准溶液，其中除尿素浓度为10μmol/mL 其他氨基酸浓度为1μmol/mL)加900μL样品稀释液，涡旋混匀。上机前用0.45μm尼龙滤膜过滤。
(2)奶样的处理
吸取约8ml奶样于离心管中，3000rpm离心5min(达到分离固态物的目的即可)，若奶样中悬浮物不至于干扰取样均匀性，则此步骤可跳过；
离心后准确吸取上清液1ml于另外的离心试管中，加入2％磺基水杨酸9ml，混匀静置 15min；
设置离心机转速为3000rpm离心20min或10000rpm离心10min，离心后取上清液；
上机前用0.45μm尼龙滤膜过滤。
(3)色谱条件
色谱柱：LCA K07/Li
流速：洗脱泵0.45ml/min+衍生泵0.25ml/min
检测波长：570nm+440nm
反应器温度：38～74℃梯度升温
柱温程序
流动相梯度洗脱条件
平均每批次检测20个样品，一批次只需进样一次标准液，若中途更换试剂(流动相、茚三酮等)，则标准液需重新进样。
4.有效样本的选择
187个样本中，剔除掉样本变质、损耗、中红外光谱测定异常、样本参考值测定异常等操作导致的无效数据，共剔除掉了12个异常样本，选择了175个样本进行模型的建立与优化。
实施例1：
总游离氨基酸的预测模型算法的选择：
本申请目的为建立总游离氨基酸的定量预测模型，所以使用建模算法为回归算法。回归算法种类很多，本实施例主要使用了岭回归(Ridge)与偏最小二乘回归(PLSR)算法进行模型建立与对比，理由如下：
岭回归(Ridge算法)是线性回归的一种。只是在算法建立回归方程时候，岭回归加入了正则化的限制，从而达到解决过拟合的效果。正则化有两种，分别为l1正则化l2正则化， l2正则化相比于l1正则化的优势在于：(1)可以进行交叉验证(2)实现了随机梯度下降。岭回归就是加入了l2正则化后的线性回归模型，保留了线性回归的优点，符合模型建立的要求，而且结果较为稳定，是较常使用的基础算法之一，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
偏最小二乘回归算法(PLSR算法)是多特征样本中非常有效的算法之一。中红外光谱数据中，每一个样本对应1060个波点，是多特征样本的代表。同时偏最小二乘回归算法很少出现过拟合情况，所以很多中红外光谱的研究者们会选择使用偏最小二乘回归算法进行模型的建立，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
实施例2：
中红外光谱测定次数及其使用方式的筛选：
本申请使用的所有样本均进行了连续两次的光谱采集，目的是通过比较同一样本不同测定次数和所得到三种MIR数据(第一次、第二次、二次平均)对建模准确性的影响，筛选出最有效的MIR数据进行建模。因有研究者认为两次测定的平均光谱MIR可能提升建模准确性，所以本实施例将第一次、第二次、二次平均光谱MIR去掉水波段以及大于4000cm-1部分进行建模，比较分析模型的准确度，结果如下表：
Ridge算法比较结果:
PLSR算法比较结果：
经过两种算法比较结果综合考虑，最终选择第一次光谱MIR进行建模。
实施例3：
中红外光谱检测牛奶中总游离氨基酸含量的方法的建立：
1.建模数据集的划分
本实施例中的建模数据集划分中，75％为训练集，25％为测试集。训练集与测试集的比例为3：1，同时训练集又叫做交叉验证集，在训练模型的过程中进行10折交叉验证。
2.建模MIR数据预处理方法的筛选
有效特征筛选是对光谱数据进行处理的基本操作，目的是为了消噪，并为提取特征打好基础。有效特征筛选主要有特征抽取、特征预处理与特征降维三种。本实施例主要对光谱数据进行特征预处理，首先，采用SG(卷积平滑)、MSC(多元散射校正)、SNV(标准正态变量变换)、diff1(一阶差分)和diff2(二阶差分)等五种处理方法对光谱数据进行特征预处理，
3.建模特征波段的手动选择过程及确定
选取特征波段的方法有很多，主要包括算法选取特征与手动选取特征两种，算法选取特征的原理主要来源于各波点与参考值之间的相关性，优点在于速度快、效率高，但缺点在于忽略了相邻波点之间的协同作用，思路较为单一。手动选取特征的优点在于选择的过程中可以强化波段(即相邻波点)的作用，同时可以在提升模型的过程中更多得保留光谱的原始信息状态，包容性与泛化能力更强，选取波段准确，缺点在于选择速度慢，效率低。
本实施例选取特征波段采用手动选取的方法，选取步骤如下：
(1)确定基本算法，由实施例2可知偏最小二乘回归算法的效果整体偏高，所以最终选择偏最小二乘回归算法作为总游离氨基酸预测算法。
(2)确定最佳预处理。将样本去掉水波段以及大于4000cm-1部分进行实施例3中的预处理并进行比较，由结果确定最佳预处理为：无预处理，结果如表所示：
在确定MIR数据是无预处理的基础上，建模特征波段的手动选择过程如下：
(1)去掉1593.35cm-1-1709.1cm-1与3059.39cm-1-3641.95cm-1两段与水吸收相关的光谱区域，根据预实验，发现，保留部分水吸收相关的光谱区域可提升模型的准确度，因此，在预实验之后的此步骤中，并未完全去掉水吸收相关的光谱区域；
(2)去掉4000cm-1-5011.54cm-1两段光谱区域，因为此区域为非中红外吸收区域。
(3)将剩下的区域分为八段，小于1593.35cm-1的区域平均分为两段，大于3641.95cm-1为最后一段，1709.1cm-1与3059.39cm-1中间的波段平均分为五段。
(4)以50个波点为一组，使用偏最小二乘回归算法，首先将第一段波段临界处两端波点增加或减少一组波点，寻找最优效果，并以此为基础对第二段波段进行类似操作，最终将八个波段全部完成一轮操作后算第一次遍历完成。
(5)在第一次遍历完成后进行第二次、第三次或更多次的手动遍历，直到所有的波点不再变化为止，即为最优特征波段。
最终经过十一轮筛选，得到最优结果，如表所示：
最终选取的特征波段结果为：968.36cm-1-1157.40cm-1、1203.70cm-1-1577.92cm-1、1685.95cm-1-1952.15cm-1、2256.93cm-1-2341.81cm-1、2376.53cm-1-3067.11cm-1与3634.24cm-1-3977.60cm-1，每一段前后允许有两个波点的差距(图2)。
结果发现模型中添加少量第二段水吸收区域后，模型可以达到最优效果，说明总必需氨基酸的特征波段包含少量第二段水吸收区域。
4.模型参数的筛选确定
模型参数包括预处理方法的参数以及算法的参数；
因该模型未使用预处理，所以只需要进行算法参数的选择，偏最小二乘回归算法的参数：主成分(n_component)，参数选择结果对比如下：
根据对比结果，最终选择主成分(n_component)为24。
经过对比分析，总游离氨基酸的最佳回归模型为：none+PLSR(n_component＝24)模型。训练集和测试集相关系数分别为0.8267和0.8240；训练集和测试集均方根误差分别为 188.7324和175.6786。
实施例4：
牛奶中总游离氨基酸的中红外光谱MIR的快速批量检测方法的应用：
利用建立的总游离氨基酸最佳回归模型none+PLSR(n_component＝24)对随机选取的4个牛奶样本(非176份实验材料之一)进行预测，并将预测结果与真实值比较。
模型使用方法：
1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：968.36cm-1-1157.40cm-1、1203.70cm-1-1577.92cm-1、1685.95cm-1-1952.15cm-1、2256.93cm-1-2341.81cm-1、2376.53 cm-1-3067.11cm-1与3634.24cm-1-3977.60cm-1中的MIR数据；
同时利用全自动氨基酸分析仪检测同批次牛奶中的总游离氨基酸真实值。
2、将测定所得到的MIR数据代入实施例3构建的none+PLSR(n_component＝24)模型中，即可输出总游离氨基酸含量的预测结果。
该模型预测的结果与真实结果接近(如下表，图3)，故该模型的准确性较高，可用于牛奶的总游离氨基酸含量预测。
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Claims (3)

1.牛奶中总游离氨基酸的中红外光谱的快速批量检测方法，包括下述步骤：
1）. 采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：968.36 cm-1-1157.40 cm-1 、1203.70cm-1-1577.92 cm-1 、1685.95 cm-1-1952.15 cm-1 、2256.93 cm-1-2341.81 cm-1 、2376.53cm-1-3067.11 cm-1 与3634.24 cm-1-3977.60 cm-1中的MIR数据；
2）. 将测定所得到的MIR数据代入none+偏最小二乘回归PLSR模型中，输出总游离氨基酸含量的预测结果；其中，所述none指的是无预处理；偏最小二乘回归PLSR的主成分为24；所述总游离氨基酸为牛奶中34种游离氨基酸含量的总和，包括磷酸丝氨酸、牛磺酸、磷乙醇胺、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、α-氨基己二酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、β-氨基异丁酸、γ-氨基丁酸、组氨酸、3-甲基组氨酸、1-甲基组氨酸、肌肽、色氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中每一段波段前后允许有两个波点的差距。
3.权利要求1所述方法在检测牛奶中总游离氨基酸的含量中的应用。
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