CN114166789B - 牛奶中游离必需氨基酸总含量的中红外快速批量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于奶牛性能测定和牛奶品质检测领域，具体涉及牛奶中游离必需氨基酸总含量的中红外光谱快速批量检测方法。申请人在特征波段的选择时使用人工手动选择+多次遍历的方法，最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性，经过比较确认选用了同一个牛奶样本测定第一次的MIR进行建模效果更好，选取了游离必需氨基酸含量模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性，实现了原料奶中游离必需氨基酸总含量的快速、准确、低成本的检测。

Description

牛奶中游离必需氨基酸总含量的中红外快速批量检测方法

技术领域

本发明属于奶牛性能测定和牛奶品质检测领域，具体涉及牛奶游离氨基酸中必需氨基酸总含量的中红外光谱快速批量检测方法。

背景技术

随着我国国民生活水平的提高，人们对奶及奶制品的供应发生由量到质的转变，其中牛奶以其丰富的营养价值和低廉的价格愈发受到青睐，在人类膳食中占有较大比例。氨基酸是牛奶中的重要组份，可帮助人体维持和调节正常的生命状态，尤其是牛奶中的必需氨基酸，如色氨酸、缬氨酸、赖氨酸等，对人体营养和生命活动有重要影响。

必需氨基酸是指人体自身不能合成或合成量不能满足生长发育所需要的、须从外界摄取的氨基酸，成年人共有8种必需氨基酸，包括甲硫氨酸(Methionine,Met)、色氨酸(Tryptophane,Trp)、缬氨酸(Valine,Val)、赖氨酸(Lysine,Lys)、异亮氨酸(Isoleucine,Ile)、亮氨酸(Leucine,Leu)、苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)和苏氨酸(Threonine,Thr)，儿童共有 9种必需氨基酸，除上述氨基酸外还包括组氨酸(Histidine,His)，早产儿必需氨基酸还包括酪氨酸(Tyrosine,Tyr)、精氨酸(Arginine,Arg)、胱氨酸(Cystine,Cys)和牛磺酸(Taurine, Tau)^[1]。若蛋白质中包含了所有必需氨基酸，则称为全蛋白，牛奶中的蛋白质便是全蛋白^[2]，且品质较好，生物学价值较高。必需氨基酸在牛奶水解氨基酸和游离氨基酸中均存在，本发明中使用的必需氨基酸总含量即为游离氨基酸中8种必需氨基酸含量的总和。

必需氨基酸在人体生命活动中除参与蛋白质的合成、调节代谢过程外，还承担多种特殊的生物学功能，如提高机体免疫力^[3-5]、促进矿物质的吸收^[6]、缓解焦虑情绪^[7-9]，抗氧化^[10]等，尤其是三种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，在人类生命代谢中占有特别重要的地位。三种支链氨基酸协同作用，共同发挥调节免疫力、修复肌肉组织、控制血糖、供能、提高人类生长激素产量^[11]等功能。

目前暂无用于测定牛奶游离氨基酸中必需氨基酸总含量的国家标准技术技术，主要是将氨基酸自动分析仪分析法^[12-14]和高效液相色谱法^[15-16]作为牛奶中游离氨基酸检测的常规方法，但此类技术存在成本高、耗时长及效率低等问题，不能用于奶牛生产性能的大规模测定。中红外光谱MIR(Mid-Infrared Spectroscopy)技术是基于不同物质在中红外光谱区中的吸收特征不同，以此形成红外光谱信息，继而对红外光谱检测物质进行定量或定性分析的一种现代分析方法，与常规方法相比，中红外光谱分析技术作为一种绿色分析技术，具有分析速度快、操作简单、不需要样本预处理、可实现原位、无损、在线分析等优点，可用于奶牛性能的规模化测定。目前我国已实现基于MIR对牛奶中蛋白总含量和脂肪总含量等指标进行预测，成功地用于奶牛的常规奶品质性能的测定。

然而，目前国内外还没有开展基于MIR预测牛奶必需氨基酸总含量检测技术的研究，故需要建立适合中国奶牛的牛奶游离氨基酸中必需氨基酸总含量的快速批量检测方法，为奶牛遗传改良提供大量表型数据，助推奶牛养殖成本降低和提质增效。本发明的目的即建立牛奶游离氨基酸中必需氨基酸总含量的快速批量检测技术，为奶牛性能测定和牛奶品质快速检测、为促进和提高我国奶牛生物育种(遗传评定、全基因组遗传分析与全基因组选择、遗传改良等)效率和奶业持续高效发展提供技术保障。

发明内容

本发明的目的在于提供了牛奶中游离必需氨基酸总含量的中红外快速批量检测方法，方法简单，快速，与真实值相比，准确率高。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

牛奶中游离必需氨基酸总含量的中红外快速批量检测方法，包括下述步骤：

1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：1277.00cm^-1-1462.18cm^-1、1485.33cm^-1- 1589.49cm^-1、1836.41cm^-1-2445.92cm^-1、2573.29cm^-1-2793.19cm^-1、2808.62cm^-1-3067.11 cm^-1与3626.52cm^-1-3981.47cm^-1中的MIR数据；

2.将测定所得到的MIR数据代入none+PLSR(n_component＝24)模型中，输出总游离氨基酸含量的预测结果。

以上所述的方法中，优选的，步骤1中每一段波段前后允许有两个波点的差距。

本发明的保护内容还包括：上述检测方法用于检测牛奶中游离必需氨基酸的含量。

与现有技术相比，本发明优点在于：

1.在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择+多次遍历的方法。最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性。

2.经过比较确认选用了同一个牛奶样本测定第一次的MIR进行建模效果更好，提供了参考依据。

3.选取了总必需氨基酸模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性。

4.实现了原料奶中总必需氨基酸含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测，每一个样本的测定时间仅需10-15秒，提高了检测效率，具有较强的实用性，将可广泛应用于奶牛性能测定和牛奶质量品质检测。

附图说明

图1为未经处理的牛奶样品中红外光谱图(a)与平均光谱图(b)。

图2为选取的六个特征波段光谱总图(a)以及每个特征波段放大图(b)。

图3为模型牛奶数据真实值与预测值相关性与拟合直线图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

1.实验材料

试验材料来源于中国四个地区9个奶牛场的187头中国荷斯坦牛，每头牛采集一份奶样，奶样采集利用自动挤奶装置完成，先用消毒后的毛巾擦拭牛奶房，然后用碘甘油混合溶液对乳房消毒，挤掉前三把乳汁后，对挤奶全过程奶样进行采集，每份奶样采集40ml，分装到直径3.5cm，高9cm的圆柱形全新采样瓶里，依次编号，并向每个采样瓶里立即加入溴硝丙二醇防腐剂，缓慢摇晃使其充分溶解，运回途中在奶样周围放置冰袋(2-4℃)防止变质，样本到达实验室后立即进行光谱采集。所有牛奶样品均采集了两次光谱数据。

样本信息统计表

2.中红外光谱测定与采集

将样品倒入直径3.5cm，高9cm的圆柱形样品管中，在42℃水浴锅中水浴15-20min，使用FOSS公司的MilkoScan^TM7RM乳成分检测仪，将固体光纤探头伸到液体中，对样品进行混匀后扫描。

3.牛奶游离氨基酸中必需氨基酸总含量的真实(参考)值检测方法

3.1仪器、设备和试剂

全自动氨基酸分析仪(德国Sykam S433D)；游离氨基酸分析柱(LCA K07/Li，4.6mm×150mm)；游离氨基酸分析除氨柱；针管过滤器；0.45μm尼龙滤膜；涡漩振荡器；离心机；进样瓶。

氨基酸标准溶液(34AA，PH游离，货号AA-S000031)；茚三酮(N105629-500g，阿拉丁)；缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、再生液D均购买于德国Sykam公司；LiOH× H₂O；柠檬酸×H₂O；HC1(浓度为37％)；辛酸；磺基水杨酸；其他试剂均为国产分析纯。

缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、再生液D、样品稀释液的配置

注：

(1)所有溶液均应用0.45μm膜过滤后使用；

(2)“*pH”表示可用此成份调解pH值；

(3)EDTA用于络合重金属，不加不影响试剂使用；

(4)辛酸是抑菌剂，延长试剂存放期，不加也不影响使用。

3.2实验方法

3.2.1中红外光谱的采集

利用MilkoScanTM FT+进行光谱采集，具体采集步骤为：将奶样分批放入45℃电热恒温水浴锅内预热5min，预热好的奶样放在检测架上上下摇晃数次使牛奶胶状溶液混合均匀，将检测架放在检测履带上，打开瓶盖，依次进行检测，采集完光谱后的奶样置于-20℃冷冻保存，用于后续牛奶游离氨基酸中必需氨基酸总含量的测定。

3.2.2牛奶游离氨基酸中必需氨基酸总含量的测定

(1)100nmol/mL标准液配制

取100μL标准液(Sykam公司原装PH型氨基酸标准溶液，其中除尿素浓度为 10μmol/mL其他氨基酸浓度为1μmol/mL)加900μL样品稀释液，涡旋混匀。上机前用 0.45μm尼龙滤膜过滤。

(2)奶样的处理

吸取约8ml奶样于离心管中，3000rpm离心5min(达到分离固态物的目的即可)，若奶样中悬浮物不至于干扰取样均匀性，则此步骤可跳过；

离心后准确吸取上清液1ml于另外的离心试管中，加入2％磺基水杨酸9ml，混匀静置 15min；

设置离心机转速为3000rpm离心20min或10000rpm离心10min，离心后取上清液；

上机前用0.45μm尼龙滤膜过滤。

(3)色谱条件

色谱柱：LCA K07/Li

流速：洗脱泵0.45ml/min+衍生泵0.25ml/min

检测波长：570nm+440nm

反应器温度：38～74℃梯度升温

柱温程序

流动相梯度洗脱条件

平均每批次检测20个样品，一批次只需进样一次标准液，若中途更换试剂(流动相、茚三酮等)，则标准液需重新进样。

4.有效样本的选择

187个样本中，剔除掉样本变质、损耗、中红外光谱测定异常、样本参考值测定异常等操作导致的无效数据，共剔除掉了11个异常样本，选择了176个样本进行模型的建立与优化。

实施例1：

总必需氨基酸的预测模型算法的选择：

本申请目的为建立总必需氨基酸的定量预测模型，所以使用建模算法为回归算法。回归算法种类很多，本实施例主要使用了岭回归(Ridge)与偏最小二乘回归(PLSR)^[9]算法进行模型建立与对比，理由如下：

岭回归(Ridge算法)是线性回归的一种。只是在算法建立回归方程时候，岭回归加入了正则化的限制，从而达到解决过拟合的效果。正则化有两种，分别为l1正则化l2正则化，l2正则化相比于l1正则化的优势在于：(1)可以进行交叉验证(2)实现了随机梯度下降。岭回归就是加入了l2正则化后的线性回归模型，保留了线性回归的优点，符合模型建立的要求，而且结果较为稳定，是较常使用的基础算法之一，因此本实施例选择了此算法为待选算法。

偏最小二乘回归算法(PLSR算法)是多特征样本中非常有效的算法之一。中红外光谱数据中，每一个样本对应1060个波点，是多特征样本的代表。同时偏最小二乘回归算法很少出现过拟合情况，所以很多中红外光谱的研究者们会选择使用偏最小二乘回归算法进行模型的建立，因此本实施例选择了此算法为待选算法。

实施例2：

中红外光谱测定次数及其使用方式的筛选：

本申请使用的所有样本均进行了连续两次的光谱采集，目的是通过比较同一样本不同测定次数和所得到三种MIR数据(第一次、第二次、二次平均)对建模准确性的影响，筛选出最有效的MIR数据进行建模。因有研究者认为两次测定的平均光谱MIR可能提升建模准确性，所以本实施例将第一次、第二次、二次平均光谱MIR去掉水波段以及大于 4000cm^-1部分进行建模，比较分析模型的准确度，结果如下表：

Ridge算法比较结果:

PLSR算法比较结果：

经过两种算法比较结果综合考虑，最终选择第一次光谱MIR进行建模。

实施例3：

中红外光谱检测牛奶中牛磺酸含量的方法的建立：

1.建模数据集的划分

本实施例中的建模数据集划分中，75％为训练集，25％为测试集。训练集与测试集的比例为3：1，同时训练集又叫做交叉验证集，在训练模型的过程中进行10折交叉验证。

2.建模MIR数据预处理方法的筛选

有效特征筛选是对光谱数据进行处理的基本操作，目的是为了消噪，并为提取特征打好基础。有效特征筛选主要有特征抽取、特征预处理与特征降维三种。本实施例主要对光谱数据进行特征预处理，首先，采用SG(卷积平滑)、MSC(多元散射校正)、SNV (标准正态变量变换)、diff1(一阶差分)和diff2(二阶差分)等五种处理方法对光谱数据进行特征预处理，

3.建模特征波段的手动选择过程及确定

选取特征波段的方法有很多，主要包括算法选取特征与手动选取特征两种，算法选取特征的原理主要来源于各波点与参考值之间的相关性，优点在于速度快、效率高，但缺点在于忽略了相邻波点之间的协同作用，思路较为单一。手动选取特征的优点在于选择的过程中可以强化波段(即相邻波点)的作用，同时可以在提升模型的过程中更多得保留光谱的原始信息状态，包容性与泛化能力更强，选取波段准确，缺点在于选择速度慢，效率低。

本实施例选取特征波段采用手动选取的方法，选取步骤如下：

(1)确定基本算法，由实施例2可知偏最小二乘回归算法的效果整体偏高，所以最终选择偏最小二乘回归算法作为总必需氨基酸预测算法。

(2)确定最佳预处理。将样本去掉水波段以及大于4000cm^-1部分进行实施例3中的预处理并进行比较，由结果确定最佳预处理为：无预处理，结果如表所示：

在确定MIR数据是无预处理的基础上，建模特征波段的手动选择过程如下：

(1)去掉1593.35cm^-1-1709.1cm^-1与3059.39cm^-1-3641.95cm^-1两段与水吸收相关的光谱区域，根据预实验，发现，保留部分水吸收相关的光谱区域可提升模型的准确度，因此，在预实验之后的此步骤中，并未完全去掉水吸收相关的光谱区域；

(2)去掉4000cm^-1-5011.54cm^-1两段光谱区域，因为此区域为非中红外吸收区域。

(3)将剩下的区域分为六段，小于1593.35cm^-1的区域平均为第两段，大于3641.95cm^-1为最后一段，1709.1cm^-1与3059.39cm^-1中间的波段平均分为五段。

(4)以50个波点为一组，使用偏最小二乘回归算法，首先将第一段波段临界处两端波点增加或减少一组波点，寻找最优效果，并以此为基础对第二段波段进行类似操作，最终将八个波段全部完成一轮操作后算第一次遍历完成。

(5)在第一次遍历完成后进行第二次、第三次或更多次的手动遍历，直到所有的波点不再变化为止，即为最优特征波段。

最终经过十二轮筛选，得到最优结果，如表所示：

最终选取的特征波段结果为：1277.00cm^-1-1462.18cm^-1、1485.33cm^-1-1589.49cm^-1、 1836.41cm^-1-2445.92cm^-1、2573.29cm^-1-2793.19cm^-1、2808.62cm^-1-3067.11cm^-1与3626.52 cm^-1-3981.47cm^-1，每一段前后允许有两个波点的差距(图2)。

结果发现模型中添加少量第二段水吸收区域后，模型可以达到最优效果，说明总必需氨基酸的特征波段包含少量第二段水吸收区域。

4.模型参数的筛选确定

模型参数包括预处理方法的参数以及算法的参数；

因该模型未使用预处理，所以只需要进行算法参数的选择，偏最小二乘回归算法的参数：主成分(n_component)，参数选择结果对比如下：

根据对比结果，最终选择主成分(n_component)为24。

经过对比分析，总必需氨基酸的最佳回归模型为：none+PLSR(n_component＝24)模型。训练集和测试集相关系数分别为0.8301和0.8488；训练集和测试集均方根误差分别为 53.6257和51.9043。

实施例4

牛奶中总必需氨基酸的中红外光谱MIR的快速批量检测方法的应用：

利用建立的总必需氨基酸最佳回归模型none+PLSR(n_component＝24)对随机选取的4个牛奶样本(非176份实验材料之一)进行预测，并将预测结果与真实值比较。

模型使用方法：

1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：1277.00cm^-1-1462.18cm^-1、1485.33cm^-1-1589.49cm^-1、1836.41cm^-1-2445.92cm^-1、2573.29cm^-1-2793.19cm^-1、2808.62cm^-1-3067.11 cm^-1与3626.52cm^-1-3981.47cm^-1中的MIR数据；

同时利用全自动氨基酸分析仪检测同批次牛奶中的总必需氨基酸真实值。

2、将测定所得到的MIR数据代入实施例3构建的none+PLSR(n_component＝24)模型中，即可输出总必需氨基酸含量的预测结果。

该模型预测的结果与真实结果接近(如下表，图3)，故该模型的准确性较高，可用于牛奶的总必需氨基酸含量预测。

样本标号	实际值(nmol/ml)	预测值(nmol/ml)
			1	61.66	77.92
2	47.28	35.38
			3	226.77	233.72
4	120.06	145.06

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Claims (3)

1.牛奶中游离必需氨基酸总含量的中红外快速批量检测方法，包括下述步骤：

1）. 采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：1277.00 cm^-1-1462.18 cm^-1 、1485.33cm^-1-1589.49 cm^-1 、1836.41 cm^-1-2445.92 cm^-1 、2573.29 cm^-1-2793.19 cm^-1 、2808.62cm^-1-3067.11 cm^-1 与3626.52 cm^-1-3981.47 cm^-1中的MIR数据；

2）. 将测定所得到的MIR数据代入none+PLSR(n_component=24)模型中，输出游离必需氨基酸总含量的预测结果；

所述的none指的是该模型未使用预处理；

所述的游离必需氨基酸为：甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中每一段波段前后允许有两个波点的差距。

3.权利要求1所述方法在检测牛奶中游离必需氨基酸总含量中的应用。

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