CN116067908A - 牛奶中多不饱和脂肪酸的中红外快速批量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于奶牛性能测定和牛奶品质检测领域，公开了牛奶中多不饱和脂肪酸的中红外光谱快速批量检测方法。在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择+多次遍历的方法。最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性。选取了多不饱和脂肪酸模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性。实现了原料奶中多不饱和脂肪酸含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测。
Description
技术领域
本发明属于奶牛性能测定和牛奶品质检测领域，具体涉及牛奶中多不饱和脂肪酸的中红外光谱快速批量检测方法。
背景技术
牛奶一直被认为是自然界中天然形成的最完美的食物之一，牛奶是脂肪酸的天然来源之一，其中对人类健康有益的亚油酸、亚麻酸，特别是共轭亚油酸含量丰富，对人体健康有重要的影响，目前已成为国人最重要的营养来源之一。
多不饱和脂肪酸(PUFA)是人体所需的必需脂肪酸(EFA)，是线粒体和细胞膜憐脂的重要组成部分，参与脂质代谢和精子形成，也是合成前列腺素的前体，具有清除血液污垢、降低血清胆固醇、增强细胞膜通透性、促进组织修复等一系列生理功能。研究表明，通过补充多不饱和脂肪酸可以对类风湿性关节炎、前列腺炎、特异性皮炎起到一定的治疗和预防效果[1]。
牛奶是人类重要的食物来源，其中乳脂含有约400种脂肪酸，多不饱和脂肪酸约占总脂肪酸的5％[2-3]，这些脂肪酸除了与牛奶风味、理化特性及奶酪制作等存在直接关系外[4-6]，还与人体健康息息相关。而多不饱和脂肪酸则被认为对人体健康有益[7]。此外，乳中脂肪酸含量还能反映奶牛个体能量和健康状况[9-10]。关于牛奶中饱和脂肪酸的测定方法目前有国家标准，即食品安全国家标准--食品中脂肪酸的测定(GB5009.168-2016)，我国规定了乳与乳制品中的脂肪酸使用气相色谱法进行检测(GB 5009.168—2016)[11]，此方法能定量检测脂肪酸的种类和含量，但样品前处理过程复杂，耗时长，且成本高，研究者们试图对该方法进行改进，国内外对于牛奶脂肪检测的主要方法有气相色谱法、紫外分光光度计法、液相色谱法等，但都存在成本高和效率低等问题，很难在生产实践中快速批量化使用。中红外光谱MIR(Mid-Infrared Spectroscopy)技术是一种非常经济高效的检测工具，通过中红外光对分子中特定化学键吸收所在的频率和对应的波峰的不同，来预测所研究物质和性状的性质或含量，从而可以得知生物的生理状态等信息。在畜牧行业中，通过MIR来检测奶牛的营养、生理等指标在国内已经逐渐兴起，现已经可以对蛋白总量和脂肪总量等指标进行检测，但目前暂无精度很高的多不饱和脂肪酸含量的快速批量检测模型。
目前国外早已开始了基于中红外检测牛奶中物质成份的研究，但都存在精度不高，特征波段不够准确等问题，国内还没有相关报道。与其它国家相比，中国奶牛因受到国内气候、地理环境和饲养条件等影响，与国外奶牛存在较大差异，牛奶品质也有其特点，国外检测模型并不一定适合于中国奶牛，故需要尽快建立具有我国自主产权的适合于中国奶牛牛奶的多不饱和脂肪含量检测方法，不仅可用于快速、高效、准确和无创测定奶牛泌乳性状中重要性能指标多不饱和脂肪酸含量，为奶牛遗传育种提供表型数据及理论依据，而且可检测分析原料牛奶及奶制品中多不饱和脂肪酸含量，为乳业加工业和消费者提供参考。本发明的目的即为解决目前存在的问题，建立乳中多不饱和脂肪酸的快速检测技术，为中国奶业的发展提供技术保障。
发明内容
本发明的目的在于提供了牛奶中多不饱和脂肪酸的中红外光谱快速批量检测方法，该方法具有简单、快速和批量等优势。
本发明的另一个目的在于提供了牛奶中多不饱和脂肪酸的中红外光谱快速批量检测方法的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
牛奶中多不饱和脂肪酸的中红外光谱快速批量检测方法，包括下述步骤：
1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：933.64cm-1-1049.38cm-1、1053.23cm-1-1192.12cm-1、1253.85cm-1-1415.89cm-1、1477.61cm-1-1651.22cm-1、1793.97cm-1-2075.60cm-1、2110.33cm-1-2291.65cm-1、2303.23cm-1-2650.45cm-1、3016.96cm-1-3109.55cm-1、3140.41cm-1-3244.58cm-1、3395.04cm-1-3641.95cm-1、3931.30cm-1-4077.91cm-1、4101.05cm-1-4232.23cm-1、4274.66cm-1-4510.00cm-1、4618.03cm-1-4810.93cm-1、4861.08cm-1-5015.40cm-1中的MIR数据；
2.将测定所得到的MIR数据代入diff2+diff1+PLSR(n_component＝5)模型中，即可输出多不饱和脂肪酸含量的预测结果。
所述的diff2为二阶差分，diff1为一阶差分。
以上所述的方法中，优选的，步骤1中每一段波段前后允许有两个波点的差距。
本发明的保护内容还包括：上述检测方法用于检测牛奶中多不饱和脂肪酸含量。
与现有技术相比，本发明优点在于：
1.在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择+多次遍历的方法。最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性。
2.选取了多不饱和脂肪酸模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性。
3.实现了原料奶中多不饱和脂肪酸含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测，每一个样本的测定时间仅需10-15秒，提高了检测效率，具有较强的实用性，将可广泛应用于奶牛性能测定和牛奶质量品质检测。
附图说明
图1为未经处理的牛奶样品中红外光谱图(a)与平均光谱图(b)。
图2为diff2+diff1预处理后的牛奶样品中红外光谱图。
图3为选取的十五个特征波段光谱总图(a)以及每个特征波段放大图(b)。
图4为模型牛奶数据真实值与预测值相关性与拟合直线图。
具体实施方式：
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
1.实验材料
试验材料来源于我国五个地区11个省份36奶牛场的266头中国荷斯坦牛，每头牛采集一份奶样，奶样采集利用自动挤奶装置完成，先用消毒后的毛巾擦拭牛奶房，然后用碘甘油混合溶液对乳房消毒，挤掉前三把乳汁后，对挤奶全过程奶样进行采集，每份奶样采集40ml，分装到直径3.5cm，高9cm的圆柱形全新采样瓶里，依次编号，并向每个采样瓶里立即加入溴硝丙二醇防腐剂，缓慢摇晃使其充分溶解，运回途中在奶样周围放置冰袋(2-4℃)防止变质，样本到达实验室后立即进行光谱采集。
2.中红外光谱测定与采集
将样品倒入直径3.5cm，高9cm的圆柱形样品管中，在42℃水浴锅中水浴15-20min，使用FOSS公司的MilkoScanTM7RM乳成分检测仪，将固体光纤探头伸到液体中，对样品进行混匀后扫描。
3.牛奶中多不饱和脂肪酸的真实(参考)值检测方法
3.1仪器、设备和试剂
电热恒温水浴锅(武汉一恒苏净科学仪器有限公司)；安捷伦气相色谱仪，包括自动进样器、柱温箱、进样瓶、涡漩振荡器、针管过滤器、0.22μm尼龙滤膜、100m×0.25mm×0.2μm，熔融石英毛细管柱、氦气。
十一烷酸甲酯C11:0FAME(CAS号1731-86-8)：≥99％，94118-1ML，购置公司为Supelco；十三烷酸甘油三酯C13:0TAG(CAS号26536-12-9)：≥99％，T3882-500MG购置公司Sigma-Aldrich；FAME混标(37种脂肪酸)：，1269119-100MG，购置公司Sigma-Aldrich；其他试剂均为国产色谱纯。
3.2实验方法
3.2.1中红外光谱的采集
利用MilkoScanTM FT+进行光谱采集，具体采集步骤为：将奶样分批放入45℃电热恒温水浴锅内预热5min，预热好的奶样放在检测架上上下摇晃数次使牛奶胶状溶液混合均匀，将检测架放在检测履带上，打开瓶盖，依次进行检测，采集完光谱后的奶样置于-20℃冷冻保存，用于后续多不饱和脂肪酸的含量测定。
3.2.2多不饱和脂肪酸含量的气相色谱技术测定
(1)提脂：二氯甲醇法(国内外常用，更简便)[12-13]
(15ml离心管)1ml乳加1.8ml水、8ml CH2Cl2/CH3OH(2:1，v/v)，涡旋10min，8000rmp离心10min，取下层液。剩余溶液加4ml CH2Cl2/CH3OH(2:1，v/v)再次萃取。合并萃取液氮吹。
(2)脂肪酸甲酯化：KOH的甲醇溶液法
50mg脂加1mL正己烷，加50μL KOH-MeOH溶液(2M)进行甲酯化。涡旋30s，8000rmp离心5min，取上清液过膜进GC-MS分析[14]
(3)气相色谱仪器参数
分流进样模式
色谱柱：100m×0.25mm×0.2μm，熔融石英毛细管柱
固定相：氰丙基-聚硅氧烷
载气：氦气
柱头压力：225kPa(175kPa-225kPa)
总流量：25.5ml/min
分流比：10：1
进样器温度：250℃
检测器温度：275℃
进样量：1μl。
程序升温：
| 时间/min | 温度/℃ | 保留时间/min | 速率/℃/min |
| 0 | 60 | 5 | |
| 5 | 165 | 1 | 15 |
| 10 | 225 | 20 | 2 |
(4)将所有测得的9种多不饱和脂肪酸含量进行求和，则为单不饱和脂肪酸含量。
4.有效样本的选择
266个样本中，剔除掉样本变质、损耗、中红外光谱测定异常、样本参考值测定异常等操作导致的无效数据，共剔除掉了30个异常样本，选择了236个样本进行模型的建立与优化。
实施例1：
多不饱和脂肪酸的预测模型算法的选择：
本申请目的为建立多不饱和脂肪酸的定量测定模型，所以使用建模算法为回归算法。回归算法种类很多，本实施例主要使用了岭回归(Ridge)与偏最小二乘回归(PLSR)算法进行模型建立与对比，理由如下：
岭回归是线性回归的一种。只是在算法建立回归方程时候，岭回归加入了正则化的限制，从而达到解决过拟合的效果。正则化有两种，分别为l1正则化l2正则化，l2正则化相比于l1正则化的优势在于：(1)可以进行交叉验证(2)实现了随机梯度下降。岭回归就是加入了l2正则化后的线性回归模型，保留了线性回归的优点，符合模型建立的要求，而且结果较为稳定，是较常使用的基础算法之一，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
偏最小二乘回归算法是多特征样本中非常有效的算法之一。中红外光谱数据中，每一个样本对应1060个波点，是多特征样本的代表。同时偏最小二乘回归算法很少出现过拟合情况，所以很多中红外光谱的研究者们会选择使用偏最小二乘回归算法进行模型的建立，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
实施例2：
中红外光谱初步模型算法及其最优预处理组合的筛选：
有效特征筛选是对光谱数据进行处理的基本操作，目的是为了消噪，并为提取特征打好基础。有效特征筛选主要有特征抽取、特征预处理与特征降维三种。本实施例主要采用SG(卷积平滑)、MSC(多元散射校正)、SNV(标准正态变量变换)、diff1(一阶差分)和diff2(二阶差分)等五种处理方法对光谱数据进行特征预处理。
本实施例每个样本对应一条MIR光谱数据。将全光谱波段代入进行建模，比较分析模型的准确度，使用两种算法和六种方法(包括无预处理)进行一一配对，以确定模型初步最优算法和预处理组合，结果如下表：
比较结果如下:
经过比较，发现偏最小二乘回归与二阶差分(PLSR+diff2)的组合整体效果更好，而且相比于Ridge算法过拟合情况较弱，所以模型初步最优算法和预处理组合最终选择：PLSR+diff2。
实施例3：
中红外光谱检测牛奶中多不饱和脂肪酸含量的方法的建立：
1.建模数据集的划分
本实施例中的建模数据集划分中，80％为训练集，20％为测试集。训练集与测试集的比例为4：1，同时训练集又叫做交叉验证集，在训练模型的过程中进行10折交叉验证。
2.建模特征波段的手动选择过程及确定
选取特征波段的方法有很多，主要包括算法选取特征与手动选取特征两种，算法选取特征的原理主要来源于各波点与参考值之间的相关性，优点在于速度快、效率高，但缺点在于忽略了相邻波点之间的协同作用，思路较为单一；手动选取特征的优点在于选择的过程中可以强化波段(即相邻波点)的作用，同时可以在提升模型的过程中更多得保留光谱的原始信息状态，包容性与泛化能力更强，选取波段准确，缺点在于选择速度慢，效率低。
本实施例选取特征波段采用手动选取的方法，选取步骤如下：
(1)确定基本算法与预处理组合，由实施例2可知PLSR+diff2的效果组合整体较好，所以最终选择PLSR+diff2组合作为多不饱和脂肪酸的初步模型算法与预处理组合。
(2)确定最佳第二次预处理。建模过程中，有时仅一次预处理会限制模型的泛化能力和优化潜力，本实施例在建模过程中发现进行第二次预处理可以更好地优化模型，所以将初步模型算法选择与预处理组合的结果进行第二次预处理，选择出最佳的第二次预处理方法。经过比较，发现第二次预处理使用diff1对训练集效果的提升较为明显，且测试集效果并没有很严重的下降，优化潜力较大，而diff2的过拟合情况较为严重，所以最终选择diff1作为最佳第二次预处理方法(结果如下表)。
建模特征波段的手动选择过程如下：
(1)将全波段以100个波点为一段进行分段，最终分为11段。根据预实验，发现，保留部分水吸收相关的光谱区域可提升模型的准确度，因此，在此步骤中，并未去掉水吸收相关的光谱区域。
(2)以50个波点为一组，使用偏最小二乘回归算法，首先将第一段波段临界处两端波点增加或减少一组波点，寻找最优效果，并以此为基础对第二段波段进行类似操作，最终将11个波段全部完成一轮操作后算第一次遍历完成。
(3)在第一次遍历完成后进行第二次、第三次或更多次的手动遍历，直到所有的波点不再变化为止，即为最优特征波段。
最终经过十五轮筛选，得到最优结果，如表所示：
最终选取的特征波段结果为：933.64cm-1-1049.38cm-1、1053.23cm-1-1192.12cm-1、1253.85cm-1-1415.89cm-1、1477.61cm-1-1651.22cm-1、1793.97cm-1-2075.60cm-1、2110.33cm-1-2291.65cm-1、2303.23cm-1-2650.45cm-1、3016.96cm-1-3109.55cm-1、3140.41cm-1-3244.58cm-1、3395.04cm-1-3641.95cm-1、3931.30cm-1-4077.91cm-1、4101.05cm-1-4232.23cm-1、4274.66cm-1-4510.00cm-1、4618.03cm-1-4810.93cm-1、4861.08cm-1-5015.40cm-1，每一段前后允许有两个波点的差距。结果发现模型中添加部分第一段与第二段水吸收区域后，模型可以达到最优效果，说明多不饱和脂肪酸的特征波段包含部分水吸收区域。
3.模型参数的筛选确定
模型参数包括预处理方法的参数以及算法的参数，本模型中所涉及到的diff2与diff1预处理方法无参数；主要参数为偏最小二乘回归算法的参数：主成分(n_component)，参数选择结果对比如下(部分)：
根据对比结果，最终选择主成分(n_component)为5。
经过比较分析，饱和脂肪酸的最佳回归模型为：diff2(二阶差分)+diff1(一阶差分)+PLSR(n_component＝5)模型。训练集和测试集相关系数分别为0.8431和0.8308；训练集和测试集均方根误差分别为0.2776和0.2979。
实施例4：
奶中多不饱和脂肪酸的中红外光谱MIR的快速批量检测方法的应用：
利用建立的多不饱和脂肪酸最佳回归模型(diff2(二阶差分)+diff1(一阶差分)+PLSR(n_component＝5))对随机选取的5个外部牛奶样本(非236份实验材料之一)进行预测，并将预测结果与真实值比较。
1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：933.64cm-1-1049.38cm-1、1053.23cm-1-1192.12cm-1、1253.85cm-1-1415.89cm-1、1477.61cm-1-1651.22cm-1、1793.97cm-1-2075.60cm-1、2110.33cm-1-2291.65cm-1、2303.23cm-1-2650.45cm-1、3016.96cm-1-3109.55cm-1、3140.41cm-1-3244.58cm-1、3395.04cm-1-3641.95cm-1、3931.30cm-1-4077.91cm-1、4101.05cm-1-4232.23cm-1、4274.66cm-1-4510.00cm-1、4618.03cm-1-4810.93cm-1、4861.08cm-1-5015.40cm-1中的MIR数据；
同时利用气相色谱法检测同批次牛奶中的多不饱和脂肪酸真实值。
2、将测定所得到的MIR数据代入实施例3构建的diff2(二阶差分)+diff1(一阶差分)+PLSR(n_component＝5)模型中，即可输出多不饱和脂肪酸含量的预测结果。
该模型预测的结果与真实结果非常接近(如下表)，故该模型的准确性较高，可用于牛奶的多不饱和脂肪酸含量预测。
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Claims (3)
1.牛奶中多不饱和脂肪酸的中红外光谱快速批量检测方法，包括下述步骤：
1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：933.64cm-1-1049.38cm-1、1053.23cm-1-1192.12cm-1、1253.85cm-1-1415.89 cm-1、1477.61cm-1-1651.22cm-1、1793.97cm-1-2075.60cm-1、2110.33cm-1-2291.65cm-1、2303.23cm-1-2650.45cm-1、3016.96cm-1-3109.55 cm-1、3140.41cm-1-3244.58cm-1、3395.04cm-1-3641.95cm-1、3931.30cm-1-4077.91 cm-1、4101.05cm-1-4232.23cm-1、4274.66cm-1-4510.00cm-1、4618.03cm-1-4810.93 cm-1、4861.08cm-1-5015.40cm-1中的MIR数据；
2.将测定所得到的MIR数据代入diff2+diff1+PLSR(n_component=5)模型中，即可输出多不饱和脂肪酸含量的预测结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中每一段波段前后允许有两个波点的差距。
3.权利要求1所述的方法在检测牛奶中多不饱和脂肪酸含量中的应用。
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