CN114164140A - 一株高效溶磷菌mqr6及其发酵产物与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高效溶磷菌MQR6及其发酵产物与应用。所述溶磷菌名称为(Pantoea)MQR6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.23609，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明中，溶磷菌(Pantoea)MQR6为自主分离自土壤并筛选而得。实验证明，溶磷菌MQR6能产生IAA，每毫升OD600nm值为1的发酵液中含有165.52μg IAA。该菌株溶磷能力强，能够在较短时间内活化磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁等难溶性磷，显著提高有效磷含量。该菌株可分泌铁载体，活性较强。将其用于植物幼苗，具有显著促生效果，提高苗木株高和地径生长量，促根壮根，提高养分利用率。该菌株适应能力强，适于作为微生物菌剂、菌肥和土壤改良剂应用于农业生产，具有广阔的应用前景。

Description

一株高效溶磷菌MQR6及其发酵产物与应用
技术领域
本发明涉及微生物学领域，具体地说，涉及一株高效溶磷菌MQR6及其发酵产物与应用。
背景技术
磷是植物生长发育必须的大量元素，磷是核酸、核蛋白、磷脂、植素等有机化合物的重要组成部分，参与植物体内能量代谢、光合作用、呼吸作用、糖酵解、氧化还原反应及信号转导等多种生理和生化过程。土壤磷素存量大，但其中约95％不能被植物直接吸收利用，磷素供给不足常常是制约植物生长发育的重要原因之一。磷肥的当季利用率只有10％～25％，磷肥过量施用造成磷流失、土壤板结和环境污染等问题。
磷元素极易被土壤固定，这是造成磷利用率低的主要原因。在碱性土壤中磷转变为磷酸钙(磷酸二钙或磷酸三钙，Ca-P)，而在酸性土壤中磷转变为磷酸铝和磷酸铁(铁铝磷酸盐，Al-P、Fe-P)。据报道贫磷矿可能在未来100-200年内被耗竭，因此解决磷营养问题以保持植物高产同时保护环境成为世界性的研究任务。
土壤溶磷微生物是土壤磷循环中重要一员，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态。溶磷微生物能够通过酸解作用、酶解作用等将无效磷转化为有效磷供植物吸收，溶磷菌的活动不仅能为植物提供有效磷，还能分泌生长素等植物激素促进植物生长和发育，部分溶磷菌还可以分泌嗜铁素和ACC脱氢酶等。
研制环境友好型的溶磷菌剂，对于提高磷素利用率、促进植物生长、降低化肥用量和减少污染具有十分重要的作用。采用微生物菌肥与化肥配合施用，既能保证增产，又减少了化肥使用量，降低成本，同时还能改善土壤理化性状，提高植物产量和品质。微生物菌肥对促进绿色农业、生态农业及我国农业可持续发展具有重要意义。
菌种是微生物菌剂和微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需求溶磷能力强、促生作用显著、抗逆性强的微生物肥料生产用菌种。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有溶磷、产植物生长素IAA、产铁载体、促进植物生长作用的溶磷菌MQR6及其发酵产物与应用。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明的溶磷菌(Pantoea)MQR6含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明的溶磷菌(Pantoea)MQR6，该菌株于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，分类命名为Pantoea，保藏编号为CGMCCNo.23609，以下简称为溶磷菌MQR6。
菌体形态特征为：菌体为革兰氏阴性细菌，菌落圆形，淡黄色，表明光滑、粘稠且不透明，在无机磷培养基上长势良好，呈现明显的溶磷圈(图1)。扫描电子显微镜下呈短杆状，菌体平均长度为0.8×2μm，平均宽度为0.4×0.6μm，以周生鞭毛运动(图4)。
本发明的溶磷菌MQR6是从25年生元宝枫林地土壤中筛选得到。通过元宝枫幼苗盆栽试验，根据元宝枫幼苗株高、地上生长量、根生物量、根系长度、根系表面积、氮磷钾养分积累量等来判断菌株的促生能力。通过对基质的有效养分含量来说明菌株对土壤或基质的生态效应。
(1)本发明中菌株筛选方法
a.菌株溶磷能力定量测定：选择菌液有效磷含量大于100mg/L的菌株。
b.菌株产IAA能力测定：选择菌液IAA含量大于50μg/mL的菌株。
c.菌株产铁载体测定：选择在CAS琼脂平板上产生黄色晕圈的菌株。
(2)盆栽试验方法
a.菌株扩大培养：将活化后的菌株接入胰蛋白胨大豆肉汤培养基，制备种子液。将种子液接入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基进行扩大培养。
b.接种元宝枫：将扩大培养后的菌液用水稀释，再将稀释后的菌液注入幼苗根系附近土壤。120天后取样测定。
c.结果测定：测定幼苗株高、地径，计算生长量，测定根生物量、根系形态特征以及地上部养分积累量，与对照进行对比。
进一步地，本发明提供上述溶磷菌(Pantoea)MQR6的发酵产物。
本发明提供一种菌剂，其含有上述溶磷菌(Pantoea)MQR6或所述的发酵产物。
优选地，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
本发明提供一种微生物肥料，其含有上述溶磷菌(Pantoea)MQR6或所述的发酵产物。
本发明提供一种土壤改良剂，其含有上述溶磷菌(Pantoea)MQR6或所述的发酵产物。
该土壤改良剂可缓解长期施用磷肥造成的土壤板结、酸化、营养元素和微生物种群结构失衡等土壤生态环境恶化问题。
本发明还提供一种上述溶磷菌(Pantoea)MQR6或所述的发酵产物或所述的菌剂在如下任一方面的应用。
(1)在降解难溶性磷酸盐中的应用；
(2)在制备产生生长素IAA产品中的应用；
(3)在制备生长素IAA产品中的应用；
(4)在产铁载体中的应用；
(5)在制备溶磷微生物菌剂产品中的应用；
(6)在制备溶磷微生物菌肥中的应用；
(7)在制备促进植物生长产品中的应用；
(8)在提升磷肥利用率中的应用；
(9)在制备土壤改良剂中的应用；
(10)在促进植物生长中的应用；
上述菌剂和应用中，所述产品均为菌剂、微生态制剂或生物肥料。
在降解难溶性磷酸盐的应用中，所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。优选的，所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙。
优选的，所述的Pantoea MQR6在NBRIP培养基中，溶解难溶性磷酸盐至可溶性磷含量达548.1±9.5mg/L～750.0±8.2mg/L。
在制备产生生长素IAA的应用中，优选地，所述的Pantoea MQR6在TSB培养基中培养，每毫升OD600nm值为1的发酵液中含有165.52μg IAA。
在促进植物生长的应用中，优选地，所述应用的具体方式为：将所述溶磷菌(Pantoea)MQR6、所述发酵产物或所述菌剂添加至植物根系土壤中和/或喷施于植物叶面。
优选地，将所述溶磷菌(Pantoea)MQR6、所述发酵产物或所述菌剂配制为菌液后，将所述菌液注入植物幼苗根系土壤和/或喷施于植物叶片。
本发明的有益效果至少在于：
本发明的溶磷菌(Pantoea)MQR6具有溶磷、产IAA、产铁载体、促进植物生长的作用，可改善土壤环境、提高磷肥利用率，提高土壤和/或基质中有效磷含量。实验证明，溶磷菌(Pantoea)MQR6能产生IAA，每毫升OD600nm值为1的发酵液中含有165.52μg IAA，溶磷菌MQR6具有较强的IAA分泌能力，进而具有促进植物尤其是根系生长、增强根系吸收矿质营养和水分的能力。该菌株溶磷能力强，能够在较短时间内活化磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁等难溶性磷，显著提高有效磷含量。将其用于植物幼苗，具有显著促生效果，提高了苗木株高、地径生长量和氮磷积累量。溶磷菌(Pantoea)MQR6在微生物菌剂、生物有机肥和微生物肥料生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的溶磷菌(Pantoea)MQR6的溶磷效果特征图；
图2为本发明实施例提供的溶磷菌(Pantoea)MQR6分泌生长素的定性测定照片；
图3为本发明实施例提供的溶磷菌(Pantoea)MQR6的菌落特征图；
图4为本发明实施例提供的溶磷菌(Pantoea)MQR6的投射电镜特征图；
图5为根据16S rRNA基因序列构建的溶磷菌(Pantoea)MQR6的与相关模式菌的系统进化树。其中，MQR6为溶磷菌(Pantoea)MQR6。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的优选实施方式进行进一步的详细描述。需要理解的是以下给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面实施例中所用培养基的配方如下：
TSA固体培养基的配方：15.0g胰蛋白胨，5.0g大豆胨，5.0g NaCl，15.0g琼脂，去离子水定容至1000mL，pH为7.3±0.2。
TSB液体培养基的配方：17.0g胰蛋白胨，3.0g大豆蛋白胨，5.0gNaCl，2.5g K2HPO4，2.5g葡萄糖，去离子水定容至1000mL，pH为7.3±0.2。
无机磷培养基的配方：10.0g葡萄糖，0.5g(NH4)2SO4，0.5g酵母浸粉，0.3gNaCl，0.3g KCl，0.3g MgSO4，0.03g FeSO4，0.03g MnSO4，5.0g Ca3(PO4)2，去离子水定容至1000mL，pH为7.3±0.2。
实施例1、溶磷菌MQR6的分离与鉴定
1溶磷菌MQR6的分离
溶磷菌MQR6分离自元宝枫根际土，采样地点为北京市九龙山暖温带森林国家长期科研基地，地理坐标为东经115°59′～116°06′，北纬39°54′～39°57′。通过S形采样法在样地设置9个采样点，用土钻钻取0-20cm土壤，将土壤混合装入灭菌袋带回实验室。按照常规分离方法，在无机磷固体培养基上涂布分离，30℃培养48h，选择有较大清晰透明圈的菌株在无机磷固体培养基上进行划线分离纯化，得到纯化菌株。将分离获得的纯菌株点接种于无机磷固体培养基上，置于30℃培养箱中培养5～7d，观察有无透明圈，并根据透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)大小初步确定菌株的解磷能力，将其中一株分离纯化后所得的根际细菌编号为MQR6，其D/d值为3.5，以下简称MQR6。
2溶磷菌(Pantoea)MQR6的鉴定
2.1形态学鉴定
通过平板划线，对处于对数生长期的溶磷菌MQR6进行菌落菌体状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状态等)。另一方面，对处于对数生长期的MQR6经革兰氏染色后采用光学显微镜和投射电镜观察菌体的形态。
结果表明溶磷菌MQR6革兰氏染色呈阴性、短杆状，有鞭毛；在TSA培养基上培养24h后菌落圆形，光滑、粘稠且不透明。
2.2 16S rRNA基因及基因组序列同源性分析
溶磷菌MQR6总基因组DNA的提取采用细菌基因组提取试剂盒。16S rRNA基因的扩增采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应程序：94℃5min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增片段克隆到载体PEASY-T1，用蓝白斑筛选的方法选取阳性克隆，委托上海生工以T7和SP6作为测序引物双向测序。相关序列通过Eztaxon server(hppt：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/ezt_identify)进行序列分析。
通过16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序，获得长度为1440bp片段，其序列详见序列表中序列1.将该基因序列在Eztaxon网站进行相似性比对，结果表明溶磷菌MQR6的16S rRNA基因序列与与Pantoea ananatis LMG 2665T(97.81％)、Pantoea vagans LMG24199T(98.54％)，Pantoea stewartii subsp.indologenes LMG 2632T(98.48％)，Pantoeastewartii subsp.stewartii LMG 2715T(98.48％)相似性最高。依据16S rRNA基因序列构建的系统进化树。
溶磷菌MQR6的基因组测序采用Hiseq 2500(Zetabio)完成。与相近类群基因组构建进化树，结果发现溶磷菌MQR6与Pantoea allii LMG 24248T、Pantoea ananatis LMG2665T、Pantoea brenneri LMG 5343T聚为同一分支。根据基因组数据，通过http：//ggdc.dsmz.de网站，计算基因组间的DNA相似性，结果发现，MQR6与Pantoea allii LMG24248T、Pantoea ananatis LMG 2665T、Pantoea brenneri LMG 5343T聚相似性分别为28.0％、28.1％和40.2％，远低于不同种间杂交值低于70％的分类标准。
溶磷菌MQR6与已知类群的16S rRNA相似性不高于98.54％，并且ANI值均远低于种水平的分类标准，因此可以确定溶磷菌MQR6为新种。
2.3 C/N源利用的测定
以菠萝泛菌CICC 10283T为标准菌株，利用微生物全自动鉴定分析系统(Biolog)对MQR6与菠萝泛菌CICC 10283T进行C/N源利用的测定。具体方法如下：将活化好的菌体在YMA(酵母甘露醇琼脂)上划线接种，30℃培养直至生长对数期；用棉签从YMA培养基上挑取菌加到Biolog培养液中。并将装培养液的试管放入浊度剂中检测浊度，按照要求将菌液浊度调到规定值后混匀，制成接种液。然后将接种液倒入V型加样槽中，用排抢把接种液打到Biolog板子中的96孔内(GN板)。盖上盖子，适温培养4-6h，12-24h；在Biolog仪器上分别读取两次数据(4-6h和12-24h)，并综合记录结果(表1)。
结果表明溶磷菌MQR6和菠萝泛菌CICC 10283T在如下生理生化特征方面存在明显差别：1)MQR6不能利用葡聚糖，菠萝泛菌CICC 10283T能利用葡聚糖；2)MQR6能较好地利用D-麦芽糖，菠萝泛菌CICC 10283T不同利用D-麦芽糖；3)MQR6不能利用D-海藻糖，菠萝泛菌CICC 10283T能利用D-海藻糖；4)MQR6不能利用蔗糖，菠萝泛菌CICC 10283T能较好地利用蔗糖；5)MQR6不用利用α-D-乳糖，菠萝泛菌CICC 10283T能较好地利用α-D-乳糖；6)MQR6能较好地利用L-海藻糖，菠萝泛菌CICC 10283T对L-海藻糖利用能力很弱；7)MQR6不能利用D-蜜三糖，菠萝泛菌CICC 10283T能利用D-蜜三糖；8)MQR6不能利用D-蜜二糖，菠萝泛菌CICC10283T能利用D-蜜二糖；9)MQR6能较好地利用D-甘露醇，菠萝泛菌CICC 10283T不能利用D-甘露醇；10)MQR6不能利用L-天冬氨酸，菠萝泛菌CICC 10283T能较好地利用L-天冬氨酸；11)MQR6能利用4％NaCl，CICC 10283T对4％NaCl的利用能力很弱；12)MQR6能较好地利用丙酮酸盐，菠萝泛菌CICC 10283T不能利用丙酮酸盐；13)MQR6和菠萝泛菌CICC 10283T均能利用D-纤维二糖、1％NaCl、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-海藻糖、L-鼠李糖、myo-肌醇、丙三醇、D-葡萄糖、D-果糖、脯氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、半乳糖醛酸、L-半乳糖酸、D-葡糖酸、L-乳酸和柠檬酸等(表1)；14)MQR6和菠萝泛菌CICC 10283T均不能利用龙胆二糖、D-松二糖、水苏糖、8％NaCl、3-Methyl葡萄糖、D-天冬氨酸、D-丝氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、苯乙酸、D-乳酸甲酯和α-戊二酸。
表1、溶磷菌MQR6和CICC 10283T对碳源和氮源利用的对比
Figure BSA0000256155340000071
注：所有的实验都是在相同的条件下进行的。“+”表示阳性，即可以较好地利用；“W”表示弱阳性，即利用能力很弱；“-”表示阴性，即不能利用。
2.4脂肪酸特征
参照Sasser M法提取总脂。将提取的总脂进行皂化、甲基化处理后，萃取上层有机相，用具有气相色谱(GC)分析功能的MIDI微生物鉴定系统对溶磷菌MQR6和CICC10283T进行脂肪酸组成分析。具体操作按照仪器使用说明进行，按MIDI微生物鉴定系统分析结果见表2，溶磷菌MQR6的主要脂肪酸组成为C12∶0，C14∶0，C16∶0，C17∶0，C17∶0cyclo，第二特征特征类型*，第三特征特征类型*，第八特征特征类型*。结果表明，溶磷菌MQR6同近缘菌脂肪酸组成成分基本相同，但含量存在较明显的差异。
表2、溶磷菌MQR6和CICC 10283T脂肪酸的组成比例(＞1％)
Figure BSA0000256155340000081
注：数据均来源于本实验，且表中数据为三次重复实验结果的平均值；“-”表示未检测。第二特征特征类型*包括醛-C12∶0和/或未知等效链长度(ECL)10.9525；第三特征特征类型*包括C16∶1ω6c和/或C16∶1ω7c；第八特征特征类型*包括C18∶1ω7c和/或C18∶1ω6c。
综上所述，溶磷菌MQR6同近缘菌相比，生理生化特征差别较大，脂肪酸含量差别也较大，因此可以确定溶磷菌MQR6为Pantoea属的新种。溶磷菌MQR6已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23609。
实施例2、溶磷菌MQR6的生理生化特征
1.1耐盐能力测定：在含有0％、1.0％、2.0％、4.0％、6.0％、8.0％、10.0％NaCl的YWA液体培养基中接种相同浓度的溶磷菌MQR6菌液(1％接种量，v/v)，30℃振荡培养7天，用UV-1800紫外分光光度仪测量600nm处的吸光值，发现溶磷菌MQR6在盐度8.0％依旧可以生长(长势较弱)，且最适生长盐浓度范围为0-4.0％。
1.2 pH值范围测定：配置磷酸盐缓冲液(甲液：磷酸8.3ml，加去离子水混匀定容至500ml；乙液：Na2HPO414.326g，去离子水混匀定容至500ml；取甲液72.5ml与乙液27.5ml混匀，pH约2.0)、乙酸-乙酸钠缓冲体系(0.2mol/L乙酸与0.2mol/L乙酸钠进行配制，pH值约5.0-6.0)、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(取6.805g KH2PO4，加去离子水混匀定容至350ml，用1mol/LNaOH溶液调pH约7.8-8.0)和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲体系(0.1mol/L Na2CO3与0.1mol/LNaHCO3以1∶9的比例混合，pH约9.0-10.0)，设置不同浓度接菌、培养及OD测量同盐度实验，结果表明MQR6最适生长pH为5.0-8.5。
1.3温度生长范围：在pH为6.0、含有3％NaCl的TSB液体培养基中接入MQR6菌液，分别在5、15、25、30、35、40、45和50℃条件下震荡培养，测OD值发现：溶磷菌MQR6在15-50℃都可以生长，且最适生长温度为28-30℃。
实施例3、溶磷菌MQR6分泌生长素的定性检测和定量分析
根据参考文献(Glickmann，E.Dessaux，A.critical examination of thespecificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced byphytopathogenic bacteria.Applied and environmental microbiology 1995，61(2)，793-796)所述的Salkowski比色法测定溶磷菌MQR6分泌生长激素IAA性能。将溶磷菌MQR6接种于TSB液体培养基，30℃摇床，180rpm振荡培养4d，得到溶磷菌MQR6发酵液。以未接菌的TSB液体培养基作为空白对照，测定溶磷菌MQR6发酵液的OD600nm值，结果表明溶磷菌MQR6发酵液的OD600nm值为1.78(该数值为去除空白对照的OD600nm的数值)。
定性检测按照如下操作：取50μL溶磷菌MQR6发酵液与50μL的Salkowski比色液(50mL35％HClO4+1mL0.5MFeCl3)滴于白色陶瓷板上于室温避光后观察，颜色变红表示能够分泌IAA。溶磷菌MQR6发酵液中加入等体积的IAA的比色液处理作为阳性对照，以不接种的液体培养基作为阴性对照，实验设三次重复。
定量分析按照如下操作：将溶磷菌MQR6发酵液用TSB液体培养基稀释至OD600nm值为1(以未接菌的TSB液体培养基作为空白对照)，离心后取上清液与Salkowski比色液等体积混合，避光静置后测定，每个样品设3个重复。标准曲线的绘制按照参考文献(Fry NK，Warwick S，Saunders NA，et al.The use of 16S ribosomal RNA analyses toinvestigate the phylogeny of the family Legionellaceae.Journal of GeneralMicrobiology，1991，137(5)：1215-1222.)的方法，采用分析纯的3-吲哚乙酸(3-IAA)作为标准品。
定性检测结果显示，溶磷菌MQR6发酵液滴加Salkowski比色液后，菌液颜色变红，表明溶磷菌MQR6发酵液能够分泌植物生长激素IAA。进一步定量分析结果表明，每毫升OD600nm值为1的发酵液中含有165.52μg IAA，溶磷菌MQR6具有较强的IAA分泌能力。
实施例4、溶磷菌MQR6溶磷能力的定量分析
(1)菌悬液的制备：用接种环挑取少量菌种于50mL TSB液体培养基中培养，离心，收集菌体，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌体3次，并用生理盐水制备得到菌密度为108cfu/mL的菌悬液。
(2)磷酸盐生长(NBRIP)培养基配制：葡糖糖10.0g，磷酸盐(磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁)5.0g，六水合氯化镁5.0g，七水合硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，于121℃灭菌20min。
(3)接种和培养：将上述制备好的菌密度为108cfu/mL的菌悬液按照培养体系的4％(V∶V)的接种量，接种NBRIP液体培养基。于30℃，180rpm培养7d。
(4)可溶性磷酸盐的测定：培养7d后，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量。NBRIP液体培养基中，溶解难溶性磷酸盐达可溶性磷含量分别为625.2±2.9mg/L、548.1±9.5mg/L和750.0±8.2mg/L。
实施例5、溶磷菌MQR6产铁载体测定
菌株产铁载体测定：将溶磷菌MQR6菌株接种于CAS琼脂平板，菌株周围产生黄色晕圈。产铁载体测定方法具体为：取出保存的菌株，刮取少量菌体接入TSB培养基中，置于培养箱中30℃培养24h，挑取单菌落接入CAS平板培养基上，置于28℃培养箱48h，观察并记录菌落周围颜色的变化。CAS平板培养基：溶液A：60.5mg CAS，50mL蒸馏水，10mL氯化铁溶液(含1mM FeCl3·6H2O，10mM HCl)；溶液B：72.9mg HDTMA(十六烷基三甲基溴化铵)，40mL蒸馏水；溶液C：溶液A加入溶液B，混匀，121℃灭菌15min；2mL 1mM氯化钙溶液，2mL 1mM硫酸镁溶液，调pH6.8。蒸馏水定容至1000ml，加入18g琼脂，121℃灭菌15min，温度降至60℃以下时，加入50mL溶液C，混合均匀后制作平板。铁载体圈与溶磷菌菌落直径比值(D/d)为2.1。
实施例6、溶磷菌MQR6发酵液对植物促生能力测定
培养基质为北京潮土，采用盆栽的方法，盆大小为18cm×15cm，每盆装入1kg的土壤。实验分为如下3个处理：处理1为空白对照组(简称CK)，加入灭火后的发酵液；处理2为加磷组(简称P)，在空白处理的基础上加入磷肥，同时加入灭火后的发酵液；处理3为加菌加磷组(简称MQR6+P)，在空白处理的基础上加入5ml MQR6发酵液，加入磷肥。
将事先催芽的元宝枫种子种到蛭石基质中，生长2个月后(出现两片真叶)，选取长势一致的苗移栽到上述3个处理的花盆中，每盆2棵，每组重复5盆，缓苗后间苗，留下一株长势良好的苗木，该试验布置在温室中(白天温度18-30℃，夜间温度15-22℃)。待元宝枫移栽苗生长3个月后，对元宝枫苗的地上部分和根系生物学特征以及氮磷钾养分积累量进行统计分析，结果如下。
与空白对照相比，加磷处理尤其是磷和MQR6发酵液处理显著促进元宝枫地上部生长(表3)。处理3磷和MQR6发酵液调控元宝枫株高和茎粗较处理1分别增加67％和33％，较处理2分别增加50％和19％。与处理1和处理2相比，处理3磷和MQR6发酵液施用显著增加元宝枫叶片数量和叶面积，叶片是植物进行光合作用制造有机养分的主要器官，植物体内90％的干物质是由叶片合成，增加叶片数量、扩大叶片面积，可以扩大光合面积，充分利用太阳光，提高干物质产量。本试验中，处理3磷和MQR6调控元宝枫叶片鲜重和枝条鲜重较处理1分别增加54％和121％，较处理2分别增加35％和105％。磷和MQR6发酵液调控显著增加叶片光合速率，处理3叶片SPAD较处理1和处理2增加7-20％。
表3、不同处理元宝枫地上部生物学特征
Figure BSA0000256155340000111
注：不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
根系特征是评价苗木质量的重要指标，根系直接影响植物成活率和苗木生长状况。从表4可以看出，处理3元宝枫根系干重以及总根长、表面积、体积、细根总长度(直径≤0.4mm)均高于处理1和处理2相应性状。与处理1相比，处理3元宝枫根系干重、总根长、总根表面积、总根体积、细根总长度分别增加100％、65％、63％、90％和84％。与处理2相比，处理3总根长、总根表面积、总根体积、细根总长度分别增加23％、25％、25％、20％和26％。相比较来说，三个处理根系平均直径无显著差异。
表4、不同处理元宝枫根系形态特征
Figure BSA0000256155340000112
Figure BSA0000256155340000121
注：不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
磷和MQR6发酵液调控促进了元宝枫地上部生物量积累，增加了氮、磷和钾养分积累量(表5)。与处理1相比，处理3地上部干重、总氮积累率、总磷积累率和总钾积累率分别增加73％、60％、78％和94％。与处理2相比，处理3地上部干重、总氮积累率、总磷积累率和总钾积累率分别增加27％、19％、23％和29％。
处理3土壤中有效氮和有效磷的含量显著高于处理1和处理2，并且处理3中酸性磷酸酶和硝酸还原酶的活性明显高于处理1和处理2.
表5、不同处理元宝枫地上部氮磷钾养分积累量
Figure BSA0000256155340000122
注：不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由上述各表数据可知，溶磷菌MQR6对元宝枫有较好的促生作用，促进根系生长，提高养分吸收能力，提高养分利用率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明实质的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
中国林业科学研究院华北林业实验中心
一株高效溶磷菌MQR6及其发酵产物与应用
1
PatentIn version 3.5
1
1450
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
1
60 cggtgggcgg agctaccatg caagtcggac ggtagcacag gagagcttgctctccgggtg
120 acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgccc gatggagggggataactact
180 ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gtgggggaccttcgggcctc
240 acaccatcgg atgtgcccag atgggattag ctagtaggcg gggtaatggcccacctaggc
300 gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgagacacggtccag
360 actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcctgatgcagcca
420 tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcggggaggaaggcga
480 tgtggttaat aaccgcgtcg attgacgtta cccgcagaag aagcaccggctaactccgtg
540 ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgggcgtaaagcg
600 cacgcaggcg gtctgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacccgggaactgcatt
660 tgaaactggc aggcttgagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgtagcggtgaaat
720 gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaagactgacgct
780 caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtccacgccgtaaac
840 gatgtcgact tggatgttgt gcccttgacg cgtggcttcc ggagctaacgcgtttaagtc
900 gaccgccctg ggggagtacg gccgcaaagg tttaaaaacc tcaaaatgaaaaaggcgtgg
960 cttccggagc taacgcgtta agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaaggttaaaactc
1020 aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattcgatgcaacgc
1080 gaagaacctt acctactctt gacatccaga gaacttagca gagatgctttggtgccttcg
1140 ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaatgttgggtta
1200 agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt tgttgccagc gattcggtcgggaactcaaa
1260 ggagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcatcatggccctt
1320 acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg cgcatacaaa gagaagcgacctcgcgagag
1380 caagcggacc tcacaaagtg cgtcgtagtc cggatcggag tctgcaactcgactccgtga
1440 agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga atgccacggt gaatacgttcccgggccttg

Claims (11)

1.一株高效溶磷菌，其特征在于，名称为(Pantoea)MQR6，于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.23609。
2.根据权利要求1所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6，其特征在于，所述溶磷菌(Pantoea)MQR6含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6的发酵产物。
4.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物。
5.一种微生物肥料，其特征在于，含有权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物。
6.一种土壤改良剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物。
7.权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物或权利要求4所述的菌剂在降解难溶性磷酸盐中的应用。
所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。
8.权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物或权利要求4所述的菌剂在产IAA和/铁载体中的应用。
9.权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物或权利要求4所述的菌剂在促进植物生长中的应用。
10.权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物或权利要求4所述的菌剂在提升磷利用效率中的应用。
11.权利要求1或2所述的溶磷菌(Pantoea)MQR6或权利要求3所述的发酵产物或权利要求4所述的菌剂在制备微生物肥料和/或土壤改良剂中的应用。
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