CN116751767A - 胡杨PeDUB1基因在提高植物耐旱性和耐盐性上的应用 - Google Patents
胡杨PeDUB1基因在提高植物耐旱性和耐盐性上的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了胡杨PeDUB1基因在提高植物耐旱性和耐盐性上的应用，胡杨PeDUB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码PeDUB1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以胡杨(Populus euphratica)为材料，筛选鉴定出了PeDUB1基因，基于其过表达植株在干旱和盐胁迫下的表型鉴定，表明过表达PeDUB1能够提高应对干旱和盐胁迫的能力，说明PeDUB1正向调节植物的耐旱性和耐盐性，为筛选优势抗逆基因提供了新的选择，并且对深入阐明植物耐旱耐盐分子机理提供更多的依据。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及胡杨PeDUB1基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
干旱、高盐等不利环境因素已成为制约植物生长发育的主要因素。这些不利因素威胁着农业和林业生产，使其难以满足快速增长的全球人口需求。因此，解决干旱和高盐问题是实现农业和林业生产可持续发展的重要挑战。
胡杨(Populus euphratica)，属杨柳科杨属，是一种落叶的中型天然乔木。通常生长在极度干旱的沙漠地区。胡杨的韧性强，根系发达，因此对于荒漠地区的生态环境保护具有重要意义。此外，胡杨能够相对减缓上层土壤水分的蒸发速度，抑制土壤盐碱化的过程，从而在一定程度上提高土壤的利用效率。
研究表明，泛素介导的蛋白翻译后修饰对基因表达的调控至关重要。在蛋白质水平的调节中，泛素降解和去泛素修饰之间的平衡至关重要。去泛素化是指蛋白质中泛素被去除的过程，需要去泛素化酶(deubiquitylating enzyme,DUB)的介导。研究发现，去泛素化酶在植物对干旱、盐和镉胁迫的响应中起着重要的调控作用。例如，烟草NbUBP12基因的表达量在干旱处理下显著增强，通过ABA介导的气孔关闭调节抗旱能力；ubp24突变体对ABA和盐胁迫高度敏感；过表达玉米ZmUBP15、ZmUBP16或ZmUBP19可以提高植物对镉胁迫的耐受性；沉默辣椒CaUBP12基因和过表达CaUBP12的转基因植物分别表现出干旱敏感性和干旱耐受性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一个能提高植物耐旱性和耐盐性的基因及其应用。
本发明的技术方案为：
胡杨PeDUB1蛋白或其基因在提高植物耐旱性或/和耐盐性上的应用，所述胡杨PeDUB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述胡杨PeDUB1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述应用为将编码胡杨PeDUB1蛋白的基因在植物中过表达，从而提高植物耐旱性或/和耐盐性。
进一步地，所述过表达的方法为：将编码胡杨PeDUB1蛋白的基因转入植物过表达载体，通过农杆菌介导转入植株，通过分子技术筛选阳性植株。
进一步地，所述植物为胡杨或拟南芥。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以胡杨(Populus euphratica)为材料，筛选鉴定出了PeDUB1基因，基于其过表达植株的表型鉴定表明，其在干旱和盐处理下能够提高应对干旱和盐胁迫的能力，说明PeDUB1正向调节植物的耐旱性和耐盐性，为筛选优势抗逆基因提供了新的选择，并且对深入阐明植物耐旱耐盐性分子机理提供更多的依据。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的PeDUB1基因的克隆电泳图；
图2为本发明实施例2提供的将PeDUB1基因连接到植物表达载体得到的pCAMBIA1302-PeDUB1的质粒图谱；
图3为本发明实施例3提供的转基因拟南芥植株PCR鉴定电泳图；
图4为本发明实施例3提供的转基因拟南芥表达的定量数据示意图；
图5为本发明实施例4提供的异源表达PeDUB1基因的拟南芥和野生型拟南芥幼苗对干旱和盐胁迫响应示意图；
图6为本发明实施例4提供的异源表达PeDUB1基因的拟南芥和野生型拟南芥幼苗对干旱和盐胁迫处理下的根长和鲜重示意图；
图7为本发明实施例4提供的土壤中异源表达PeDUB1基因拟南芥和野生型南芥模拟干旱和盐处理对比示意图；
图8为本发明实施例4提供的干旱和盐处理下，相对含水量和相对电导率含量示意图；
图9为本发明实施例4提供的干旱和盐处理下，DAB和NBT染色示意图；
图10为本发明实施例4提供的干旱和盐处理下，SOD、POD、CAT含量示意图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1胡杨PeDUB1基因的克隆
以胡杨(Populus euphratica)为材料，收集足量叶片放入2ml无RNA酶离心管后迅速放入液氮，充分研磨后，使用RNAEasy Fast植物组织RNA快速提取试剂盒(-80℃保存待用)。将提取的胡杨叶片RNA通过FastKing RT Kit(With gDNase)试剂盒合成胡杨的cDNA(-20℃保存待用)。根据Phytozome数据库胡杨中序列号，查找出该序列，根据该序列使用primer 5软件设计引物，通过PCR进行基因全长(Coding sequence，CDS)扩增。基因克隆结果如图1所示。
其中，PeDUB1基因的CDS正向引物序列如下：
ATGGCGGATCAAGAAGAAGAG
其中，PeDUB1基因的CDS反向引物序列如下：
TCACACTATACTAGGCGGATCCC
利用宝日医生物技术(北京)有限公司的T-Vector pMDTM19和DNA Ligation Kit与PCR纯化产物进行连接，之后使用大肠杆菌DH5α进行转化，12-16小时后菌液PCR验证，送测序检测。
最终获得基因全长cDNA序列长度为1878bp，命名为PeDUB1基因，序列如SEQ IDNo.2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2胡杨PeDUB1植物表达载体的构建
将PeDUB1基因的CDS构建到35S启动子驱动的pCAMBIA1302植物表达载体。其中pCAMBIA1302使用NcoI(C↓CATGG)、SpeI(A↓CTAGT)进行双酶切使其线性化，PeDUB1基因通过PCR进行扩增(引物中加入15-20bp线性化载体同源臂)，利用诺唯赞公司的ClonExpress IIOne Step Cloning Kit进行连接。
其中，pCAMBIA1302-PeDUB1正向引物序列如下：
GGACTCTTGACCATGATGGCGGATCAAGAAGAAGAG；
其中，pCAMBIA1302-PeDUB1反向引物序列如下：
TTCTCCTTTACTAGTTCACACTATACTAGGCGGATCCC。
挑取重组反应转化平板上8个克隆进行菌落PCR鉴定，引物使用载体的上游和基因的下游，阳性结果经测序鉴定后待用，pCAMBIA1302-PeDUB1质粒图谱如图2所示。
实施例3胡杨PeDUB1基因的遗传转化和转基因拟南芥的筛选
通过蘸花法进行拟南芥的遗传转化，具体步骤如下：将实施例2构建得到的pCAMBIA1302-PeDUB1通过冻融法转化农杆菌，在卡那霉素(50mg/L)、利福平(50mg/L)的平板上生长2天挑取单菌落PCR检测，吸取鉴定为阳性的农杆菌菌液100μL至100mL含有卡那霉素和利福平的液体LB培养基进行扩大培养，28℃200rpm过夜振荡培养，使其OD600值达到0.8-1.2，6000rpm离心10min，去上清液。配置5％的蔗糖溶液100mL，重悬菌体沉淀，并加入30μL的Silwet L-77活化菌体；将每盆拟南芥的花浸染菌液45-60s，浸染后洒水湿润，并遮光培养12h，然后使其正常光照生长；一周后用同样的方法再次浸染一次，以提高转化效率。待拟南芥果荚成熟后，收集种子，并均匀平铺在含有25mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基内筛选转基因阳性拟南芥；约10-13天后，可以观察到培养基上拟南芥种子萌发生长情况，其中阳性苗含有抗旱基因，可以在含抗生素的培养基上正常生长，而阴性苗不能正常萌发生长而死亡。待阳性幼苗主根明显生长且长出两片真叶后，栽植到种植钵中继续培养，每一株拟南芥幼苗均为T1代，待拟南芥长出6-8片子叶时，剪取2-3片子叶使用CTAB法提取gDNA，并使用PeDUB1基因的上下游引物进行PCR鉴定，结果如图3所示10株拟南芥克隆得到的条带大小与PeDUB1基因大小一致，将获得10株阳性植株提取RNA，反转录后进行qRT-PCR进行定量，验证转PeDUB1拟南芥植株的表达量。
其中，PeDUB1-QF正向引物序列如下：
CTCCTTCCTTGTCGCATTCG
其中，PeDUB1-QF反向引物序列如下：
TCCTTCGAAACTCCACTCCC
结果如图4所示，选择表达量高的96-3、96-5植株，继续收集拟南芥种子，并按照上面的方法直到培育并筛选出拟南芥T3代的种子，留存备用。
实施例4胡杨PeDUB1基因的转基因拟南芥抗旱和抗盐鉴定
本实施例对转PeDUB1基因的拟南芥多个生理指标进行了分析，具体步骤如下：
1)在平板上甘露醇和盐处理下PeDUB1转基因拟南芥幼苗生长状态观察
将野生型拟南芥(WT)和PeDUB1转基因拟南芥(96-3和96-5)的种子使用次氯酸钠消毒后，在1/2MS固体培养基上播种。在4℃条件下进行3天的春化处理，然后转入正常条件下进行7天培养。之后将幼苗转移到1/2MS培养基(对照)、200mM甘露醇(干旱处理)，和150mMNaCl(盐处理)的1/2MS培养基中。两周后，测定WT和转基因植株的鲜重和根长。结果如图5所示，正常情况下WT和转基因幼苗的表型无显著差异，转基因拟南芥的根长(6.3～6.8cm)和鲜重(13～15mg)与WT差异不显著，或略高于WT。甘露醇处理后，转基因幼苗的根长为4.8-5.4cm，鲜重为8-11mg，而WT幼苗的鲜重和根长分别仅为5mg和3.5cm(图6中A和B)。盐处理下，转基因和WT幼苗的根长和鲜重均受到抑制(图5)，转基因幼苗的根长和鲜重分别为4.7-5.3cm和10-11mg，而WT幼苗分别为3.1cm和5mg(图6中A和B)。结果表明，过表达PeDUB1基因减轻了干旱和盐胁迫下幼苗的生长抑制，而且可以提高幼苗的耐干旱和耐盐能力。
2)在土中干旱和盐胁迫下PeDUB1转基因拟南芥成熟苗生长状态观察
将两周龄的拟南芥从培养基中转移到土壤中，在正常条件下培养两周后，对植物分别进行干旱和盐胁迫处理。干旱处理下，对植株停止浇水直到植物出现枯萎，然后复水3天。结果如图7所示，在干旱处理下，转基因植株的成活率为100％，而WT植株的存活率为0％。此外，进行了盐胁迫处理，每日用30ml 200mM NaCl灌溉植株，持续2周。结果如图7所示，在盐胁迫处理下，WT植株相比转基因植株的生长势较差，叶片枯萎变白；转基因拟南芥叶片呈深绿色。
3)相对含水量和相对电导率测定
叶片的相对含水量采用烘干称量法进行测定。首先对各组拟南芥样品的叶片进行采集，将这些采集到的新鲜叶片清洗干净，并且用滤纸吸干拟南芥叶片上面的水分，用电子秤称取叶片的鲜重，记作FW。然后将叶片分为均等的两份，将其中一份叶片装于纸袋中，并放置在电热鼓风干燥箱中进行杀青，温度设置在100-105℃，时间设定为15min中进行杀青。然后再将烘箱的温度调整为70-80℃，等叶片被烘干至恒重，用电子秤称量此时的干重，记作DW。将另一份叶片转入纯水中，放置60min后，等叶片达到恒重，再将叶片取出，并且用滤纸吸干拟南芥叶片上面的水分，用电子秤称取叶片的饱和含水量，记作SFW。此时，可以得出拟南芥叶片的相对含水量计算公式如下：
叶片相对含水量(％)＝(FW-DW)/(SFW-DW)×100％
相对电导率的测定参照李合生的方法，首先采集拟南芥的各组植株叶片，将这些采集到的新鲜叶片清洗干净，并且用滤纸吸干拟南芥叶片上面的水分，然后取出打孔器对拟南芥的叶片进行打孔，打孔注意要避开主叶脉，每个处理随机打出二十个叶圆片，将这些叶圆片放入小烧杯中，并在小烧杯中加入50mL的纯水，取出真空泵，将烧杯放入进行抽真空，共抽20min后，测定此时烧杯内液体的电导率，并将其记作R1。将小烧杯放入沸水浴加热20min，等其冷却至室温后再次测定其电导率，并记作R2。则可以得出相对电导率的计算公式如下：
相对电导率(％)＝R1/R2×100％。
结果如图8所示，在干旱和盐胁迫下，WT拟南芥的相对含水量(RWC)低于转基因植株(图8中A)，而相对电导率高于转基因植株(图8中B)。
4)DAB和NBT染色分析
DAB和NBT染色能用来观察植物体内活性氧(H2O2和O2-)含量和分布。
将1.97g的Tris-HCl定容到250mL，调节pH值至5.5，加入0.25g的DAB粉末摇匀，配置成1mg/mL的DAB染色液。将PBS缓冲液的A液91.5mL和B液85mL混匀后，定容到400mL，再加0.2g的NBT粉末摇匀，配置成0.5mg/mL的NBT染色液。向锥形瓶中加入体积比为1：1：3的乙酸、甘油和无水乙醇，混合摇匀，配制成脱色液。
取一个干净的50mL试管，将待测样品叶片放入其中，然后加入适量的染色液，使得染色液能够完全浸没，抽出试管内的真空，使叶片沉入管底，用锡纸包裹试管，放置在恒温培养箱中染色6-8小时，温度设置为37℃。染色完成后，用镊子夹取叶片放入脱色叶中，在水浴锅中100℃煮沸5min，直到叶绿素完全脱色，待冷却至室温后用无水乙醇进行清洗，并用滤纸吸干叶片表明的水分，观察叶片中活性氧的着色情况。结果如图9所示，在干旱和盐胁迫处理下，WT拟南芥的着色效果较深，而转基因植株的着色效果较浅，正常情况下无差异。
5)SOD、POD和CAT酶活性测定
抗氧化酶活性(SOD、POD和CAT)均采用索莱宝试剂盒在紫外分光光度计下进行检测。结果如图10所示，在正常条件下，转基因植株与WT植物的POD和SOD活性无显著差异(图10中A和B)，但CAT活性略高于WT植物(图10中C)。然而，在干旱和盐胁迫后，转基因植物的POD、SOD和CAT活性明显高于WT植物(图10中A-C)。
综上所述，PeDUB1通过提高抗氧化酶活性(SOD、POD和CAT)，维持活性氧的稳定，增强植物的耐旱性和耐盐性。
Claims (5)
1.胡杨PeDUB1蛋白或其基因在提高植物耐旱性或/和耐盐性上的应用，所述胡杨PeDUB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胡杨PeDUB1基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为将编码胡杨PeDUB1蛋白的基因在植物中过表达，从而提高植物耐旱性或/和耐盐性。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达的方法为：将编码胡杨PeDUB1蛋白的基因转入植物过表达载体，通过农杆菌介导转入植株，通过分子技术筛选阳性植株。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为胡杨或拟南芥。
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