CN114159425A - 川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了川陈皮素(Nobiletin,NOB)在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。本发明的实验结果表明在安全剂量范围内使用时，可以显著缓解坐骨神经慢性压迫性损伤模型诱发的痛觉超敏及痛觉过敏，改善坐骨神经的组织病理学变化并且调控痛觉相关因子的表达，证明川陈皮素具有缓解慢性压迫性损伤所导致的神经病理性疼痛并促进神经功能恢复的功能。

Description

川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途

技术领域

本发明涉及神经疾病治疗领域，具体地，本申请涉及川陈皮素的应用，特别涉及川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。

背景技术

神经病理性疼痛(neuropathic pain)是一种慢性疼痛综合征，其发病机制较为复杂，一般是由于神经系统功能发生异常或者受到损伤而产生的疼痛，常见于自身免疫性疾病(如多发性硬化)、代谢性疾病(如糖尿病性神经病变)、感染(带状疱疹后神经痛)、血管病(如卒中)、神经压迫、神经创伤和癌症等。神经病理性疼痛困扰着世界上1/6的人，不仅造成躯体本身的疼痛和功能障碍，同时还会伴发抑郁、焦虑等心理精神障碍，对患者的生活和生命质量产生严重影响，并给家庭、社会带来巨大负担。近年来，随着病理学、生理学、分子生物学及疼痛临床治疗技术的迅速发展，神经病理性疼痛的研究已取得较大进展。目前神经病理性疼痛的主要治疗药物多为抗抑郁药、非甾体类抗炎药、阿片类药物等，但这些药物因其各种不良反应，严重影响患者的生活质量，进而限制了在临床上的使用。因此进一步研究神经病理性疼痛的发病机制，在此基础上寻找安全性高、临床疗效好的治疗神经病理性疼痛的药物具有重要的学术价值和现实意义。

川陈皮素(Nobiletin，NOB)是中药陈皮中主要的多甲基黄酮类成分之一，具有神经保护、镇痛、抗炎等多种药理作用，研究发现，川陈皮素可以显著降低LPS诱导的BV2小胶质细胞丝裂原活化蛋白激酶、核转录因子-κB的磷酸化，进而减少炎症因子表达和释放。有研究报道，川陈皮素能对神经退行性病动物具有提高认知和学习能力的作用，更重要的是，这种神经保护作用主要依赖于其对中枢神经系统包括BDNF在内的多种神经营养信号的调节。陈皮的多甲基黄酮提取物能够缓解福尔马林、前列腺素诱导的小鼠疼痛。尚未见川陈皮素对周围神经损伤诱导的神经病理性疼痛镇痛作用的研究。将川陈皮素发展为治疗神经病理性疼痛药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的是通过对川陈皮素的药理作用研究，提供川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。

本发明提供川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，所述川陈皮素的结构式如式(1)所示：

式(1)。

进一步地，川陈皮素为药物中的唯一活性成分。

进一步地，所述神经病理性疼痛包含带状疱疹后神经痛，糖尿病外周神经痛，三叉神经痛，坐骨神经痛等，优选为外周神经损伤的神经病理性疼痛。

进一步地，其中所述药物为注射或者口服剂型。

进一步地，所述药物为口服剂型。

另一方面，本发明提供了抑制疼痛的治疗方法，包括施用川陈皮素。

进一步地，所述川陈皮素单次应用剂量为30-120mg/kg。

进一步地，所述川陈皮素单次应用剂量为60-120mg/kg。

进一步地，所述川陈皮素单次应用剂量为120mg/kg。

本申请中的治疗方法包括但不限于科学研究方法，实施对象可以为人或其他哺乳动物如鼠、兔、犬等。

神经病理性疼痛包含带状疱疹后神经痛，糖尿病外周神经痛，三叉神经痛，坐骨神经痛等，优选外周神经损伤的神经病理性疼痛，具体症状或指症包括但不限于机械痛觉超敏、冷痛觉超敏、热痛觉过敏、坐骨神经疼痛、神经传导速度变慢、神经动作电位振幅减小、脊髓组织中疼痛相关蛋白表达异常。

本申请的可用的药物剂型包括各种注射和口服剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂、透皮给药制剂，特别优选口服剂型。

除川陈皮素外，本申请中所述的药物还可以包括药学上可接受的各种辅料/赋形剂，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂等，特别优选可用于口服剂型的各种辅料/赋形剂。

本发明的药物中可以包含其他神经病理性疼痛的中西药药物或保健品，或者本发明的药物可以与这些中西药药物或保健品或手术等治疗手段联合使用。所述中西药药物或保健品包括但不限于各种止痛药，消炎药，精神疾病药物等。

本发明提供的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途具有以下有益效果：

(1)川陈皮素能显著缓解机械痛觉超敏、冷痛觉超敏和热痛觉过敏；

(2)川陈皮素能改善受损的坐骨神经，增加神经传导速度及复合肌肉动作电位振幅，显著降低了脊髓组织中疼痛相关因子P2X4R、BDNF的表达，显著增加脊髓组织中KCC2蛋白的表达。

本发明首次发现，川陈皮素具有治疗坐骨神经慢性压迫性损伤所致神经病理性疼痛的作用，可用于制备神经病理性疼痛的治疗药物。

附图说明

图1为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛的机械缩足反射阈值图。

图2为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛的热缩足反射潜伏期图。

图3为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛的冷抬足次数图。

图4为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经复合动作电位图(图4a为假手术组，图4b为假手术组+川陈皮素(120mg/kg)，图4c为模型组，图4d为川陈皮素(30mg/kg)组，图4e为川陈皮素(60mg/kg)组，图4f为川陈皮素(120mg/kg)组)。

图5为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛的复合肌肉动作电位振幅统计图。

图6为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛的感觉神经传导速度统计图。

图7为川陈皮素对神经病理性疼痛小鼠行HE染色的坐骨神经纵向结构变化图(图7a为假手术组，图7b为假手术组+川陈皮素(120mg/kg)，图7c为模型组，图7d为川陈皮素(30mg/kg)组，图7e为川陈皮素(60mg/kg)组，图7f为川陈皮素(120mg/kg)组)。

图8为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织P2X4R蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^**p<0.01(

n＝6))。

图9为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织BDNF蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^**p<0.01(

n＝6))。

图10为川陈皮素对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织KCC2蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^**p<0.01(

n＝6))。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，以下实施例中使用的川陈皮素均为前述式(1)所示的化合物，可通过商购获得。

实施例1

川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的的神经病理性疼痛，川陈皮素单次应用剂量为小鼠30mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例2

川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的的神经病理性疼痛，川陈皮素单次应用剂量为小鼠60mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例3

川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的的神经病理性疼痛，川陈皮素单次应用剂量为小鼠120mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

雄性ICR小鼠，18-22g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：NCXK(宁)2015-0001。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

川陈皮素(上海源叶生物科技有限公司)，以0.5％生理盐水配制，现配现用。戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich公司),普瑞巴林胶囊(辉瑞制药有限公司),von Frey Filaments(Danmic Global,美国)，冷板仪(BIOSEB科技仪器公司，法国),PL-200热刺痛仪(成都泰盟科技公司)，兔抗P2X4R、BDNF、KCC2(购自Proteintech公司)，酶标仪(1510，Thermo Fisher公司)，电泳仪、电转仪(Powerpac basic,美国Bio-Rad公司)，多色荧光成像系统(美国Azure，c400)。

1.3实验动物分组及给药

小鼠随机分为假手术组，慢性压迫性损伤(CCI)模型组，川陈皮素不同剂量组(30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg)及普瑞巴林阳性药物组。小鼠在手术造模后，川陈皮素不同剂量组及普瑞巴林阳性药物组给药(给药量0.1ml/10g体重，灌胃给药，每隔24小时一次)。假手术组和模型组同法给予等量的羧甲基纤维素钠。在CCI造模后的第0，7，8，10，12，14天进行行为学、电生理学、组织病理学和分子生物学等药效学评价。

1.4小鼠慢性压迫性损伤(CCI)模型建立

通过对小鼠坐骨神经进行结扎，建立慢性缩窄性损伤致神经病理性疼痛动物模型。小鼠称重后，采用0.85％戊巴比妥钠注射液以0.1ml/10g的剂量腹腔注射对小鼠进行麻醉。麻醉后，将小鼠俯卧位置于消毒后的手术台上，在右侧臀股交界处剪毛备皮，碘伏消毒液进行皮肤表面消毒，用手术剪在此处沿坐骨神经走行方向剪开约1cm的切口，顺着肌纹，用玻璃挑针钝性分离股二头肌和臀肌,使坐骨神经主干暴露出来，用消毒并用酒精浸泡过的4-0医用铬制羊肠线对暴露的坐骨神经主干进行3个间距为1mm的松弛结扎，逐层缝合肌肉层及皮肤。为避免结扎力度过大引起组织坏死，应以结扎侧肢发生细微的颤动为准，以避免神经外膜的血液流动受到干扰。

二、实验过程

(一)行为学参数测定

1.1实验方法：

测定机械缩足反射阈值(paw withdrawal threshold,PWT)：将一有机玻璃箱(22×12×22cm)置于金属筛网上，待小鼠在箱中适应15min后，用von Frey纤毛机械刺激器垂直刺激小鼠后肢足底中部，持续时间≤4秒，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。刺激由小到大，每个强度反复刺激10次(次－次间隔3～5s)，将出现缩足反射5次左右的强度定为PWT。

测定冷抬足次数：于安静环境中，将小鼠放在温度为4℃的冷板仪的金属冷板上，其活动采用玻璃罩加以限制，待其适应约5min左右安静下来后，观察并记录小鼠手术侧肢在5min内的的抬足次数，即为冷缩足反射次数。

测定热缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，将小鼠放人有机玻璃箱内，使其自由活动30min以适应测试环境和温度。用PL-200型热痛刺激仪照射小鼠足底。照射开始至小鼠出现抬腿回避时间为PWL。刺激部位为紧贴玻璃板的手术侧后爪部分。当后爪移动时，停止照射。照射自动切断时间为20秒，以防止足部灼伤。整个实验中，热刺激强度保持相同。重复刺激三次，取PWL的平均值。

1.2实验结果：

手术前各组小鼠的PWT(图1)、PWL(图3)和冷抬足次数(图2)均无显著差异。在手术后第7天，与假手术组相比，其它各组小鼠的PWT，PWL均明显降低(P﹤0.01)，冷抬足次数明显升高(P﹤0.01)。在造模后8、10、12、14天，与模型组相比，川陈皮素(120mg/kg)组及普瑞巴林(50mg/kg)组的PWT、PWL均显著升高，冷抬足次数明显降低(P<0.01)；川陈皮素(30mg/kg、60mg/kg)组在造模后8、10、12、14天，与模型组相比，冷抬足次数明显降低(*P﹤0.05,**P﹤0.01)；而川陈皮素(30mg/kg)组在造模后8、10、12、14天的PWT、PWL无显著性差异(P>0.05)。

(二)电生理学测定

2.1实验方法：

坐骨-腓神经电生理活动的观测：小鼠麻醉后，于造模时相同的部位切口打开，钝性分离肌肉及筋膜，暴露出坐骨神经主干至坐骨切迹及远端羊肠线结扎处，分离过程需用温热的石蜡油对坐骨神经进行保护。将针灸针制成钩状并连接在刺激电极的鳄鱼夹上，将连接在鳄鱼夹上的钩状针灸针钩在接近坐骨切迹处的坐骨神经干上，记录针电极分别插在小鼠足踝部及足底第二与第三趾间肌肉中，参比电极置于受坐骨神经支配的腓肠肌内，两个参比电极的距离约为5mm。测试过程中以生理盐水为导电的介质，并要根据具体情况及时补充。将上述各电极连接BL-420F生物机能实验系统，实验项目选择“肌肉神经实验”子选项中的“神经干兴奋传导速度的测定”，设定好参数值。测量并记录一下数据：①两个电极所记录的动作电位潜伏期并计算其差值(两个波峰之间的时间差)，即潜伏期之差△t；②两记录电极之间的距离s；③感觉神经动作电位振幅(sensory nerve action potentialsamplitudes，SNAP amplitudes)即动作电位波峰与波谷间的距离。以上数据中的①和③均选取三个动作电位波形图进行数据统计，取其均值作为最终统计数据。神经传导速度(nerve conduction velocity，NCV)计算方法为记录电极之间距离比上潜伏期之差，即NCV＝s/△t。根据此公式计算感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity，SNCV)。

2.2实验结果：

各组小鼠在造模后的14天，与假手术组相比，模型组小鼠复合肌肉动作电位振幅明显下降并且潜伏期明显增长(图4，图5)，a-f分别表示假手术组、模型组、普瑞巴林组、川陈皮素组(30、60、120mg/kg)。与假手术组相比，模型组小鼠的感觉神经传导速度显著降低(##P<0.01)(图6)。与模型组相比，川陈皮素(60、120mg/kg)组小鼠在造模后的14天复合肌肉动作电位振幅和感觉神经传导速度显著增高(**P﹤0.01)(图5，图6)；川陈皮素(30mg/kg)组小鼠在造模后的第14天复合肌肉动作电位振幅和感觉神经传导速度显著增高(*P﹤0.05)(图5，图6)。

(三)HE染色观察坐骨神经组织病理学变化

3.1实验方法：

将坐骨神经组织切片在80℃的恒温箱内烘烤过夜后，进行苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE staining)染色：

①脱蜡：依次浸于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(10min)；

②复水：梯度酒精各个2-4分钟进行复水，(无水Ⅰ，无水Ⅱ，95％，85％，80％和70％)，表面的酒精再以蒸馏水洗净；

③染色：在盛有苏木素染料的染缸中浸泡4min，拿出载玻片用流水冲洗，在1％的盐酸酒精溶液中分化5s，流水冲洗，再放入伊红染色缸中2min，水洗3次；

④脱水：依次浸泡于70％乙醇(30s)、80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，无水乙醇Ⅰ(2min)，无水乙醇Ⅱ(2min)；

⑤透明：二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min)；

⑥封片：切片上滴加中性树胶，封片，光学显微镜观测组织病理学改变。

3.2实验结果：

如图7：a-f分别表示假手术组、假手术组+川陈皮素(120mg/kg)、模型组、川陈皮素组(30、60、120mg/kg)。假手术组坐骨神经纤维束排列整齐，染色均匀，轴突红色深染，髓鞘不着色，整齐排列于轴突两侧；假手术+川陈皮素(120mg/kg)与假手术组相比无差异；模型组出现神经纤维断裂，组织结构散乱，出现大量轴突变性，髓鞘退化，同时伴有炎性细胞浸润；川陈皮素(30、60、120mg/kg)组组织结构改变有所改善，排列较紧密，虽然仍有大量断裂的神经纤维，但是炎性细胞浸润以及髓鞘退化现象明显减少，其中川陈皮素120mg/kg对坐骨神经的改变尤其明显。

(四)Western blot检测神经病理性疼痛小鼠脊髓中P2X4R、BDNF和KCC2蛋白的表达

4.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，用将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)进行湿法转膜。转膜结束后取出聚偏二氟乙烯膜，将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭1h。封闭结束后孵育抗体稀释液稀释的一抗，4℃过夜，室温复温1h，洗膜孵育二抗。用PBST洗PVDF膜4次，每次5min。滴加蛋白化学发光剂(ECL)，多色荧光成像系统(美国Azure，c400)对PVDF上每个目的条带进行扫描和图像分析。

7.2实验结果：

如图8至图10，与假手术组比较，模型组P2X4R、BDNF蛋白表达明显增加(##P<0.01)；如图8至图10所示，与模型组比较，川陈皮素(120mg/kg)组小鼠脊髓组织P2X4R、BDNF蛋白表达明显减少(**P﹤0.01)，川陈皮素(120mg/kg)组小鼠脊髓组织KCC2蛋白表达明显增加(**P﹤0.01)。提示川陈皮素的保护作用可能通过抑制P2X4R/BDNF/KCC2信号通路，恢复GABA中间神经元对于伤害性刺激的抑制，从而对小鼠慢性压迫性损伤致神经病理性疼痛产生保护作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，所述川陈皮素的结构式如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，其中川陈皮素为药物中的唯一活性成分。

3.根据权利要求1或2所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，所述神经病理性疼痛包含带状疱疹后神经痛，糖尿病外周神经痛，三叉神经痛，坐骨神经痛。

4.根据权利要求1或2所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，所述神经病理性疼痛为外周神经损伤的神经病理性疼痛或坐骨神经慢性压迫性损伤所致神经病理性疼痛。

5.根据权利要求1或2所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，所述神经病理性疼痛具体症状或指症包括但不限于机械痛觉超敏、冷痛觉超敏、热痛觉过敏、坐骨神经疼痛、神经传导速度变慢、神经动作电位振幅减小、脊髓组织中疼痛相关蛋白表达异。

6.根据权利要求1或2所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，所述用途包括改善受损的坐骨神经，增加神经传导速度及复合肌肉动作电位振幅，降低了脊髓组织中疼痛相关因子P2X4R、BDNF的表达，显著增加脊髓组织中KCC2蛋白的表达。

7.治疗神经病理性疼痛的药物组合或组合物，其特征在于，包含川陈皮素和药学上可接受的各种辅料/赋形剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合或组合物，其特征在于，所述可接受的各种辅料/赋形剂，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂。

9.根据权利要求7所述的药物组合或组合物，其特征在于，其中所述组合物的剂型包括注射、口服及透皮给药剂型。

10.根据权利要求7所述的药物组合或组合物，其特征在于，其中所述组合物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂。

11.根据权利要求7所述的药物组合或组合物，其特征在于，其中所述组合，是川陈皮素与其他药物或保健品组合。

12.根据权利要求11所述的药物组合或组合物，其特征在于，其中所述药物或保健品包括但不限于各种止痛药，消炎药，精神疾病药物。

13.根据权利要求11所述的药物组合或组合物，其特征在于，其中所述药物或保健品为治疗神经病理性疼痛类。

14.根据权利要求1或2所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，所述的药物，其中川陈皮素单次应用剂量为30-120mg/kg。

15.根据权利要求1或2所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，所述的药物，其中川陈皮素单次应用剂量为60-120mg/kg。

16.根据权利要求1或2所述的川陈皮素在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其特征在于，所述的药物，其中所述川陈皮素单次应用剂量为120mg/kg。

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