CN114129587A - 用于治疗骨质疏松症的纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗骨质疏松症的纳米药物及其制备方法和应用，该纳米药物包括DNA适配体Aptscl56和PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒，通过将DNA适配体接枝在所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒上获得本发明的纳米药物。本发明的纳米药物能特异靶向至骨组织，并能有效中和骨组织环境中的骨硬化蛋白，达到高效治疗骨质疏松症的功效。

Description

用于治疗骨质疏松症的纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及分子生物医药领域，具体而言，涉及一种用于治疗骨质疏松症的纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
骨质疏松症(Osteoporosis,OP)，是一种系统性骨骼疾病，以低骨矿物质密度(bone mineral density,BMD)和骨组织的微结构退化为特征，从而增加骨的脆弱性和骨折的易感性。OP可分为两大类：原发性OP和继发性OP。前者可发生在所有性别和年龄段，但多发于绝经后妇女和50岁以上的中老年男性中；后者主要由于药物使用(如糖皮质激素、免疫抑制剂)以及多种疾病(如库欣综合征、甲状旁腺功能亢进、肾病、糖尿病、多发性骨髓瘤、维生素D缺乏和性腺功能减退)所引起。骨质疏松性骨折(Osteoporotic fracture,OF)，如髋部、椎体和前臂远端等骨折致死率和致残率很高，且治疗费用巨大。OP与口腔疾病的发生和发展也有极大的关系。有文献报道，OP与牙周炎互为危险因素，即OP可以增加牙周炎的严重程度，而患有牙周炎的OP患者更容易发生OF。另外，在常规使用双膦酸盐(Bisphosphonate，BP)类药物治疗OP过程中，有可能引起颌骨骨坏死。这进一步为OP患者带来了痛苦和沉重的经济负担，也为口腔疾病治疗，如口腔修复、口腔种植术以及牙周系统治疗带来了很大的困难。因此，有必要增加对OP发生机制以及新治疗方案的研究，以尽量减少OF对健康的影响和医疗花费。
OP治疗的最终目标是通过改善骨量，肌肉力量和耐力来开发一种降低骨折风险的治疗方法，特别是非椎骨和髋部骨折。这将降低跌倒损伤的风险，缩短康复时间并减少由于骨折引起的残疾。限制骨质流失的治疗策略主要分为两大类，针对破骨细胞的抗再吸收药物，以及能够激活成骨细胞的骨形成促进剂或合成代谢药物。目前临床中，抗再吸收药物，如BP类药物及其衍生物，已经占据了大部分OP治疗市场，它主要通过抑制破骨细胞活性来保留骨量和增加骨强度。但是BP类药物一方面只能抑制骨吸收，而不能促进骨生成；另一方面长期服用BP类药物会有较多副作用，如食管炎和颌骨骨坏死。合成代谢药物能够诱导骨形成并且可以逆转由OP进展产生的骨质恶化，主要包括雌激素，骨形成蛋白(BMPs)，甲状旁腺激素(rPTH)以及其含有34个氨基酸片段的多肽药物——特立帕肽(Teriparatide)。虽然这类药物有较强刺激成骨的能力，但是过量使用会引起高钙血症、炎症、不确定的致癌性及异位成骨等问题。考虑到这些，研发高效且无副作用的OP治疗系统，是当今OP及其相关口腔疾病治疗的主要目标。
近年来，Wnt(Wingless-INT)/β-catenin信号通路在骨代谢过程中的作用备受关注。这条通路始动于Wnt蛋白与由Frizzled跨膜蛋白受体相结合。之后，它们会与低密度脂蛋白受体相关蛋白(lipoprotein receptor-related protein，LRP)家族(包括LRP4，5和6)组成的受体复合物进一步结合，从而激活此通路。Wnt通路活化会使细胞膜内的β-catenin处于稳定状态，并进入细胞核内激活相关基因的转录过程。这种经典Wnt信号通路可以控制间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)分化，使软骨向和脂肪向分化得到抑制，而成骨向分化得到增强。经典Wnt信号通路能促进成骨细胞成熟以及成骨细胞和骨细胞存活，并通过增加成骨细胞和骨细胞分泌的骨保护素(osteoprotegerin，OPG)去结合核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,Rankl)，从而抑制破骨细胞生成。因此，Wnt/β-catenin信号通路激活对于促进骨形成和减少骨吸收至关重要。
骨硬化蛋白(Sclerostin)是由成熟骨细胞分泌的Wnt/β-catenin信号通路细胞外抑制因子。它是由SOST基因编码的短棒状糖蛋白，含有190个氨基酸，分子量23kD，大小约为2-5nm。它会与LRP4/5/6结合，拮抗下游信号传导。患有遗传性骨硬化蛋白缺失或减少疾病的患者，例如硬化性骨病(Sclerosteosis)或Van Buchem病等，都会表现出骨量增加的症状，而这些病人几乎不会出现骨折的情况。基于对这种高骨量表型的深入研究，骨硬化蛋白已经成为OP治疗的公认目标。目前为止，研究人员已经开发了多种抗骨硬化蛋白的单克隆抗体(anti-Sclerostin monoclonal antibody，Scl-Ab)，如Blosozumab和Romosozumab。Scl-Ab能够特异性中和体液中的骨硬化蛋白，从而通过激活骨衬里细胞、募集骨祖细胞和增加成骨细胞活性三种方式促进骨形成。Scl-Ab引起了骨细胞中破骨细胞调节因子表达变化，如OPG、Rankl和colony stimulating factor 1(CSF1)等，因此减少了骨吸收。另外，Scl-Ab还能够调节骨细胞中成骨细胞调节因子的表达，如WISP1、transmembrane protein119(TMEM119)和Dickkopf1(DKK1)等。经过临床前期以及临床三期的实验研究，Romosozumab已经正式被FDA批准上市，成为OP治疗以及减少OF风险的重要药物。但是蛋白质抗体类药物存在运输及储存中的不稳定性，潜在的免疫原性以及高昂的售价等问题，这阻碍了其应用。因此，研发更加经济有效的骨硬化蛋白中和药物是OP治疗研究中的热点问题。
适体(Aptamer)是短的单链DNA或RNA(通常是DNA)分子，长度从10到100个碱基不等，于1990年通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)首次被分离得到。通过其分子内碱基互补作用，可以形成多种二级结构，包括茎(stems)，内环(internal loops)，富含嘌呤的凸起(purine-richbulges)，发夹结构(hairpin structures)，假结(pseudoknots)，接吻复合物(kissingcomplexes)和G-四链体结构(G-quadruplex)等。这些二级结构可以进一步通过氢键，范德华力，形状互补，碱基堆积，疏水和静电相互作用等形成特定的三维构象，与目标配体以很高特异性和亲和力结合在一起。迄今为止，已经有数以千计的针对广泛靶标的适体被筛选出来，包括金属离子、有机小分子、多肽、高分子蛋白质、病毒、细菌、活体细胞甚至活体动物中的靶标。他们已经被应用于调节靶功能和定位，递送其他活性分子，以及用于不同治疗，诊断和分析策略中。FDA已批准部分适体上市，还有很多针对于适体的研究正处于临床前或临床实验阶段。
适体已逐渐被当作未来单克隆抗体的替代物。香港浸会大学Ge Zhang教授的研究团队在2016年筛选出了可以高效并特异性与骨硬化蛋白亲和的适体—Aptscl56。这个DNA药物获得FDA批准治疗幼儿的成骨发育不全。但是并没有在成人骨质疏松症的治疗领域获得批准。Aptscl56适体与骨硬化蛋白具有很强的结合能力，从而抑制骨硬化蛋白分子与LRP5结合。细胞实验进一步证明了Aptscl56适体能够抑制骨硬化蛋白对Wnt/β-catenin信号传导的拮抗作用。
纳米药物运载系统(Nano-sized drug delivery systems，NDDS)在骨病的治疗领域，如OP等，越来越受到关注。通过适当的方法，可以在NDDS的主体，即纳米颗粒(nanoparticle，NP)表面修饰不同分子。在现阶段，大多数的NDDS都存在显著的局限性，即未经特定修饰的NP在血液中很难长期稳定地循环并发挥作用。这主要是由于血液中的蛋白质成分会非特异性地包裹在NP表面，形成“蛋白质冠”，从而团聚沉淀，并被网状内皮系统(reticule endothelial system，RES)中的巨噬细胞识别和清除。这也是目前NDDS无法真正推向临床应用很关键的一个问题，能显著降低NDDS的快速血液清除率。到目前为止，申请人没有发现有文献报道将DNA适体与纳米材料结合进行OP治疗的研究。
发明内容
本发明提供了一种用于治疗骨质疏松症的纳米药物，所述纳米药物通过将DNA适配体Aptscl56接枝在PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒上获得。
具体的，(1)所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为60-70nm；
(2)所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒是将分子量为2000的聚乙二醇衍生物接枝到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒上；
(3)所述DNA适配体Aptscl56的5’端氨基化；
(4)将5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56与所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒通过碳化二亚胺催化氨基-羧基的缩合反应接枝到一起，获得所述纳米药物。
更具体的，(1)将作为模板的十六烷基三甲基氯化铵与作为催化剂的三乙醇胺混合，之后加入正硅酸四乙酯的环己烷溶液，在加热条件下反应3小时，过滤去除杂质，用酸性甲醇溶液超声重悬洗涤，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)将介孔二氧化硅纳米颗粒分散到无水乙醇后，加入浓氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应得到所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(3)所述分子量为2000的聚乙二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基和N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇；
(4)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，将氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在DMF中形成分散液2，将溶液1和分散液2缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜DMF中超声重悬清洗，加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，室温下反应24小时后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(5)所述DNA适配体Aptscl56是通过将其DNA分子做如下预处理操作获得：将预先合成的单链DNA分子在磷酸盐缓冲液中溶解后，通过高温变性和降温退火的过程使溶液中原本纠缠在一起的单链DNA分子分散开，每个分子会在特定部位通过形成内部氢键而发生折叠，形成可以与目标分子特异性结合的“三叶草”样的三维结构。
更具体的，(1)每48ml的25％的十六烷基三甲基氯化铵溶液与72ml的去离子水混合后，加入0.36g三乙醇胺作为催化剂，在60℃油浴加热条件下维持一小时，得到反应液1；取20ml 20％(v/v)正硅酸四乙酯的环己烷溶液加入反应液1中，持续低速搅拌三小时后，使用分液漏斗获得水相液体，通过孔径0.22微米的滤膜将水相液体中的杂质过滤掉，36000g高速离心90分钟，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)每500mg介孔二氧化硅纳米颗粒分散到50ml无水乙醇后，加入1ml的28-30％的浓氨水和4ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，25℃反应24小时后，36000g高速离心-无水乙醇中超声重悬三次，得到所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(3)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在N,N-二甲基甲酰胺中形成分散液1，按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基的比例将溶液1和分散液1缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜N,N-二甲基甲酰胺中超声重悬清洗，获得第一个中间产物；按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇的比例，在第一个中间产物中加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，室温反应24小时之后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(4)每200nmol 5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56、10mg PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒、0.959mg催化剂碳化二亚胺和0.288mg稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺分散到10mlpH＝6的0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中；37℃搅拌反应24h，在去离子水环境中36000g高速离心-清洗，得到用于治疗骨质疏松症的纳米药物。
本发明还提供一种用于治疗骨质疏松症的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
1)将60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒分散到无水乙醇后，加入浓氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
2)选用两种分子量为2000的聚乙二醇衍生物接枝到步骤1)所获得的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒上制备出PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
3)选用5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56，将其接枝到步骤2)所得的PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒上，获得所述纳米药物。
具体的，(1)将作为模板的十六烷基三甲基氯化铵与作为催化剂的三乙醇胺混合，之后加入正硅酸四乙酯的环己烷溶液，在加热条件下反应3小时，过滤去除杂质，用酸性甲醇溶液超声重悬洗涤，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)所述分子量为2000的聚乙二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基和N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇；
(3)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，将氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在DMF中形成分散液2，将溶液1和分散液2缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜DMF中超声重悬清洗，加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，之后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(4)所述DNA适配体Aptscl56是通过将其DNA分子做如下预处理操作获得：将预先合成的单链DNA分子在磷酸盐缓冲液中溶解后，通过高温变性和降温退火的过程使溶液中原本纠缠在一起的单链DNA分子分散开，每个分子会在特定部位通过形成内部氢键而发生折叠，形成可以与目标分子特异性结合的“三叶草”样的三维结构。
更具体的，(1)每48ml的25％的十六烷基三甲基氯化铵溶液与72ml的去离子水混合后，加入0.36g三乙醇胺作为催化剂，在60℃油浴加热条件下维持一小时，得到反应液1；取20ml 20％(v/v)正硅酸四乙酯的环己烷溶液加入反应液1中，持续低速搅拌三小时后，使用分液漏斗获得水相液体，通过孔径0.22微米的滤膜将水相液体中的杂质过滤掉，36000g高速离心90分钟，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)每500mg介孔二氧化硅纳米颗粒分散到50ml无水乙醇后，加入1ml的28-30％的浓氨水和4ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，25℃反应24小时后，36000g高速离心-无水乙醇中超声重悬三次，得到所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(3)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在N,N-二甲基甲酰胺中形成分散液1，按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基的比例将溶液1和分散液1缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜N,N-二甲基甲酰胺中超声重悬清洗，获得第一个中间产物；按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇的比例，在第一个中间产物中加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，室温反应24小时之后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(4)每200nmol 5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56、10mg PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒、0.959mg催化剂碳化二亚胺和0.288mg稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺分散到10mlpH＝6的0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中；37℃搅拌反应24h，在去离子水环境中36000g高速离心-清洗，得到用于治疗骨质疏松症的纳米药物。
本发明还提供一种前述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物在制备治疗或预防骨质疏松症或口腔疾病相关药物中的应用。
本发明还提供一种前述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物的制备方法在制备治疗骨质疏松症或口腔疾病相关药物中的应用。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明选用了具有三维树枝状结构的小粒径介孔二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticle，MSN)作为主体材料，这种纳米颗粒具有60-70nm的粒径，它不但能够满足透出毛细血管、达到骨质表面的需求，同时在制备过程中还可以方便地通过离心的方式收集。另外，本发明采用的MSN在各种溶剂中都具有非常好的分散性能且没有细胞毒性。这种MSN孔壁很薄，在PBS的环境下，会缓慢降解，从而能够克服实心二氧化硅纳米颗粒在生理环境不易降解，有可能在肺等器官堆积的缺点。
(2)通过分子生物学实验，我们发现本发明DNA适配体与羟基磷灰石(HA，骨基质中的主要无机成分)具有很强结合能力。这主要是DNA分子的磷酸骨架与HA中的钙离子通过静电作用产生的。实验结果显示，游离DNA分子注入体内后会大量结合在骨基质表面，从而失去结合骨硬化蛋白的能力。接枝DNA适配体的纳米药物(DNAM)会在DNA分子的作用下其一侧会特异性地与骨面结合，同时纳米颗粒另外一侧的DNA分子仍然具有中和骨硬化蛋白的功能。另外，DNAM可以很好的保护其表面的DNA分子不被DNA酶降解。
(3)通过体内和体外实验的验证，本发明的纳米药物可以结合环境中的骨硬化蛋白，从而降低其浓度。同时，本发明的纳米药物可以在细胞水平和体内环境有效激活Wnt通路，实现治疗OP的目的。我们在构建的雌性ICR小鼠卵巢去势模型中发现，采用本发明纳米药物的治疗组与对照组相比，骨量增加了四倍。不仅如此，仅含有5nmol的DNA分子的纳米药物组比使用5nmol游离DNA组展现了更好的治疗效果。力学，组织学以及血清学指标实验都证明了相同的结果。通过将DNA适配体Aptscl56接枝到PEG改性的MSN表面，然后通过血液循环将此纳米药物运送并富集到骨基质表面，安全有效且经济地实现中和其周围的骨硬化蛋白，从而促进骨生成和抑制骨吸收，达到治疗OP、预防OF以及降低相关口腔疾病危险因素的目的。
(4)本发明的纳米药物的制备方法具有操作步骤简单、合成方法和产品稳定性好稳定、成本低廉，通用性强、无特殊设备需求的特点。利用该方法制备的DNA适配体接枝的介孔二氧化硅纳米药物能特异靶向至骨组织，并能有效中和骨组织环境中的骨硬化蛋白，达到高效治疗骨质疏松症的功效。含有同样DNA剂量的纳米药物相比使用游离DNA适配体治疗骨质疏松症具有更好的疗效。
附图说明
图1为纳米药物DNAM的透射和扫描电镜图，其中，图1-i为DNAM透射电镜高倍率图，图1-ii和图1-iii分别为DNAM的透射电镜的磷(P)和硅(Si)元素分布图，图1-iv为图1-i到iii的融合图，图1-v和图1-vi分别为DNAM样品的低倍率透射和扫描电镜图；
图2为游离DNA适配体与DNAM表面的DNA分子在DNA降解酶I环境中不同时间点降解的情况；
图3为游离DNA适配体、DNAM和PEGM在不同时间点在小鼠骨面附着的情况；
图4为DNAM以及不同的对照组样品注射到骨质疏松症模型小鼠体内后治疗骨质疏松症情况的CT重建图，其中图4-ⅰ到iii以及4-vii到xi为不同组小鼠股骨的矢状面观图片；图4-iv到vi以及4-x到xii为不同组小鼠股骨的冠状面观图片；
图5为对骨质疏松症小鼠注射DNAM及对照组样品进行治疗后体内骨硬化蛋白浓度变化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、兼具骨组织特意靶向性及骨质疏松症治疗功效的介孔二氧化硅纳米药物的制备方法
包括如下步骤：
1)将48ml的25％的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)溶液与72ml的去离子水混合后，加入0.36g三乙醇胺(TEA)作为催化剂，在60℃油浴加热条件下维持一小时，等待CTAC胶束自组装成模板；将正硅酸四乙酯(TEOS)按20％比例(v/v)混合到环己烷中，用乳胶滴管吸取20ml加入上述CTAC与TEA反应物中，形成上层油相溶液和下层水相溶液。在60℃油浴加热条件下持续低速搅拌三小时后，水层溶液会逐渐变成淡淡的乳白色。使用分液漏斗获得水相液体后，通过孔径0.22微米的滤膜将水相液体中的杂质过滤掉，36000g高速离心90分钟得到产物记为CTAC@MSN；按照10：1的比例混合无水甲醇和37％的浓盐酸，得到酸性甲醇溶液，将CTAC@MSN在酸性甲醇溶液中超声重悬后，在60℃搅拌6小时以溶解出介孔中的CTAC，重复清洗三次后得到60-70纳米的介孔二氧化硅纳米颗粒，记为MSN。
2)取500mg MSN通过36000g高速离心和水浴超声处理将其分散到50ml无水乙醇中，加入1ml的28-30％的浓氨水，和4ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在25℃反应24小时后，36000g高速离心-无水乙醇中超声清洗三次，即得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒，记为MSN-NH2。
3)将步骤2)获得的MSN-NH2离心，取沉淀分散在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中形成MSN-NH2的DMF分散液；将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物——N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基(NHS-PEG-COOH)(西安瑞禧生物科技有限公司)溶解在DMF中形成NHS-PEG-COOH的DMF溶液，之后按照每毫克MSN-NH2对应500nmol NHS-PEG-COOH的比例将MSN-NH2的DMF分散液和NHS-PEG-COOH的DMF溶液缓慢混合；室温下反应24小时后，使NHS-PEG-COOH通过NHS基团与氨基的点击化学反应接枝到介孔二氧化硅纳米颗粒表面，获得第一个中间产物，记为PEGM1。通过36000g高速离心和在新鲜DMF中水浴超声重悬上述纳米材料PEGM1，达到清洗的目的后，将全部PEGM1离心取沉淀分散到DMF中，再混入另一种分子量为2000的不含羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇(NHS-PEG)(西安瑞禧生物科技有限公司)。根据原始MSN-NH2的总量，并按照每毫克MSN-NH2对应500nmolNHS-PEG的比例，使其反应24小时，获得第二个中间产物，记为PEGM2，之后通过36000g离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得PEGM2的无水乙醇分散液。
为了方便后期对纳米药物的检测，本发明将异硫氰酸罗丹明B溶解在无水乙醇中后，滴加到含有第二个中间产物PEGM2的无水乙醇分散液中，罗丹明B通过异硫氰酸根与氨基的点击化学反应接枝到纳米颗粒表面，使其获得红色荧光；最后通过在无水乙醇中反复36000g高速离心-超声清洗产物，获得的产物记为PEG-MSN(PEGM)。
4)首先预处理单链DNA分子，使其变构成特定三维结构，具体操作如下：将需要预处理的单链DNA分子(序列为NH2-5’-CGGGGTGTGGGTTCGTCGTTAGCTTGATTTGGCAGCTGCC-dT-3’，由苏州贝信生物科技有限公司合成)在PBS中常温溶解后，迅速升温到95℃并维持5分钟，之后快速降温到4℃，并在此温度下长期保存。高温变性和降温退火的过程会使溶液中原本纠缠在一起的单链DNA分子分散开，同时每个分子会通过形成内部氢键在特定部位发生折叠，形成可以与目标分子特异性结合的“三叶草”样的三维结构，即Aptscl56DNA适配体。为了使其成功接枝到纳米材料上，在Aptscl56DNA适配体合成过程中，5’端进行了氨基化处理，形成5’端氨基化的DNA适配体。
将200nmol5’端氨基化的DNA适配体、10mgPEGM(这里的PEGM是将步骤3)获得的产物离心后获得的沉淀)、0.959mg催化剂碳化二亚胺(EDC)和0.288mg稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分散到10ml的pH＝6、0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES)中；37℃搅拌反应24h，在去离子水环境中36000g高速离心-清洗，得到DNA适配体功能化的兼具骨组织特意靶向性及骨质疏松症治疗功效的介孔二氧化硅纳米药物，记为DNA-MSN(DNAM)。
按照上述方法合成DNAM后，采用透射电镜配合X射线能谱分析可以确定，其表面含有磷元素(P)，即定性证明含有磷元素的DNA适配的分子成功接枝到了纳米颗粒表面(结果见图1-i到1-iv)。采用透射和扫描电镜观察结构和表面形貌(结果见图1-v到1-vi)，确定它具有精致的三维枝状结构以及介孔形貌。
实施例2、DNAM保护Aptscl56实验
配置浓度为50ug/ml的DNA降解酶I的PBS溶液，分别加入500nmol的游离Aptscl56和含有500nmol AAptscl56的DNAM，分别在0.25、0.5、2和24小时通过DNA水平电泳的方法观察Aptscl56的降解情况，结果如图2所示(图2)。从图2中可以看出，DNAM可以很好的保护其表面Aptscl56不被破坏。相反的，游离Aptscl56会被DNA降解酶I快速降解，在24小时时几乎完全被降解。
实施例3、动物实验1
将在5’端cy3-荧光改性的20nmol游离cy3-Aptscl56(由苏州贝信生物科技有限公司提供)、400μg载体PEGM和400μg纳米药物DNAM分别通过尾静脉注射至健康小鼠体内。其中每100μg的DNAM表面含有5nmol的Aptscl56分子。分别在注射后1小时、12小时、1天及7天处死实验动物，收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、双侧的肾脏、股骨及胫骨，使用活体荧光扫描仪对上述标本进行扫描、定性和定量分析，结果见图3。如图3柱状图所示，DNA适配体可以使DNAM特异性附着在骨基质表面，而且相比于游离DNA适配体和PEGM，其附着时间更长，能够实现长期治疗的效果。
实施例4、动物实验2
通过切除雌性小鼠卵巢，构建绝经后的骨质疏松症动物模型。通过尾静脉注射的方式，将盐水(Saline)、等量载体PEGM、游离5nmol的Aptscl56(DNA5)、1μg的阳性对照药物阿伦磷酸钠(ALN)和含有5nmol的AAptscl56的DNAM分别注入实验动物体内，观察它们治疗骨质疏松症的效果，并与未手术的正常小鼠组(Sham)进行对比。各组注射药物每周一次，连续4周。
处死实验动物并取材后，采用Micro-CT对小鼠股骨进行扫描重建，观察骨质疏松症的好转情况。结果见图4，DNAM治疗组相较其他对照组具有显著的治疗效果，主要表现为：松质骨骨小梁密度增加，骨密度增加。该结果说明DNAM具有良好且高效的治疗骨质疏松症的效果。(图4-i到iii以及4-vii到xi为不同组小鼠股骨的矢状面观图片；图4-iv到vi以及4-x到xii为不同组小鼠股骨的冠状面观图片，对应股骨样品生长板下方0.5-1mm位置，用于显示股骨内骨小梁的变化。)
收集小鼠全血，静置半小时待血液凝固后，5000rpm离心10min得到血清。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定各组血清中骨硬化蛋白的含量，结果见图5，使用单因素方差分析验证差异的显著性，以p<0.05为标准，其中*，#和$分别表示所有组数据与Saline组，Sham组以及DNAM组进行比较后具有显著性差异(p<0.05)。从图5中可以看出，经过DNAM治疗的小鼠血清中，骨硬化蛋白含量显著降低。该结果阐明了DNAM在动物体内高效中和骨硬化蛋白，从而治疗骨质疏松症的分子机制。(BF：beforetreatment，代表切除卵巢造模两个月未开始治疗时，实验动物体内骨硬化蛋白水平。)。

Claims (9)

1.一种用于治疗骨质疏松症的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物通过将DNA适配体Aptscl56接枝在PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒上获得。
2.根据权利要求1所述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物，其特征在于，还包括如下(1)-(4)中的一项或多项：
(1)所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为60-70nm；
(2)所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒是将分子量为2000的聚乙二醇衍生物接枝到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒上；
(3)所述DNA适配体Aptscl56的5’端氨基化；
(4)将5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56与所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒通过碳化二亚胺催化氨基-羧基的缩合反应接枝到一起，获得所述纳米药物。
3.根据权利要求2所述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物，其特征在于，还包括如下(1)-(5)中的一项或多项：
(1)将作为模板的十六烷基三甲基氯化铵与作为催化剂的三乙醇胺混合，之后加入正硅酸四乙酯的环己烷溶液，在加热条件下反应3小时，过滤去除杂质，用酸性甲醇溶液超声重悬洗涤，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)将介孔二氧化硅纳米颗粒分散到无水乙醇后，加入浓氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应得到所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(3)所述分子量为2000的聚乙二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基和N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇；
(4)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，将氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在DMF中形成分散液2，将溶液1和分散液2缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜DMF中超声重悬清洗，加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，室温下反应24小时后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(5)所述DNA适配体Aptscl56是通过将其DNA分子做如下预处理操作获得：将预先合成的单链DNA分子在磷酸盐缓冲液中溶解后，通过高温变性和降温退火的过程使溶液中原本纠缠在一起的单链DNA分子分散开，每个分子会在特定部位通过形成内部氢键而发生折叠，形成可以与目标分子特异性结合的“三叶草”样的三维结构。
4.根据权利要求2所述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物，其特征在于，还包括如下(1)-(4)中的一项或多项：
(1)每48ml的25％的十六烷基三甲基氯化铵溶液与72ml的去离子水混合后，加入0.36g三乙醇胺作为催化剂，在60℃油浴加热条件下维持一小时，得到反应液1；取20ml 20％(v/v)正硅酸四乙酯的环己烷溶液加入反应液1中，持续低速搅拌三小时后，使用分液漏斗获得水相液体，通过孔径0.22微米的滤膜将水相液体中的杂质过滤掉，36000g高速离心90分钟，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)每500mg介孔二氧化硅纳米颗粒分散到50ml无水乙醇后，加入1ml的28-30％的浓氨水和4ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，25℃反应24小时后，36000g高速离心-无水乙醇中超声重悬三次，得到所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(3)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在N,N-二甲基甲酰胺中形成分散液1，按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基的比例将溶液1和分散液1缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜N,N-二甲基甲酰胺中超声重悬清洗，获得第一个中间产物；按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇的比例，在第一个中间产物中加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，室温反应24小时之后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(4)每200nmol 5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56、10mg PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒、0.959mg催化剂碳化二亚胺和0.288mg稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺分散到10ml pH＝6的0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中；37℃搅拌反应24h，在去离子水环境中36000g高速离心-清洗，得到用于治疗骨质疏松症的纳米药物。
5.一种用于治疗骨质疏松症的纳米药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒分散到无水乙醇后，加入浓氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
2)选用两种分子量为2000的聚乙二醇衍生物接枝到步骤1)所获得的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒上制备出PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
3)选用5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56，将其接枝到步骤2)所得的PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒上，获得所述纳米药物。
6.根据权利要求5所述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述方法还包括如下(1)-(4)中的一项或多项：
(1)将作为模板的十六烷基三甲基氯化铵与作为催化剂的三乙醇胺混合，之后加入正硅酸四乙酯的环己烷溶液，在加热条件下反应3小时，过滤去除杂质，用酸性甲醇溶液超声重悬洗涤，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)所述分子量为2000的聚乙二醇衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基和N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇；
(3)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，将氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在DMF中形成分散液2，将溶液1和分散液2缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜DMF中超声重悬清洗，加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，之后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(4)所述DNA适配体Aptscl56是通过将其DNA分子做如下预处理操作获得：将预先合成的单链DNA分子在磷酸盐缓冲液中溶解后，通过高温变性和降温退火的过程使溶液中原本纠缠在一起的单链DNA分子分散开，每个分子会在特定部位通过形成内部氢键而发生折叠，形成可以与目标分子特异性结合的“三叶草”样的三维结构。
7.根据权利要求6所述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述方法还包括如下(1)-(4)中的一项或多项：
(1)每48ml的25％的十六烷基三甲基氯化铵溶液与72ml的去离子水混合后，加入0.36g三乙醇胺作为催化剂，在60℃油浴加热条件下维持一小时，得到反应液1；取20ml 20％(v/v)正硅酸四乙酯的环己烷溶液加入反应液1中，持续低速搅拌三小时后，使用分液漏斗获得水相液体，通过孔径0.22微米的滤膜将水相液体中的杂质过滤掉，36000g高速离心90分钟，获得60-70nm的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)每500mg介孔二氧化硅纳米颗粒分散到50ml无水乙醇后，加入1ml的28-30％的浓氨水和4ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，25℃反应24小时后，36000g高速离心-无水乙醇中超声重悬三次，得到所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(3)将分子量为2000的含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液1，氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在N,N-二甲基甲酰胺中形成分散液1，按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-羧基的比例将溶液1和分散液1缓慢混合；室温下反应24小时后高速离心，并将沉淀在新鲜N,N-二甲基甲酰胺中超声重悬清洗，获得第一个中间产物；按照每毫克氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒对应500nmolN-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇的比例，在第一个中间产物中加入另一种分子量为2000的不含有羧基的聚乙二醇衍生物N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇，室温反应24小时之后通过离心-超声分散的方式在无水乙醇中进行清洗，获得所述PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(4)每200nmol 5’端氨基化的DNA适配体Aptscl56、10mg PEG功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒、0.959mg催化剂碳化二亚胺和0.288mg稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺分散到10ml pH＝6的0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中；37℃搅拌反应24h，在去离子水环境中36000g高速离心-清洗，得到用于治疗骨质疏松症的纳米药物。
8.权利要求1-4所述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物在制备治疗或预防骨质疏松症或口腔疾病相关药物中的应用。
9.权利要求5-7所述的用于治疗骨质疏松症的纳米药物的制备方法在制备治疗骨质疏松症或口腔疾病相关药物中的应用。
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