CN114127050A - 适用于稳定化致淀粉样变免疫球蛋白轻链的苯并吡喃和咪唑衍生物 - Google Patents

适用于稳定化致淀粉样变免疫球蛋白轻链的苯并吡喃和咪唑衍生物 Download PDF

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Abstract

在免疫球蛋白轻链淀粉样变性(AL)中，由每位患者的单克隆浆细胞分泌的独特抗体轻链(LC)蛋白发生错误折叠和/或聚集，这一过程会导致器官退化。为了治疗AL患者，诸如难以耐受现有化疗方案的那些严重心脏受累患者，本文提供了式Ia、式Ib和式II的小分子化合物，它们是全长LC的天然二聚体结构的动力学稳定剂，所述化合物可以在其起源处减缓或停止致淀粉样变级联反应。

Description

适用于稳定化致淀粉样变免疫球蛋白轻链的苯并吡喃和咪唑 衍生物
相关申请
本申请要求于2019年3月29日提交的美国临时专利申请号62/826,476的优先权权益，并且该申请以引用的方式并入，如同在本文中完整阐述一样。
政府资助声明
本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的DK046335和TR002550号拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明享有一定权利。
背景技术
轻链(LC)淀粉样变性是一种进行性的且通常是致命的退行性疾病，由克隆浆细胞分泌后免疫球蛋白轻链内的构象变化引起，导致器官毒性，例如心肌病、肾病综合征和终末期肾功能衰竭。轻链构象变化也经常引起轻链聚集，这也可能导致一些有丝分裂后组织的中蛋白质毒性。导致器官毒性的疾病的病理机制包括致淀粉样变LC的毒性和沉积物的质量效应，两者均由错误折叠的LC浓度调节。如今，轻链淀粉样变性患者是通过靶向此疾病的癌症组分(增殖的克隆浆细胞)，采用通常涉及蛋白酶体抑制剂(以及在可能的情况下，干细胞移植)的化疗鸡尾酒来治疗，所述蛋白酶体抑制剂理想地消除分泌全长轻链的克隆浆细胞。然而，仅在30-40％的患者中实现完全克隆浆细胞的根除，且大多数最终会复发。器官反应作为器官功能改善的衡量标准，通常是有限的(<50％)。器官损伤仍然是死亡率和发病率的主要来源。此外，表现出心脏受累的轻链淀粉样变性患者通常病得太重，以致于无法耐受化疗并在诊断后一年内死亡。
发明内容
轻链淀粉样变性是由免疫球蛋白轻链内的构象变化引起的，所述构象变化通常会导致聚集。目前的化疗治疗旨在消除分泌全长轻链的克隆浆细胞；然而，仅在30-40％的患者中实现了完全根除。本文引入的动力学稳定剂策略不需要了解驱动轻链淀粉样变性(AL)中的器官退化的非天然轻链结构-蛋白质毒性关系，即可成功阻止疾病进展，因为它在开始聚集级联时阻止了轻链构象偏移。本文鉴定的小分子动力学稳定剂与天然二聚体中的可变结构域-可变结构域界面处的保守残基结合，从而使这种推定的无毒结构稳定。不受任何理论的束缚，假设免疫球蛋白轻链的小分子动力学稳定剂将成功阻止疾病进展，因为它们在聚集级联开始时阻止轻链构象偏移。这些功能严格类似于氯苯唑酸(Tafamidis)，后者已被证明对转甲状腺素蛋白淀粉样变性有效。本文公开的小分子动力学稳定剂与天然轻链二聚体中的可变结构域-可变结构域界面处的保守残基结合，使这种推定的无毒结构稳定，从而抵抗导致轻链淀粉样变性的构象变化和聚集。
本公开在各个实施方案中提供了LC动力学稳定剂，即如本文定义的式Ia、式Ib、式II的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003321903570000031
其中
A为H或
Figure BDA0003321903570000032
X1为O或NR0；
X2选自由以下组成的组：键、NR12、O、C(O)、C(O)NR11和CR12R11；
X3为O或NR13；
W选自由以下组成的组：键、OC(O)、C(O)O、C(O)NR14、NR14C(O)O、OC(O)NR14、NR14C(O)、NR14C(O)NR15、NR14、
Figure BDA0003321903570000033
m是选自1、2、3、4、5和6的整数；
n是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
p是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
r是选自0、1、2和3的整数；
Z1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、卤素、NR16R17、COOR18；OR18、NR16SO2R18、NR16COR18、X4(CR21R22)aCONR16R17、X4(CR21R22)aCOOR18、X4(CR21R22)aCOR18、X4(CR21R22)aNR16R17、X4(CR21R22)aOR18、SO2NR16R17、X4(CR21R22)aNR16COR18、C(N＝R23)NR24OH和
Figure BDA0003321903570000041
其中
X4为键、O或NR0；并且
a是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
Z2选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、CN、OR18和NR19R20；
Ar1为选自C6-C10-亚芳基和5至10元杂亚芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)的二价部分；
R1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、OH、(CR21R22)bOR18(b是选自0、1、2、3、4、5和6的整数)、卤素和(C1-C6)卤烷基；
R2、R3和R4独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、OH、(CR21R22)bOR18、卤素、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R0和R5-R22独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C1-C6-卤烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R16和R17独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、C(O)OR18、C(O)R18和SO2R18；
R14和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R15和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R14连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R15连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R17连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环，其中环成员选自C、O和N；
R19和R20连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R21和R22连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
或
根据式II的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003321903570000071
其中
R23–R28独立地选自由以下组成的组：H、卤基、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
Ar2为C6-C10-芳基或5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S；
q是选自0、1、2、3和4的整数；
t是选自0、1、2、3和4的整数；
其中式Ia、式Ib或式II中的任何烷基、环烷基、杂环烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、芳基、杂芳基和环部分任选地被一至六个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、卤基、C1-C6-卤烷基、-NR’2(其中各R’独立地选自由H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基和C6-C10-芳基组成的组)、-NHC(O)(OC1-C6-烷基)、-NO2、-CN、氧代、-C(O)OH、-C(O)O(C1-C6-烷基)、-C1-C6-烷基(C1-C6-烷氧基)、-C(O)NH2、-C(O)C1-C6-烷基、-OC1-C6-烷基、-Si(C1-C6-烷基)3、-S(O)0-2-(C1-C6-烷基)、C6-C10-芳基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、3至14元杂环烷基和-(C1-C6-烷基)-(3至14元杂环)(其中1-4个杂环成员独立地选自N、O和S)和-O(C6-C14-芳基)。
在一些实施方案中，式Ia、式Ib和式II的化合物不包括以下化合物中的任一种：
Figure BDA0003321903570000081
Figure BDA0003321903570000091
Figure BDA0003321903570000101
在各个实施方案中，提供了一种稳定化呈其天然构象的免疫球蛋白轻链二聚体的方法，其包括使二聚体与有效量的本文所述的任何化合物(包括所有列举的化合物，诸如式1-21中的任一个(参见下表1))接触。
此外，在各个实施方案中，提供了一种治疗患者的轻链淀粉样变性的方法，其包括向患者施用有效量的本文所述的任何化合物，包括所有列举的化合物，诸如式1-21中的任一个(参见下表1)。
本公开在一个实施方案中还提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载剂组合的式Ia、式Ib、式II的化合物或本文所述的任何列举的化合物。
附图简述
图1:LC动力学稳定剂的高通量筛选。a)LC由可变(V，黄色)和恒定(C，灰色)免疫球蛋白结构域组成，它们形成通过C214残基(黑线)之间的二硫键连接的同二聚体。蛋白酶对染料标记的蛋白质的裂解导致所得肽中FP的减少。蛋白水解速率取决于LC的动力学稳定性，可以通过结合稳定化的小分子来提高该动力学稳定性。b)荧光素标记和未标记的LC的蛋白水解，这些LC与100nM PK共同孵育并通过SDS-PAGE可视化。符号示出了归一化的带强度，且线条示出了对单个指数衰减模型的拟合，n＝3。黑色，考马斯染色的总LC(10μM)；绿色，标记的LC(20nM)的荧光。c)荧光素标记的LC蛋白水解的动力学，在37℃下在荧光计比色皿中通过FP测量。线条示出了对单个指数衰减模型的拟合。d)在22℃下，在384孔平板中通过FP测量的蛋白水解动力学。点示出了单个孔的数据，且线条示出了平均值，n＝16。e)在22℃下24小时后的蛋白水解程度取决于LC稳定kosmotrope Na2SO4的浓度，而不取决于蛋白酶的浓度。f)添加到LC中的蛋白水解后化合物鉴定假阳性筛选命中。每个点代表单个化合物的平均测量值(n＝3)。绿色阴影区域表示被视为命中的化合物。g)提供丝氨酸蛋白酶PK和金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶(绿色区域)保护的化合物可能是LC的稳定剂，而不是蛋白酶抑制剂。
图2:7-二乙氨基-4-甲基香豆素(1)是一种环境敏感性荧光团，可使LC稳定。a)SDS-PAGE凝胶，示出了在1％DMSO媒介物和100μM小分子存在下未标记的WIL-FL(10μM)的蛋白水解；t＝2h。对于每个小分子，对核心香豆素结构(21)的修饰以红色显示。b)在未标记的WIL-FL(20μM)存在下，荧光发射(λex＝373nm)为1(1μM)，而不是19(1μM)。c)将LC构建体滴定到1(1μM)中，n＝3。线条表示对单一位点结合模型的拟合。d)1对重组LC变体的亲和力，n＝3，如对于(c)所测量。e)WIL-FL C214S(20μM)和WIL-V(20μM)在1(100μM)不存在(红色)或存在(蓝色)下的SV-AUC。二聚WIL-FL(20μM)的数据以灰色示出。f)将κI O18/O8-FL(蓝色)和AL12-FL(红色)滴定到1(1μM)中。示出了WIL-FL(灰色)的数据以用于比较。插图：在PBS(灰色虚线)中或存在20μMκI O18/O8-FL(蓝色)或AL12-FL(红色)下1(1μM)的荧光光谱。g)1(1μM)对WIL-FL结合位点的竞争表明其他命中分子(10μM)的存在减少了1(1μM)的结合。不相关分子二氟尼柳(Dif)不与1竞争LC结合。h)在存在或不存在二氟尼柳下，1与人血清白蛋白(HSA)的结合，通过1的荧光来测定，如对于(c)所测量。i)在人IgG抗体5J8的LC同二聚体(黑色)或LC:HC异源二聚体(Fab，红色)存在下1的荧光。
图3:动力学稳定剂与V结构域-V结构域二聚体界面的结合。JTO-FL的晶体结构有结合1(橙色)(LC蓝色，青色)和没有结合1(LC灰色)。a)由一条二聚体链对齐的结构概览。b)动力学稳定剂1结合在一个口袋中，该口袋由来自一个原聚体的残基44、87和98与来自另一个原聚体的36'、44'和46'的侧链形成。残基根据Kabat系统编号。c)结合位点区域的表面表示。1结合在非配体的LC中不存在的口袋中。d)映射到JTO-FL·1结构上的人种系LC基因中的结合位点残基的保守性。红色，高度保守的残基；蓝色，弱保守残基。
图4：动力学稳定剂1与溶液中的LC结合。a)WIL-FL(0.05mM单体浓度)的1H-15NHSQC NMR光谱的选定区域在不存在(蓝色轮廓)或存在1下在LC∶1比率(LC单体∶配体)为1∶0.8(红色)和1∶2.2(绿色)下的叠加。b)
Figure BDA0003321903570000131
结合1后的联合化学位移变化大于0.1ppm的残基以红色球体的形式映射到JTO-FL·1复合体的结构上；配体在两个可能但相互排斥的结合位点中显示为黄色或绿色棒状物。c)与游离LC二聚体(LC2，蓝色)和复合体(LC2·1，绿色)相关的峰强度作为1与WIL-FL结合的函数。d)HSQC光谱区域突出了JTO-V的残基Q38的相关性。颜色同(a)。注意到，当添加大约等量的LC2和1时，存在连接游离和配体结合相关性的交换峰。e)WIL-V(平均超过29个残基)和JTO-V(32个残基)的15N横向弛豫率(R2)，在添加(绿色)或不添加(蓝色)1下。f)WIL-V残基Q38的光谱，在不存在(蓝色)或存在1下，LC∶1比率为1∶0.9(红色)和1∶2.2(绿色)。注意到在1∶0.9的LC∶1下结合形式的交叉峰被加宽。
图5：小分子动力学稳定剂结合可稳定化LC以防止蛋白水解、去折叠和聚集。a)在媒介物(红色)或1(100μM；蓝色)存在下重组WIL-FL C214S(10μM)的蛋白水解。符号示出了LC带定量，且线条示出了对单个指数衰减模型的拟合。b)在存在5(表1；50μM；橙色)或媒介物(红色)下WIL-FL(5μM)的去折叠率作为尿素浓度的函数。符号表示针对单个动力学瞬态计算的速率，且线条拟合至2态去折叠模型。c)在1(100μM；蓝色符号)、5(表1；50μM；橙色符号)或媒介物(红色符号)存在下WIL-FL(5μM)的平衡尿素滴定。d)JTO-V(100μM，左图)和WIL-V(200μM，右图)在1(400μM)存在(蓝色)或不存在(红色)下的NMR氢-氘交换测量值。交换率被转换为自由能。符号示出了可以测量速率的残留物。虚线表示每个V结构域的平均稳定性。e)在存在媒介物(红色)或1(100μM；蓝色)下，浆细胞分泌的LC、ALMC2(5μM)的蛋白水解。线条表示对单个指数衰减模型的拟合。f)在存在(蓝色)或不存在(红色)1(200μM)下，由SEC在pH 5、37℃下测量的残留可溶性WIL-FL C214S二聚体(10uM)，作为时间的函数以通过起始材料的消失来评估聚集动力学。单个反应以虚线示出；曲线表示类别(±1)中所有样品对单个指数衰减模型的拟合。
具体实施方式
在AL中，目前的治疗旨在根除分泌FL LC的克隆浆细胞(2,46)。然而，仅在30-40％的患者中实现了对致淀粉样变轻链产生的完全抑制(一种完全的血液学反应)，并且大多数最终会复发。LC的动力学稳定化不太可能导致浆细胞死亡，但可以降低器官蛋白质毒性和AL的进展。心脏明显受累的患者目前几乎没有可用的治疗选择，并且代表着紧迫的未满足的医疗需求，因为他们通常病得太重以致于无法耐受化疗。动力学稳定剂预处理可让这些患者耐受化疗。在这种情况下，FL LC稳定化也可用于治疗后AL复发时的维持治疗方法。由于克隆浆细胞的再度出现通常很慢，因此可以通过动力学稳定剂处理将构象不稳定的循环LC引起的器官毒性降至最低(47)。本文公开的小分子LC动力学稳定剂的优点是它们结合并稳定化大多数患者的FL LC的能力，因为保守残基包含动力学稳定剂结合位点。因此，根据一个实施方案，本公开提供了一种通过以下步骤来鉴定其LC易于动力学稳定化的患者的方法：测量血浆中LC在存在和不存在动力学稳定剂的情况下对PK内切蛋白酶解的敏感性，确定敏感性的相对差异，以及鉴定最有可能受益于LC的动力学稳定化的患者。
定义
“烷基”是指包括1至约20个碳原子的直链或支链烃基。例如，烷基可具有1至10个碳原子或1至6个碳原子。示例性烷基包括直链烷基，诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等，并且还包括直链烷基的支链异构体，例如但不限于-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2等。因此，烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。烷基可未被取代或任选地在1、2、3、4、5或甚至6个位置处被取代，这些取代基连接在任何可用的原子上以产生具有如本文所述的取代的稳定化合物。“任选被取代的烷基”是指烷基或被取代的烷基。
术语“卤素”、“卤化物”和“卤基”各自是指-F或氟、-Cl或氯、-Br或溴、或-I或碘。
术语“烯基”是指包含2至约20个碳原子且具有1-3、1-2或至少一个碳碳双键的直链或支链烃基。烯基可未被取代或任选地在1个或多个，例如1、2、3、4、5或甚至6个位置处被一个或多个取代基取代，这些取代基连接在任何可用的原子上以产生具有如本文所述的取代的稳定化合物。“任选被取代的烯基”是指烯基或被取代的烯基。
“炔”或“炔基”是指具有指定数量的碳原子(诸如2至6个)和至少一个三键的直链或支链不饱和烃。(C2-C8)炔基的实例包括但不限于乙炔、丙炔、1-丁炔、2-丁炔、1-戊炔、2-戊炔、1-己炔、2-己炔、3-己炔、1-庚炔、2-庚炔、3-庚炔、1-辛炔、2-辛炔、3-辛炔和4-辛炔。炔基可未被取代或任选地在1个或多个，例如1、2、3、4、5或甚至6个位置处被一个或多个取代基取代，这些取代基连接在任何可用的原子上以产生具有如本文所述的取代的稳定化合物。“任选被取代的炔基”是指炔基或被取代的炔基。
术语“环烷基”是指饱和的单环、双环、三环或多环的3至14元环系统，诸如C3-C8-环烷基。环烷基可经由任何原子连接。碳环基环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可未被取代或任选地在1个或多个，例如1、2、3、4、5或甚至6个位置处被一个或多个取代基取代，这些取代基连接在任何可用的原子上以产生具有如本文所述的取代的稳定化合物。
“芳基”当单独使用或作为另一术语的一部分使用时是指碳环芳族基团，无论是否稠合，具有指定的碳原子数目或如果未指定数目，则最多14个碳原子，诸如C6-C14-芳基。具体的芳基是苯基、萘基、联苯、菲基、并四苯基等(参见，例如Lang’s Handbook ofChemistry(Dean,J.A.编著)第13版表7-2[1985])。具体的芳基是苯基。“芳基”可以任选地与碳环基环稠合，如本文所定义。芳基可未被取代或任选地被一个或多个连接在任何可用的原子上的取代基取代以产生稳定的化合物，其中取代基如本文中所述。“任选被取代的芳基”是指芳基或被取代的芳基。
术语“杂原子”是指N、O和S。包含N或S原子的本公开的化合物可以任选地被氧化成相应的N-氧化物、亚砜或砜化合物。
“杂芳基”，单独或与本文所述的任何其他部分组合时，是指含有5至10个，诸如5或6个环原子的单环芳环结构；或具有8至10个原子的双环芳族基团，其含有一个或多个，诸如1-4、1-3或1-2个独立地选自由O、S和N组成的组的杂原子。杂芳基还旨在包括氧化的S或N，诸如亚磺酰基、磺酰基和叔环氮的N-氧化物。碳或杂原子是杂芳环结构的连接点，从而产生稳定的化合物。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、吲哚嗪基、苯并[b]噻吩基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、异噁唑基、噁噻二唑基、异噻唑基、四唑基、咪唑基、三唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1-吡唑并嘧啶基、咪唑并吡嗪基、三唑并吡嗪基和吲哚基。杂芳基可未被取代或任选地被一个或多个连接在任何可用的原子上的取代基，例如1、2、3、4或5个，还有1、2或3个取代基，还有1个取代基取代，以产生稳定的化合物，其中取代基如本文中所述。“任选被取代的杂芳基”是指杂芳基或被取代的杂芳基。
“杂环烷基”意谓饱和或部分不饱和的非芳族单环、双环、三环或多环环系统，其具有3至14个，诸如3至6个原子，其中环中的1至3个碳原子被O、S或N的杂原子置换。杂环烷基任选地与5-6个环成员的芳基或杂芳基稠合，并且包括氧化的S或N，诸如亚磺酰基、磺酰基和叔环氮的N-氧化物。杂环烷基环的连接点在碳或杂原子处，从而保持稳定的环。杂环烷基的实例包括但不限于吗啉代、四氢呋喃基、二氢吡啶基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、二氢苯并呋喃基和二氢吲哚基。杂环烷基可未被取代或任选地被一个或多个连接在任何可用的原子上的取代基，诸如1至3个取代基，例如1、2或3个取代基取代，以产生稳定的化合物，其中取代基如本文中所述。
术语“腈”或“氰基”可互换使用，并且是指与杂芳环、芳环和杂环烷基环的碳原子结合的-CN基团。
术语“氧代”是指与作为饱和或不饱和部分的一部分的原子结合的＝O原子。因此，＝O原子可以与作为环状或无环部分的一部分的碳、硫或氮原子结合。
“羟基(hydroxyl/hydroxy)”是指-OH基团。
取代基-CO2H可被诸如以下的生物电子等排置换物置换：
Figure BDA0003321903570000181
等，其中R与如本文所定义的RA具有相同定义。参见，例如.,THE PRACTICE OFMEDICINAL CHEMISTRY(Academic Press:New York,1996),第203页。
本文所述的化合物可以各种异构形式存在，包括构型、几何和构象异构体，包括例如顺式-或反式构象。化合物也可以一种或多种互变异构形式存在，包括单一互变异构体和互变异构体的混合物。术语“异构体”旨在涵盖本公开的化合物的所有异构形式，包括化合物的互变异构形式。本公开的化合物还可以开链或环化形式存在。在一些情况下，一种或多种环化形式可能是由于失水造成的。开链和环化形式的具体组成可能取决于化合物的分离、储存或施用方式。例如，化合物在酸性条件下可主要以开链形式存在，但在中性条件下环化。所有形式都包括在本公开中。
本文所述的许多化合物可以具有一个或多个手性中心并因此可以不同的对映异构体形式存在。本文所述的化合物可呈光学异构体或非对映异构体的形式。因此，本公开涵盖以它们的光学异构体、非对映异构体及其混合物(包括外消旋混合物)形式的本文所述的化合物及其用途。本公开化合物的光学异构体可通过以下已知的技术获得，诸如不对称合成、手性色谱、模拟移动床技术或经由使用光学活性拆分剂进行立体异构体的化学分离。
除非另有说明，否则术语“立体异构体”意指化合物的一种立体异构体，其大体上不含该化合物的其他立体异构体。因此，具有一个手性中心的立体异构纯的化合物大体上将不含该化合物的相反对映异构体。具有两个手性中心的立体异构纯的化合物大体上将不含该化合物的其他非对映异构体。典型的立体异构纯的化合物包含大于约80重量％的化合物的一种立体异构体和小于约20重量％的化合物的其他立体异构体，例如大于约90重量％的化合物的一种立体异构体和小于约10重量％的化合物的其他立体异构体，或大于约95重量％的化合物的一种立体异构体和小于约5重量％的化合物的其他立体异构体，或大于约97重量％的化合物的一种立体异构体和小于约3重量％的化合物的其他立体异构体，或大于约99重量％的化合物的一种立体异构体和小于约1重量％的化合物的其他立体异构体。如上所述的立体异构体可被视为包含两种立体异构体的组合物，所述立体异构体以它们各自的本文所述的重量百分比存在。
如果所描绘的结构与赋予该结构的名称之间存在差异，则以所描绘的结构为准。此外，如果结构或结构的一部分的立体化学没有用例如粗体或虚线表示，则该结构或结构的部分将被解释为涵盖其所有立体异构体。然而，在一些情况下，当存在多于一个手性中心时，结构和名称可表示为单个对映异构体，以帮助描述相对立体化学。有机合成领域的技术人员将知道这些化合物是否通过用于制备它们的方法制备成单一对映异构体。
如本文所用，且除非另有相反规定，术语“化合物”包括化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素异数体和/或互变异构体。因此，例如，式IA或式IB的化合物包括所述化合物的互变异构体的药学上可接受的盐。
如本文使用的短语“药学上可接受的盐”是指本文描述的化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。代表性药学上可接受的盐包括例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、水溶性和水不溶性盐诸如乙酸盐、氨芪磺酸盐(amsonate)(4,4-二氨基芪-2,2-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、钙、依地酸钙、樟脑酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐、乙磺酸盐、氟尿酸盐(fiunarate)、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰胺基苯砒酸盐、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、溴甲烷、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(1,1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐，einbonate)、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、苏拉酸盐(suramate)、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙基碘和戊酸盐。药学上可接受的盐在其结构中可具有多于一个带电原子。在这种情况下，药学上可接受的盐可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指疾病或与疾病相关的症状的改善或根除。在各个实施方案中，这些术语是指最小化由于向患有此类疾病的患者施用一种或多种本文所述的预防性或治疗性化合物而导致的疾病的传播或恶化。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指预防患者因施用本文所述的化合物而导致的疾病发作、复发或传播。
术语“有效量”是指足以在疾病的治疗或预防中提供治疗或预防益处或延迟或最小化与疾病相关的症状的如本文所述的化合物或其他活性成分的量。此外，关于如本文所述的化合物的治疗有效量是指在疾病的治疗或预防中提供治疗益处的单独治疗剂或与其他疗法组合的治疗剂的量。与如本文所述的化合物结合使用，该术语可包括改善整体疗法、减少或避免疾病的症状或病因、或增强另一种治疗剂的治疗功效或与另一种治疗剂协同作用的量。
“患者”或受试者”包括动物，诸如人、奶牛、马、绵羊、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。根据一些实施方案，动物是哺乳动物，诸如非灵长类动物和灵长类动物(例如猴和人)。在一个实施方案中，患者是人，例如人类婴儿、儿童、青少年或成人。在本公开中，术语“患者”与“受试者”可互换使用。
化合物
本公开在各个实施方案中提供了LC动力学稳定剂，即式Ia或Ib的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003321903570000221
其中
A为H或
Figure BDA0003321903570000222
X1为O或NR0；
X2选自由以下组成的组：键、NR12、O、C(O)、C(O)NR11和CR12R11；
X3为O或NR13；
W选自由以下组成的组：键、OC(O)、C(O)O、C(O)NR14、NR14C(O)O、OC(O)NR14、NR14C(O)、NR14C(O)NR15、NR14、
Figure BDA0003321903570000231
m是选自1、2、3、4、5和6的整数；
n是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
p是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
r是选自0、1、2和3的整数；
Z1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、卤素、NR16R17、COOR18；OR18、NR16SO2R18、NR16COR18、X4(CR21R22)aCONR16R17、X4(CR21R22)aCOOR18、X4(CR21R22)aCOR18、X4(CR21R22)aNR16R17、X4(CR21R22)aOR18、SO2NR16R17、X4(CR21R22)aNR16COR18、C(N＝R23)NR24OH和
Figure BDA0003321903570000232
其中
X4为键、O或NR0；并且
a是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
Z2选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、CN、OR18和NR19R20；
Ar1为选自C6-C10-亚芳基和5至10元杂亚芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)的二价部分；
R1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、OH、(CR21R22)bOR18(b是选自0、1、2、3、4、5和6的整数)、卤素和(C1-C6)卤烷基；
R2、R3和R4独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、OH、(CR21R22)bOR18、卤素、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R0和R5-R22独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C1-C6-卤烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R16和R17独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、C(O)OR18、C(O)R18和SO2R18；
R14和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R15和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R14连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R15连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R17连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环，其中环成员选自C、O和N；
R19和R20连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R21和R22连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
或
根据式II的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003321903570000261
其中
R23–R28独立地选自由以下组成的组：H、卤基、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
Ar2为C6-C10-芳基或5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S；
q是选自0、1、2、3和4的整数；
t是选自0、1、2、3和4的整数；
其中式Ia、式Ib或式II中的任何烷基、环烷基、杂环烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、芳基、杂芳基和环部分任选地被一至六个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、卤基、C1-C6-卤烷基、-NR’2(其中各R’独立地选自由H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基和C6-C10-芳基组成的组)、-NHC(O)(OC1-C6-烷基)、-NO2、-CN、氧代、-C(O)OH、-C(O)O(C1-C6-烷基)、-C1-C6-烷基(C1-C6-烷氧基)、-C(O)NH2、-C(O)C1-C6-烷基、-OC1-C6-烷基、-Si(C1-C6-烷基)3、-S(O)0-2-(C1-C6-烷基)、C6-C10-芳基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、3至14元杂环烷基和-(C1-C6-烷基)-(3至14元杂环)(其中1-4个杂环成员独立地选自N、O和S)和-O(C6-C14-芳基)。
应当理解，尽管有式Ia、式Ib和式II的定义，但在一些实施方案中，所述化合物不包括以下化合物中的任一种：
Figure BDA0003321903570000271
Figure BDA0003321903570000281
Figure BDA0003321903570000291
在各个实施方案中，根据权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式Ia。在其他实施方案中，所述化合物具有式Ib。
在一个实施方案中，X1和X3各自为O。
又一实施方案为其中R2、R3和R4各自独立地选自H和C1-C6-烷基。例如，R2、R3和R4各自为H。
在一个实施方案中，R1为H或C1-C6-烷基。例如，R1为C1-C6-烷基，诸如甲基。
在各个实施方案中，X2为NR12且p为0、1或2。
又一实施方案提供了一种化合物，其中Z2和R12各自独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基和C3-C8-环烷基。例如，根据一个实施方案，Z2和R12各自为C1-C6-烷基。在另外的实施方案中，p为0且Z2和R12各自为乙基。
在其他实施方案中，X2为O；Z2为C6-C10-芳基或-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)；p为1、2或3；且R7和R8独立地选自H、C1-C6-烷基。例如，Z2为苯基或苄基，且R7和R8独立地选自H、甲基、三氟甲基和乙基。
在各个实施方案中，A为
Figure BDA0003321903570000301
因此，在一个实施方案中，A为
Figure BDA0003321903570000302
在仍另一实施方案中，m为2且n为1。
另外的实施方案提供了一种化合物，其中W选自由以下组成的组：OC(O)NR14；NR14C(O)NR15；
Figure BDA0003321903570000311
根据各个实施方案，Ar1的实例包括苯基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡嗪基、吡啶基和三唑并吡嗪基。
在一些实施方案中，Z1选自H、C1-C6-烷基和5元杂环烷基。
示例性实施方案为化合物，其中所述化合物具有式Ia或Ib；X1和X3各自为O；X2为NR12，其中R12为C1-C6-烷基；p为0；Z2为C1-C6-烷基；A为
Figure BDA0003321903570000312
m为2且n为0或1；W选自由以下组成的组：OC(O)NR14、NR14C(O)NR15、
Figure BDA0003321903570000313
和
Figure BDA0003321903570000314
R5、R6、R9和R10独立地选自H和C1-C6-烷基；Ar1选自由以下组成的组：苯基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡嗪基、吡啶基和三唑并吡嗪基；且Z1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基和5元杂环烷基。
在示例性实施方案中，本公开的化合物，包括用于本文所述的方法中的化合物，包括下表中的那些：
Figure BDA0003321903570000321
Figure BDA0003321903570000331
Figure BDA0003321903570000341
Figure BDA0003321903570000351
Figure BDA0003321903570000361
Figure BDA0003321903570000371
Figure BDA0003321903570000381
Figure BDA0003321903570000391
Figure BDA0003321903570000401
Figure BDA0003321903570000411
Figure BDA0003321903570000421
Figure BDA0003321903570000431
Figure BDA0003321903570000441
Figure BDA0003321903570000451
Figure BDA0003321903570000461
Figure BDA0003321903570000471
Figure BDA0003321903570000481
Figure BDA0003321903570000491
Figure BDA0003321903570000501
Figure BDA0003321903570000511
Figure BDA0003321903570000521
在其他实施方案中，所述化合物具有式II。
在式II化合物中，根据一个实施方案，q和t各自为0或1且Ar2为C6-C10-芳基。例如，q为1且t为0。在一个实施方案中，Ar2为苯基，其任选被-NR’2取代(其中各R’独立地选自由H、C1-C6-烷基组成的组)和C1-C6-卤烷基。
在式II化合物中，另外其他的实施方案提供了R25、R26、R27和R28，各自独立地为H或C1-C6-烷基。例如，R25、R26、R27和R28各自为H。
式II化合物的特定实例选自下表：
Figure BDA0003321903570000522
Figure BDA0003321903570000531
药物组合物
本公开还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本文所述的化合物、或其药学上可接受的盐、立体异构体和/或互变异构体与药学上可接受的载剂混合。在一些实施方案中，根据可接受的药物混合实践，所述组合物进一步含有一种或多种另外的治疗剂、药学上可接受的赋形剂、稀释剂、佐剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、缓冲剂、风味赋予剂。
在一个实施方案中，药物组合物包含本文所述的任何列举的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体和/或互变异构体，以及药学上可接受的载剂。
本公开的药物组合物以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、被治疗的具体受试者、受试者的临床病状、病症的起因、试剂的递送部位、施用方法、施用时间表以及从业医生已知的其他因素。
所施用的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体和/或互变异构体的“治疗有效量”受这些考虑因素支配，并且是发挥治疗效果所需的最小量。这样的量可低于对正常细胞或受试者整体有毒的量。通常，所施用的本公开的化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体)的初始治疗有效量在约0.01至约200mg/kg或约0.1至约20mg/kg患者体重/天的范围内，其中典型的初始范围为约0.3至约15mg/kg/天。口服单位剂型，诸如片剂和胶囊，可含有约0.1mg至约1000mg本公开的化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体)。在另一个实施方案中，此类剂型包含约50mg至约500mg本公开的化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体)。在又一个实施方案中，此类剂型包含约25mg至约200mg本公开的化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体)。在仍另一个实施方案中，此类剂型包含约10mg至约100mg本公开的化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体)。在其他实施方案中，此类剂型包含约5mg至约50mg本公开的化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体)。在任何前述实施方案中，剂型可每天施用一次或每天两次。
本公开的组合物可以剂量单位制剂的形式经口、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾或直肠施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。
如本文所述的合适的口服组合物包括但不限于片剂、糖锭、锭剂、水性混悬液或油性混悬液、可分散粉剂或颗粒剂、乳液、硬胶囊或软胶囊、糖浆剂或酏剂。
在另一方面，还包括适用于单一单位剂量的药物组合物，其包含本公开的化合物或其药学上可接受的立体异构体、盐或互变异构体以及药学上可接受的载剂。
适于经口使用的本公开的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备。例如，本公开的化合物的液体制剂含有一种或多种选自由以下组成的组的试剂：甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供本公开的化合物的药学上可口的制剂。
对于片剂组合物，本公开的化合物与无毒的药学上可接受的赋形剂混合用于制造片剂。此类赋形剂的实例包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知包衣技术包衣以延缓在胃肠道中的崩解和吸收，从而在所需时间段内提供持续的治疗作用。例如，可以使用延时材料，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于经口使用的制剂还可呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
对于水性混悬液，将本公开的化合物与适于维持稳定混悬液的赋形剂混合。此类赋形剂的实例包括但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶。
口服混悬液还可含有分散剂或润湿剂，诸如天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，例如，十七亚乙基氧十六醇，或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬液还可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂(诸如蔗糖或糖精)。
油性混悬液可通过使本公开的化合物混悬于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性混悬液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。
可添加甜味剂(诸如以上陈述的那些)和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过添加诸如抗坏血酸的抗氧化剂来保存。
适合于通过添加水来制备水性混悬液的可分散粉剂和颗粒剂提供了与分散剂或润湿剂、混悬剂以及一种或多种防腐剂混合的本公开的化合物。合适的分散剂或润湿剂和混悬剂通过已在上文提及的那些来例证。还可存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本公开的药物组合物还可呈水包油乳液的形式。油相可以为植物油，例如橄榄油或花生油；或矿物油，例如液体石蜡；或它们的混合物。合适的乳化剂可为天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶)、天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂)及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯)，以及所述偏酯与氧化乙烯的缩合反应产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。乳液还可含有甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可与例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖的甜味剂一起配制。这类制剂还可含有缓和剂、防腐剂和调味剂以及着色剂。药物组合物可呈无菌可注射水性混悬液或油性混悬液形式。可根据已知技术，使用已在上文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和混悬剂来配制这种混悬液。无菌可注射制剂也可为在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如为在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶剂中，可采用水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油常规用作溶剂或混悬介质。为达成此目的，任何温和的不挥发性油均可被使用，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，诸如油酸的脂肪酸在可注射制剂中获得使用。
式IA或式IB的化合物也可以栓剂形式施用，用于药物的直肠施用。这些组合物可通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述无刺激性赋形剂在常温下为固体但在直肠温度下为液体并因此在直肠中融化以释放药物。这类材料为可可脂和聚乙二醇。
用于肠胃外施用的组合物在无菌介质中施用。取决于所使用的媒介物和制剂中药物的浓度，胃肠外制剂可以是含有溶解药物的混悬液或溶液。还可以将佐剂诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂添加到肠胃外组合物中。
使用方法
由克隆扩增的浆细胞群分泌免疫球蛋白轻链(LC)可导致疾病轻链淀粉样变性(AL)-癌症和蛋白质病(1,2)。在无相关抗体重链下分泌的“游离”LC最初采用明确定义的同二聚体结构，其中单体可以通过链间二硫键共价连接(图1a)(3)。LC单体包含连接到C端恒定(C)结构域的N端可变(V)结构域。每个患者的克隆浆细胞分泌单一的、独特的LC序列。大多数LC会被肾脏迅速清除。
然而，由于致淀粉样变全长(FL)LC通常不如非致淀粉样变FL LC稳定，因此它们可能会错误折叠或错误折叠和错误组装成非天然物种，包括交叉β片层淀粉样原纤维，这是AL的标志(4-8)。序列似乎也发挥作用，因为并非所有去稳定的FL LC在患者体内都聚集(4-8)。患者体内的聚集是如何发生的尚不清楚，但在体外已经描述了几个过程，包括释放致淀粉样变LC片段的去稳定依赖性内切蛋白酶解(4,9,10)。在FL LC旁的患者沉积物中观察到包括V结构域的LC片段(11-13)。
由于驱动AL的结构-蛋白质毒性关系尚不清楚，所以保守策略是通过稳定化FL LC天然状态来阻止FL LC在其起源处的错误折叠。这种策略在改善转甲状腺素蛋白淀粉样变性方面是有效的(14-19)。稳定化FL LC二聚体的小分子可防止LC聚集和器官毒性所需的任何错误折叠和/或内切蛋白酶解。此类分子在本文中称为动力学稳定剂，因为它们降低LC瞬时访问非天然、易聚集和蛋白酶敏感构象的速率(20)。LC二聚体结构域之间的界面是稳定性和聚集倾向的重要决定因素，稳定性和聚集倾向已被鉴定为潜在的稳定化目标(21,22)。因此，本文的一个目的是提供以下处理：防止新合成和分泌的FL LC的错误折叠和聚集，从而降低器官蛋白质毒性，使得患者最终能够耐受有效的化疗方案。
使用评估LC动力学稳定性的蛋白酶偶联荧光偏振测定，筛选了650,000个小分子，鉴定了四种结构类别中的FL LC动力学稳定剂，它们保护重组和浆细胞分泌的λ6a LC免受内切蛋白酶解。核磁共振(NMR)和X射线晶体学揭示，这些小分子利用大多数患者来源的LC中所见的保守残基，与FL LC二聚体和分离的V结构域中的V结构域-V结构域界面结合。
鉴于这些发现和本文公开的其他数据，本公开在各个实施方案中提供了一种稳定化呈其天然构象的免疫球蛋白轻链二聚体的方法。所述方法包括使二聚体与有效量的本文公开的任何化合物接触，这些化合物包括式Ia、式Ib、式II的化合物和本文公开的所有列举的化合物。接触可以在体内、离体和体外发生。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种治疗患者的轻链淀粉样变性的方法。所述方法包括向患者施用有效量的本文公开的任何化合物，包括式Ia、式Ib、式II的化合物和本文公开的所有列举的化合物。
本公开还提供了一种预防性治疗的方法，其包括将治疗有效量的本文所述的化合物施用给已经接受化疗治疗、自体干细胞移植后或从先前的化疗治疗中复发的AL患者。
本文所述的任何方法都适合与常规化疗(例如，烷化剂和基于类固醇的方案：美法仑、地塞米松和环磷酰胺)组合使用。根据一个实施方案，组合治疗方法可包括施用免疫调节剂诸如沙利度胺、来那度胺或泊马度胺；蛋白酶体抑制剂诸如硼替佐米；或这两者。
在另外的实施方案中，本文所述的任何方法都与靶向潜在浆细胞克隆的抗CD38Ab和/或其他化疗治疗组合进行。
其他组合疗法包括本文所述的任何方法，其中施用UPR活化剂，诸如ATF-6活化剂和/或化疗，或抗淀粉样蛋白疗法，诸如直接靶向淀粉样蛋白沉积物的治疗性抗体。所有这些组合都涵盖在内。
实施例
化合物合成和表征
一般合成程序.所有试剂和溶剂均从商业供应商处获得，且无需进一步纯化即可使用。1H、13C和19F NMR光谱是在Varian Mercury-400、Bruker DRX-500或配备DCH冷冻探针的Bruker DRX-600上记录的。使用Luknova SuperSep SiO2柱，在Teledyne IscoCombiFlash NextGen 300+上进行正相色谱。制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)是在Agilent 1260Infinity LC系统上，使用Gemini NX-C18柱(
Figure BDA0003321903570000602
孔径，5μm粒度，150x21.2mm尺寸，流动相A＝0.1％TFA的H2O，流动相B＝0.1％TFA的MeCN)进行的。最终化合物纯度通过分析型RP-HPLC来测定，且纯度>95％。质谱数据在The Scripps ResearchInstitute Center for Mass Spectrometry(ESI-MS；Agilent Technologies,LC/MSD TOFG1969A and GC-MS；Agilent Technologies,6850Network GC System,5973MassSelective Detector)处收集。
缩写
Boc＝叔丁氧羰基
Figure BDA0003321903570000601
A＝二(1-金刚烷基)-正丁基膦
CDI＝羰基二咪唑
DCM＝二氯甲烷；
DIAD＝偶氮二甲酸二异丙酯
DIPEA＝二异丙基乙胺；
DMF＝N,N-二甲基甲酰胺
DMP＝戴斯-马丁高碘酸
DMPU＝N,N’-二甲基丙烯脲
HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
HMPT＝N-[双(二甲氨基)磷酰基]-N-甲基–甲胺
HPLC＝高效液相色谱
LDA＝二异丙基氨基锂
NBS＝N-溴代琥珀酰亚胺
NMR＝核磁共振
MOM＝甲氧甲基
RuPhos＝2-二环己基膦基-2′,6′-二异丙氧基联苯
TBAF＝四丁基氟化铵
TBS＝叔丁基二甲基甲硅烷基
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
THP＝四氢吡喃
Xantphos＝4,5-双(联苯膦基)-9,9-二甲基呫吨
化合物(22)和(23).化合物22和23是外消旋体8的对映异构体，并且在WatersUPC2 SFC上使用Daicel IA柱(3μm，4.6x250mm)在等度条件(4mL/min，30％MeOH/CO2，1600psi反压力)下在30℃下对它们进行分离。对映异构体通过UV吸光度(265nm)检测并手动分级分离。分离后，将各个对映异构体在相同的仪器和方法上进行分析，但通过UV吸光度(245nm)进行检测。
7-(二乙氨基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮(25).在冰水浴上向7-氨基-4-甲基喹啉-2(1H)-酮(174mg,1当量)、乙酸(240mg,4当量)和NaBH(OAc)3(848mg,4当量)于1,2-二氯乙烷(10mL)中的搅拌悬浮液中添加乙醛(154mg,3.5当量)。将黄色悬浮液在0℃下搅拌3小时，在此期间结晶原始材料逐渐溶解。将混合物在DCM(20mL)与水(20mL)之间分配，然后用DCM(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100％EtOAc)纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的25(177mg,77％)。ESI-MS[M+1]：231.0。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.76(s,1H),7.48(d,J＝9.1Hz,1H),6.63(dd,J＝9.1,2.5Hz,1H),6.30(d,J＝2.5Hz,1H),6.23(s,1H),3.45(q,J＝7.1Hz,4H),2.42(s,3H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H)。
7-(二乙氨基)-2-亚氨基-2H-色烯-3-甲腈(26).标题化合物根据文献方法来制备，参见，例如：Zhou,J.,等人RSC Adv.2014,93(4),51589-51592。
7-(二乙氨基)-4-羟基-2H-色满-2-酮(27).标题化合物根据文献方法来制备，参见，例如：Pan,S.,等人Chem.Comm.2018,39(54),4955-4958。
方案1.
Figure BDA0003321903570000631
7-(苄氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(28).向7-氨基-4-甲基-2H-色满-2-酮(174mg,1当量)和苯甲醛(159mg,1.5当量)于MeCN(5mL)中的搅拌溶液中添加NaBH(OAc)3(414mg,2当量)并将黄色悬浮液在室温下搅拌16小时。将混合物在DCM(20mL)与水(20mL)之间分配，然后用DCM(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色固体状的28(80mg，30％)。ESI-MS[M+1]：266.0。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.41–7.33(m,5H),7.36–7.27(m,1H),6.57(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.3Hz,1H),5.98(q,J＝1.2Hz,1H),4.76(s,1H),4.41(s,2H),2.34(d,J＝1.2Hz,3H)。
7-((呋喃-3-基甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(29).使用呋喃-3-甲醛，类似于28来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：256.0。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.43(dt,J＝7.3,1.6Hz,2H),7.38(d,J＝8.6Hz,1H),6.57(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.52(d,J＝2.3Hz,1H),6.42(dd,J＝1.9,0.9Hz,1H),5.99(d,J＝1.3Hz,1H),4.56(t,J＝5.5Hz,1H),4.24(d,J＝4.5Hz,2H),2.35(d,J＝1.2Hz,3H)。
4-甲基-7-((3-苯基丙基)氨基)-2H-色满-2-酮(30).使用3-苯基丙醛，类似于28来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：294.0。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.40–7.29(m,3H),7.28–7.19(m,3H),6.47(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.43(d,J＝2.3Hz,1H),6.00(q,J＝1.2Hz,1H),4.18(s,1H),3.23(t,J＝7.0Hz,2H),2.77(t,J＝7.5Hz,2H),2.36(d,J＝1.1Hz,3H),2.06–1.96(m,2H)。
7-(乙基(3-苯基丙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(31).在冰水浴上向化合物30(1当量)和NaBH(OAc)3(3当量)于MeCN(2mL)中的搅拌溶液中添加乙醛(5当量)，并且将黄色悬浮液经16小时升温至室温。将混合物在DCM(20mL)与水(20mL)之间分配，然后用DCM(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈粘性黄色油状的31。ESI-MS[M+1]：322.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.40–7.30(m,3H),7.28–7.20(m,3H),6.56–6.47(m,2H),5.99–5.94(m,1H),3.47–3.33(m,4H),2.70(t,J＝7.7Hz,2H),2.35(d,J＝1.2Hz,3H),2.03–1.93(m,2H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H)。
7-(仲丁氧基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(32).将7-羟基-4-甲基香豆素(176mg,1当量)、2-溴丁烷(274mg,2当量)、K2CO3(276mg,2mmol)和KI(83mg,0.5mmol)于DMF(5mL)中的搅拌混合物在80℃下在氩气下加热过夜。将混合物用45mL水稀释，然后用乙醚(3x20mL)萃取，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，己烷中的25％EtOAc)纯化残余物，得到呈粘性淡黄色油状的32。ESI-MS[M+1]：233.0。
4-甲基-7-丙氧基-2H-色满-2-酮(33).使用1-溴丙烷，类似于32来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：219.0。
7-(2-氨基乙氧基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(34).将7-羟基-4-甲基-2H-色满-2-酮(132mg)、(2-溴乙基)氨基甲酸叔丁酯(203mg)、K2CO3(276mg)和KI(83mg)于DMF(5mL)中的搅拌混合物在70℃下在氩气下加热过夜。将混合物用45mL水稀释，然后用DCM(3x20mL)萃取，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱纯化残余物。将中间体溶解在1.5mLDCM中并向其中添加500μL TFA，并将溶液在室温下搅拌2小时。将残余物在真空中浓缩并通过反相制备型HPLC纯化，得到呈粘性淡黄色油状的标题化合物。ESI-MS[M+1]：220.0。
7-(苄基(乙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(35).使用28作为起始材料，类似于31来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：294.0。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42–7.31(m,3H),7.31–7.24(m,1H),7.24–7.19(m,2H),6.63(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.57(d,J＝2.6Hz,1H),5.98(q,J＝1.2Hz,1H),4.62(s,2H),3.58(q,J＝7.1Hz,2H),2.34(d,J＝1.1Hz,3H),1.34–1.25(m,4H)。
4-甲基-7-(吡咯烷-1-基)-2H-色满-2-酮(36).将7-氨基-4-甲基-2H-色满-2-酮(175mg,1mmol)、1,4-二溴丁烷(259mg,1.2当量)、K2CO3(414mg)和KI(83mg,0.5mmol)于DMF(5mL)中的悬浮液在80℃下加热16小时。将混合物在DCM(20mL)与水(20mL)之间分配，然后用DCM(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，EtOAc/己烷)纯化残余物，得到黄色固体状的36。ESI-MS[M+1]：230.0。
7-(乙基(苯乙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(37).使用40作为起始材料，类似于31来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：308.0。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝8.9Hz,1H),7.39–7.31(m,2H),7.30–7.20(m,3H),6.64(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.58(d,J＝2.6Hz,1H),5.99(q,J＝1.2Hz,1H),3.63–3.56(m,2H),3.36(q,J＝7.1Hz,2H),2.96–2.89(m,2H),2.38(d,J＝1.2Hz,3H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H)。
7-(苄氧基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(38).使用苄基溴，类似于34来制备标题化合物。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.53(d,J＝8.8Hz,1H),7.49–7.34(m,4H),6.96(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.92(d,J＝2.5Hz,1H),6.16(q,J＝1.2Hz,1H),5.16(s,1H),2.42(d,J＝1.2Hz,2H)。
4-甲基-7-((1-苯乙基)氨基)-2H-色满-2-酮(39).使用(1-溴乙基)苯和7-氨基-4-甲基-2H-色满-2-酮作为起始材料，类似于34来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：280.0。
4-甲基-7-(苯乙基氨基)-2H-色满-2-酮(40).使用2-苯乙醛，类似于28来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：280.0。
4-甲基-7-(1-苯丙氧基)-2H-色满-2-酮(41).使用(1-溴丙基)苯，类似于32来制备标题化合物，得到白色固体状的41(158.4mg,54％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.40–7.24(m,3H),6.88(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.74(d,J＝2.5Hz,1H),6.12–6.07(m,1H),5.09(dd,J＝7.3,5.6Hz,1H),2.36(d,J＝1.3Hz,3H),2.07(dq,J＝14.7,7.3Hz,1H),1.93(ddd,J＝13.5,7.3,5.7Hz,1H),1.03(t,J＝7.4Hz,3H)。
7-(二苯甲基氧基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(42).使用(溴亚甲基)二苯，类似于32来制备标题化合物。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.51–7.25(m,10H),6.99(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.87(d,J＝2.5Hz,1H),6.29(s,1H),6.13(q,J＝1.2Hz,1H),2.38(d,J＝1.2Hz,2H)。
4-甲基-7-(2-苯丙氧基)-2H-色满-2-酮(43).使用4-甲基苯磺酸2-苯基丙酯，类似于32来制备标题化合物，得到白色固体状的43(60.3mg，71％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.53(d,J＝8.8Hz,1H),7.49–7.34(m,5H),6.96(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.92(d,J＝2.5Hz,1H),6.16(q,J＝1.2Hz,1H),5.16(s,2H),2.42(d,J＝1.2Hz,3H),1.29(s,3H)。
7-(1-(4-氟苯基)乙氧基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(44)使用1-(1-溴乙基)-4-氟苯，类似于32来制备标题化合物。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.39–7.31(m,2H),7.10–7.01(m,2H),6.86(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.74(d,J＝2.5Hz,1H),6.12(q,J＝1.2Hz,1H),5.37(q,J＝6.4Hz,1H),2.38(d,J＝1.3Hz,3H),1.68(d,J＝6.4Hz,3H)。
4-甲基-7-(1-(邻甲苯基)乙氧基)-2H-色满-2-酮(45).使用1-(1-溴乙基)-2-甲基苯，类似于32来制备标题化合物，得到白色固体状的58(172.7mg，78％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.45(d,J＝8.8Hz,1H),7.39–7.33(m,1H),7.23–7.13(m,3H),6.84(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.61(d,J＝2.5Hz,1H),6.10(q,J＝1.3Hz,1H),5.53(q,J＝6.4Hz,1H),2.46(s,3H),2.39–2.35(m,3H),1.67(d,J＝6.4Hz,3H)。
4-甲基-7-(3-苯基丁氧基)-2H-色满-2-酮(46).使用4-甲基苯磺酸3-苯基丁酯，类似于32来制备标题化合物。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.48(d,J＝8.8Hz,1H),7.37–7.29(m,2H),7.23(dtd,J＝7.2,2.7,1.0Hz,3H),6.82(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.75(d,J＝2.5Hz,1H),6.14(q,J＝1.2Hz,1H),3.94(ddd,J＝9.4,6.6,5.6Hz,1H),3.88(ddd,J＝9.4,7.4,6.3Hz,1H),3.09–2.97(m,1H),2.41(d,J＝1.2Hz,3H),2.22–2.02(m,2H),1.37(d,J＝7.0Hz,3H)。
4-甲基-7-((1-苯基丙-2-基)氧基)-2H-色满-2-酮(47).使用4-甲基苯磺酸1-苯基丙-2-酯，类似于32来制备标题化合物，得到白色固体状的56(154.5mg，70％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.49(d,J＝8.5Hz,1H),7.38–7.21(m,5H),6.88–6.81(m,2H),6.14(q,J＝1.2Hz,1H),4.67(q,J＝6.1Hz,1H),3.13(dd,J＝13.8,6.1Hz,1H),2.89(dd,J＝13.8,6.5Hz,1H),2.41(d,J＝1.2Hz,3H),1.38(d,J＝6.1Hz,3H)。
4-甲基-7-(哌啶-1-基)-2H-色满-2-酮(48).使用1,5-二溴丙烷，类似于36来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：244.0。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝8.9Hz,1H),6.84(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.73(d,J＝2.5Hz,1H),6.03(t,J＝1.2Hz,1H),3.36(t,J＝5.1Hz,5H),2.38(d,J＝1.2Hz,4H),1.77–1.65(m,3H)。
7-(1-(2-氟苯基)乙氧基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(49).使用1-(1-溴乙基)-2-氟苯，类似于32来制备标题化合物，得到白色固体状的49(185.6mg，83％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.40(td,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.33–7.23(m,1H),7.22–7.05(m,2H),6.88(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.76(d,J＝2.5Hz,1H),6.12(q,J＝1.3Hz,1H),5.72(q,J＝6.4Hz,1H),2.38(d,J＝1.2Hz,3H),1.71(d,J＝6.4Hz,3H)。
7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-2H-色满-2-酮(50).标题化合物使用文献方法来制备，参见，例如：Kawaguchi,M.,等人Chem.Comm.2018,73(54),10371-10374。
7-(1-(2,6-二氟苯基)乙氧基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(51).使用2-(1-溴乙基)-1,3-二氟苯，类似于36来制备标题化合物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.47(d,J＝8.8Hz,1H),7.25(tt,J＝8.4,6.3Hz,1H),6.95–6.85(m,3H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.12(q,J＝1.2Hz,1H),5.81(q,J＝6.6Hz,1H),2.38(d,J＝1.2Hz,3H),1.84(d,J＝6.6Hz,3H)。
7-(二乙氨基)-1,4-二甲基喹啉-2(1H)-酮(52).在氩气下，在冰上将25(40mg,1当量)在DMF(1mL)中的溶液添加到NaH(8.2mg，60％矿物油中，1.2当量)中，并将悬浮液在冰上搅拌10分钟。向其中添加甲基碘(30mg，1.2当量)的DMF(1mL)溶液并在室温下搅拌16小时。将反应用1mL饱和NH4Cl水溶液淬灭。将混合物用20mL H2O稀释并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过快速柱色谱法纯化残余物，得到呈棕褐色固体状的标题化合物。ESI-MS[M+1]：245.0。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.51(d,J＝9.0Hz,1H),6.64(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),6.42(d,J＝2.4Hz,1H),6.30(s,1H),3.67(s,3H),3.48(q,J＝7.1Hz,4H),2.39(s,3H),1.26(t,J＝7.1Hz,6H)。
方案2.
Figure BDA0003321903570000691
3-溴-7-(二乙氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(Int 2-1).标题中间体通过文献方法来制备，参见，例如：Kitamura,K.,等人Bioorg.Med.Ch em.Lett.2014,24(24),5660-5662。
7-(二乙氨基)-4-甲基-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-2H-色满-2-酮(Int 2-2).将Int 2-1(1.3g,4.19mmol,1当量)、三氟(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)硼酸钾(1.09g,4.61mmol,1.1当量)、双(1-金刚烷基)-丁基-磷烷(300mg,838μmol,0.2当量)、Pd(OAc)2(282mg,1.26mmol,0.3当量)和Cs2CO3(4.10g,12.5mmol,3当量)于二噁烷(30mL)和H2O(13mL)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，然后将混合物在100℃下在N2气氛下搅拌12小时。反应混合物通过添加H2O(300mL)加以淬灭，接着用EtOAc(100mL×3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。通过反相制备型HPLC纯化残余物，得到呈黄色固体状的Int 2-2(1.2g，3.34mmol，79％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.44-7.39(m,1H),6.64-6.58(m,1H),6.51(d,J＝2.8Hz,1H),4.59(t,J＝4.0Hz,1H),3.94-3.77(m,2H),3.59(td,J＝6.9,9.6Hz,1H),3.53-3.45(m,1H),3.41(q,J＝6.8Hz,4H),2.98-2.89(m,2H),2.42-2.36(m,3H),1.81-1.72(m,1H),1.72-1.62(m,1H),1.59-1.43(m,4H),1.20(t,J＝6.8Hz,6H)。
7-(二乙氨基)-3-(羟甲基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(Int 2-3).将Int 2-1(3g,9.67mmol,1当量)、三丁基甲锡烷基甲醇(4.04g,12.6mmol,1.3当量)和Pd(PPh3)4(559mg,484μmol,0.05当量)于二噁烷(30mL)中的混合物用氮气鼓泡并密封小瓶。将混合物在100℃下搅拌16小时，然后在120℃下搅拌6小时。通过硅胶柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯10/1至1/1)纯化混合物。收集所需级分并在真空下浓缩，得到呈黄色固体状的Int 2-3(924mg，3.39mmol，35％产率，96％纯度)。LC-MS[ESI,M+1]：262。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.45(d,J＝9.2Hz,1H),6.62(dd,J＝2.8,9.2Hz,1H)6.50(d,J＝2.8,1H),4.67(d,J＝6.8,1H),3.42(q,J＝7.2,4H),2.97(t,J＝6.8,1H),2.42(s,1H),1.22(q,J＝7.2,4H)。
7-(二乙氨基)-3-(2-羟乙基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(53).将Int 2-2(1.9g,5.29mmol,1当量)在HCl/二噁烷(4M,50mL)中的溶液在20℃下搅拌30分钟。在减压下浓缩混合物。通过反相制备型HPLC纯化残余物。收集所需级分并冻干以得到呈棕色胶状的53(734mg,45％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.58-7.48(m,1H),6.75-6.63(m,1H),6.52-6.42(m,1H),4.61-4.53(m,1H),3.75-3.59(m,2H),3.46-3.37(m,6H),2.84-2.73(m,2H),2.37-2.27(m,3H),1.73-1.52(m,2H),1.49-1.34(m,4H),1.16-1.07(m,6H)。LC-MS[ESI,M+1]：276.1。
方案3.
Figure BDA0003321903570000711
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酸乙酯(Int3-1-1).向3-二乙氨基酚(412.5mg,1当量)和2-乙酰琥珀酸二乙酯(703mg,1.3当量)于甲苯(5mL)中的搅拌溶液中添加ClTi(OiPr)3(717mg)并将深棕色悬浮液回流过夜。向其中添加罗谢尔盐饱和水溶液(10mL)并通过硅藻土过滤乳液。将滤液用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过快速柱色谱法纯化残余物，得到呈棕色油状的标题中间体与异丙醚的混合物。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酸(54).向Int3-1-1于H2O(2mL)、MeOH(2mL)和THF(2mL)中的溶液中添加一水氢氧化锂(3当量)并将淡棕色悬浮液在室温下搅拌16小时。通过添加1M HCl酸化混合物并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到棕色固体。通过反相制备型HPLC纯化样品，得到呈黄色固体状的标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：290.0。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.59(d,J＝9.0Hz,1H),6.95(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.80(d,J＝2.5Hz,1H),3.78(s,2H),3.51(q,J＝7.1Hz,3H),2.44(s,2H),1.23(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)丙酸乙酯(Int3-1-2).使用2-乙酰戊二酸二乙酯，类似于Int 3-1-1来制备标题中间体。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-苯乙基乙酰胺(55).向54(40mg,1当量)于DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加CDI(33mg,1.5当量)并在室温下搅拌1小时，在此期间颜色由橙红色变为黄色。向其中添加2-苯基乙-1-胺(49mg，3当量)并在室温下再搅拌1小时。将混合物用19mL H2O稀释并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2,0至45％EtOAc，于己烷中)纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的标题化合物。在其他实例中，使用反相制备型HPLC完成纯化。ESI-MS[M+1]：393.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.45(d,J＝9.1Hz,1H),7.25–7.16(m,2H),7.16–7.09(m,3H),6.65(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.53(d,J＝2.6Hz,1H),6.46(s,1H),3.53–3.40(m,8H),2.78(t,J＝7.1Hz,2H),2.46(s,3H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H)。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(3-苯基丙基)乙酰胺(56).使用3-苯基丙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：407.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.46(d,J＝9.1Hz,1H),7.30–7.22(m,2H),7.25–7.13(m,3H),6.64(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.57–6.49(m,2H),3.54(s,2H),3.44(q,J＝7.1Hz,4H),3.24(td,J＝7.1,5.9Hz,2H),2.66–2.58(m,2H),2.52(s,3H),1.89–1.76(m,2H),1.23(t,J＝7.1Hz,6H)。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(4-苯丁基)乙酰胺(57).使用4-苯基丁-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：421.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.45(d,J＝9.1Hz,1H),7.25–7.16(m,2H),7.13(d,J＝7.0Hz,3H),6.65(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.53(d,J＝2.6Hz,1H),6.46(s,1H),3.53–3.40(m,9H),2.78(t,J＝7.1Hz,2H),2.46(s,3H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H)。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)乙酰胺(58).使用N1,N1-二甲基乙-1,2-二胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：360.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.45(d,J＝9.0Hz,1H),6.72(s,1H),6.62(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),3.55(s,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.30(q,J＝6.1Hz,2H),2.50(s,3H),2.41(q,J＝6.0Hz,2H),2.24(s,6H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(3-(二甲氨基)丙基)乙酰胺(59).使用N1,N1-二甲基丙-1,3-二胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：374.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.44(d,J＝9.0Hz,1H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),3.55(s,3H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.28(dt,J＝10.0,5.0Hz,3H),2.45(s,4H),2.32(t,J＝6.6Hz,3H),2.09(s,6H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-甲基乙酰胺(60).使用甲胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：303.1。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.45(d,J＝9.1Hz,1H),6.62(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.53–6.43(m,2H),3.54(s,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),2.76(d,J＝4.9Hz,3H),2.50(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N,N-二甲基乙酰胺(61).使用二甲胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：317.1 1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),3.70(s,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.98(s,3H),2.39(s,3H),1.21(t,J＝7.0Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)丙酸(62).使用Int3-1-2，类似于54来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：304.0
N-苄基-3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)丙烯酰胺(63).使用62和苄胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：393.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.35–7.14(m,6H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.47(d,J＝2.6Hz,1H),5.24(s,1H),4.38(t,J＝6.0Hz,3H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.95(t,J＝7.5Hz,2H),2.51(t,J＝7.5Hz,2H),2.37(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-苯乙基丙酰胺(64).使用62和2-苯乙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：407.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.0Hz,1H),7.33–7.10(m,6H),6.62(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),5.84(s,1H),3.47(dq,J＝29.3,7.1Hz,7H),2.94(t,J＝7.5Hz,2H),2.78(t,J＝7.1Hz,2H),2.44(t,J＝7.5Hz,2H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(3-苯基丙基)丙烯酰胺(65).使用62和3-苯基丙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：421.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.33–7.21(m,4H),7.25–7.08(m,6H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),3.42(q,J＝7.1Hz,3H),3.27(q,J＝6.7Hz,1H),2.95(t,J＝7.4Hz,1H),2.61(dt,J＝16.8,7.7Hz,4H),2.48(t,J＝7.4Hz,1H),2.40(s,2H),1.80(h,J＝7.3Hz,4H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-甲基丙酰胺(66).使用62和甲胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：317.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.48(d,J＝2.6Hz,1H),6.00(s,1H),3.41(q,J＝7.1Hz,4H),2.95(q,J＝7.7Hz,2H),2.78(d,J＝4.9Hz,3H),2.46(t,J＝7.5Hz,2H),2.40(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)丙烯酰胺(67).使用62和N1,N1-二甲基乙-1,2-二胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：317.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.41(d,J＝9.1Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.52(s,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),3.63(s,1H),3.41(q,J＝7.1Hz,4H),3.35(q,J＝5.7Hz,2H),2.94(dd,J＝8.4,6.8Hz,2H),2.54–2.39(m,4H),2.40(s,3H),2.28(s,5H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(3-(二甲氨基)丙基)丙烯酰胺(68).使用62和N1,N1-二甲基丙-1,3-二胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：388.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.1Hz,1H),6.93(d,J＝6.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),3.41(q,J＝7.1Hz,5H),3.30(td,J＝6.5,5.4Hz,2H),2.94(dd,J＝8.4,6.8Hz,2H),2.43(dd,J＝8.3,6.9Hz,2H),2.33(t,J＝6.6Hz,2H),2.20(s,6H),1.62(p,J＝6.6Hz,2H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
方案4.
Figure BDA0003321903570000761
(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(69).将Int 2-1(310mg,1当量)、2-(Boc-氨乙基)三氟硼酸钾(301mg,1.2当量)、RuPhos(93mg,0.2当量)和Cs2CO3(977mg,3当量)于甲苯(4.5mL)和H2O(1.5mL)中的混合物在微波管中用氩气喷洒5分钟，伴随搅拌。向其中添加Pd(dba)2(58mg,0.1当量)且进一步再喷洒1分钟。将小瓶密封并在90℃加热16小时。最初的红色双相混合物变成深橙色，并出现黑色沉淀。然后将反应物用水(15mL)稀释并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，己烷中的0至25％EtOAc)纯化残余物，得到呈黄色固体状的69(249.3mg，67％)。ESI-MS[M+1]：375.2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.42(br d,J＝9.2Hz,1H),6.60(dd,J＝2.4,9.2Hz,1H),6.50(d,J＝2.4Hz,1H),4.95-4.77(m,1H),3.41(q,J＝7.2Hz,4H),3.31(q,J＝6.4Hz,2H),2.84(br t,J＝6.7Hz,2H),2.39(s,3H),1.43(s,9H),1.21(t,J＝7.2Hz,6H)。
3-(2-氨乙基)-7-(二乙氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(Int 4-1).向69(450mg)于DCM(4mL)中的搅拌溶液中添加纯TFA(1mL)并在室温下搅拌16小时。将混合物在真空中浓缩，然后用饱和NaHCO3处理。过滤出现的黄色沉淀并用H2O洗涤，得到呈黄色固体状的标题中间体(321mg，98％)。ESI-MS[M+1]：275.2 1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.80(s,3H),7.56(d,J＝9.1Hz,1H),6.72(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),3.43(q,J＝7.0Hz,3H),3.40(s,1H),2.96–2.87(m,2H),2.82(dd,J＝8.6,6.6Hz,2H),2.37(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
N-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-苯基丙酰胺(70).使用3-苯基丙酸和Int 4-1，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：407.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.0Hz,1H),7.31–7.17(m,4H),7.23–7.09(m,2H),6.63(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),6.18(t,J＝5.0Hz,1H),3.49–3.34(m,6H),2.95(dd,J＝8.9,6.9Hz,2H),2.83(t,J＝6.8Hz,2H),2.47(dd,J＝8.9,6.9Hz,2H),1.23(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(2-氟苯乙基)丙烯酰胺(71).使用62和2-(2-氟苯基)乙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：425.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.1Hz,1H),7.28–6.93(m,6H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.95(t,J＝5.5Hz,1H),3.57–3.33(m,7H),2.97–2.78(m,6H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(3-氟苯乙基)丙烯酰胺(72).使用62和2-(3-氟苯基)乙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：425.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.0Hz,1H),7.30–7.16(m,1H),7.02–6.82(m,3H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),5.91(s,1H),3.55–3.34(m,6H),2.93(t,J＝7.5Hz,2H),2.80(dt,J＝14.1,7.0Hz,2H),2.51–2.38(m,4H),1.35–1.15(m,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(4-氟苯乙基)丙烯酰胺(73).使用62和2-(4-氟苯基)乙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：425.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.0Hz,1H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.40(t,J＝5.9Hz,3H),2.91(t,J＝7.4Hz,2H),2.83–2.70(m,9H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙烯酰胺(74).使用62和2-(吡啶-2-基)乙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：408.2。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(2-(吡啶-3-基)乙基)丙烯酰胺(75).使用62和2-(吡啶-3-基)乙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：408.2。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(2-(吡啶-4-基)乙基)丙烯酰胺(76).使用62和2-(吡啶-4-基)乙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：408.2。
3-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-(3-苯基丙基)丙烯酰胺(77).使用62和3-苯基丙-1-胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：421.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.1Hz,1H),7.26(d,J＝7.7Hz,1H),7.24–7.11(m,4H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.13(s,1H),3.50–3.37(m,7H),2.88(t,J＝6.8Hz,2H),2.63(t,J＝7.6Hz,2H),2.22–2.14(m,2H),2.02–1.90(m,2H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
方案5.
Figure BDA0003321903570000791
(4-硝基苯基)碳酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(Int5-1).在氩气下，在室温下向53(500mg,1.82mmol,1当量)和吡啶(440μL,5.46mmol,3当量)于DCM(2mL)中的搅拌溶液中逐滴添加氯甲酸4-硝基苯酯(440mg,2.18mmol,1.2当量)于DCM(2mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌3小时，在此期间溶液变成橙色并出现结晶沉淀。将混合物在DCM(20mL)与0.1M HCl水溶液(20mL)之间分配，然后用DCM(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，己烷中的0至25％EtOAc)纯化残余物，得到呈黄橙色固体状的Int5-1(621.1mg，78％)，将其储存在-20℃下。LC-MS[ESI,M+1]：441.2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.27-8.23(m,2H),7.43(d,J＝8.8Hz,1H),7.36-7.31(m,2H),6.61-6.56(m,1H),6.51(d,J＝2.8Hz,1H),4.48(t,J＝6.8Hz,2H),3.42(q,J＝7.2Hz,4H),3.11(t,J＝6.8Hz,2H),2.41(s,3H),1.22(t,J＝7.2Hz,6H)。
苄基氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(78).向Int5-1(37mg,1当量)和DIPEA(2当量)于DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加苄胺(26mg,3当量)。添加胺后，溶液立即变成亮黄色。将反应在室温下搅拌2小时，然后用20mL H2O稀释并通过添加固体Na2CO3碱化。用EtOAc(3x10mL)萃取悬浮液。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色固体的标题化合物(26.1mg,80％)。ESI-MS[M+1]：409.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.37–7.27(m,3H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.97(s,1H),4.39(d,J＝6.0Hz,2H),4.28(t,J＝7.0Hz,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,5H),3.01(t,J＝7.0Hz,2H),2.39(s,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,6H)。
甲基氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(79).使用甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：333.1。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.61(s,1H),4.23(t,J＝7.1Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.98(t,J＝7.1Hz,2H),2.80(d,J＝4.8Hz,3H),2.40(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
苯乙基氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(80).使用2-苯基乙-1-胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：423.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.38–7.20(m,4H),7.20(d,J＝7.3Hz,2H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.5Hz,1H),4.69(d,J＝6.8Hz,1H),4.23(t,J＝7.1Hz,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,6H),2.97(t,J＝7.1Hz,2H),2.82(t,J＝7.1Hz,2H),2.37(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
(3-苯基丙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(81).使用3-苯基丙-1-胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：437.2。H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),7.36–7.26(m,3H),7.26–7.15(m,3H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.68(s,1H),4.23(t,J＝7.0Hz,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.22(q,J＝6.7Hz,2H),2.99(t,J＝7.0Hz,2H),2.67(q,J＝7.4Hz,2H),2.40(s,3H),1.85(h,J＝6.8Hz,2H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
(2-(吡啶-2-基)乙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(82).使用2-(吡啶-2-基)乙-1-胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：424.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.57–8.50(m,1H),7.62(td,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.39(s,1H),7.20–7.11(m,2H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),5.37(d,J＝6.0Hz,1H),4.22(t,J＝7.0Hz,2H),3.61(q,J＝6.3Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.98(dt,J＝14.9,6.7Hz,4H),2.37(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(2-(吡啶-3-基)乙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(83).使用2-(吡啶-3-基)乙-1-胺，类似于78来制备标题化合物，得到呈棕褐色固体状的83(20.7mg,78％)。ESI-MS[M+1]：424.1。
(2-(吡啶-4-基)乙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(84).使用2-(吡啶-4-基)乙-1-胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：424.1。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.53–8.43(m,2H),7.53(d,J＝7.9Hz,1H),7.24(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.84(s,1H),4.23(t,J＝7.0Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,6H),2.97(dd,J＝8.3,5.7Hz,2H),2.83(t,J＝7.2Hz,2H),2.37(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(吡啶-2-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(85).使用吡啶-2-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：410.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.54(d,J＝4.9Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.40(d,J＝9.0Hz,1H),7.28(d,J＝5.8Hz,1H),7.19(dd,J＝7.5,5.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),5.76(t,J＝5.5Hz,1H),4.49(d,J＝5.5Hz,2H),4.28(t,J＝7.0Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.00(t,J＝6.9Hz,2H),2.38(s,3H),1.21(t,J＝7.0Hz,6H)。
(吡啶-4-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(86).使用吡啶-4-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：410.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.54(d,J＝5.1Hz,2H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.20(d,J＝5.0Hz,2H),6.61(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.5Hz,1H),5.26(d,J＝6.5Hz,1H),4.39(d,J＝6.3Hz,2H),4.29(t,J＝7.0Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.00(t,J＝7.0Hz,2H),2.38(s,3H),1.22(t,J＝7.0Hz,6H)。
(呋喃-2-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(87).使用呋喃-2-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：399.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.41(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),6.32(s,1H),6.27–6.19(m,1H),5.00(s,1H),4.36(d,J＝5.9Hz,2H),4.26(t,J＝7.0Hz,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),2.99(t,J＝7.0Hz,2H),2.37(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
(2-(1H-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(88).使用2-(1H-咪唑-4-基)乙-1-胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：413.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.67(s,1H),7.43(s,1H),6.85(s,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.48(d,J＝2.5Hz,1H),5.30(t,J＝6.2Hz,1H),4.22(t,J＝6.8Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,6H),2.96(t,J＝6.8Hz,2H),2.82(d,J＝6.6Hz,2H),2.38(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(吡啶-3-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(89).使用吡啶-3-基甲胺，类似于78来制备标题化合物，得到呈棕褐色固体状的89(18.7mg,71％)。ESI-MS[M+1]：410.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.53(dd,J＝9.1,3.6Hz,2H),7.65(d,J＝7.9Hz,1H),7.40(d,J＝9.0Hz,1H),7.25(dd,J＝7.8,5.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.25(s,1H),4.38(d,J＝6.2Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.98(t,J＝7.0Hz,2H),2.36(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(嘧啶-4-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(90).使用嘧啶-4-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：411.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.72(d,J＝4.9Hz,2H),7.42(d,J＝9.0Hz,1H),7.21(d,J＝9.9Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),5.85(s,1H),4.66(d,J＝5.1Hz,2H),4.29(t,J＝7.1Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.07–2.94(m,2H),2.41(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
(吡嗪-2-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(91).使用吡嗪-2-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：411.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.63(s,1H),8.59–8.47(m,2H),7.40(d,J＝9.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),5.63(s,1H),4.55(d,J＝5.7Hz,2H),4.28(t,J＝7.0Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.00(t,J＝7.0Hz,2H),2.38(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
((1H-吡唑-5-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(92).使用(1H-吡唑-5-基)甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：399.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.51(d,J＝2.1Hz,1H),7.40(d,J＝9.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.26–6.18(m,1H),5.55(s,1H),4.41(d,J＝5.8Hz,2H),4.26(t,J＝6.9Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.98(q,J＝5.5,4.4Hz,3H),2.36(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(嘧啶-2-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(93).使用嘧啶-2-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：411.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.71(d,J＝4.9Hz,2H),7.41(s,1H),7.21(t,J＝5.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),5.85(t,J＝5.3Hz,1H),4.66(d,J＝5.1Hz,2H),4.29(t,J＝7.0Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.02(t,J＝7.0Hz,2H),2.41(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
N-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)乙酰胺(94).使用乙酸和Int 4-1，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：317.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.26(d,J＝5.1Hz,1H),3.48–3.37(m,6H),2.87(t,J＝6.8Hz,2H),2.40(s,3H),1.95(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
N-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺(95).使用3-(吡啶-3-基)丙酸和Int 4-1，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：408.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.46(d,J＝2.2Hz,1H),8.38(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.52(dt,J＝7.9,2.0Hz,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.16(ddd,J＝7.8,4.8,0.8Hz,1H),6.61(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.46(dd,J＝6.1,3.5Hz,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,6H),2.95(dd,J＝8.5,6.9Hz,2H),2.82(t,J＝6.8Hz,2H),2.47(dd,J＝8.5,7.0Hz,2H),2.37(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
N-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基)丙酰胺(96).使用3-(吡啶-4-基)丙酸和Int 4-1，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：408.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.49–8.42(m,2H),7.42(d,J＝9.0Hz,1H),7.16–7.09(m,2H),6.62(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.48(d,J＝2.6Hz,1H),6.43(t,J＝5.1Hz,1H),3.42(qd,J＝6.8,2.9Hz,6H),2.95(dd,J＝8.6,6.9Hz,2H),2.84(t,J＝6.7Hz,2H),2.48(dd,J＝8.6,7.0Hz,2H),2.37(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
((6-氯吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(97).使用(6-氯吡啶-3-基)甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：444.6。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.31(d,J＝2.4Hz,1H),7.66–7.58(m,1H),7.39(s,1H),7.26(d,J＝8.3Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),4.35(d,J＝6.2Hz,2H),4.32(s,1H),4.27(t,J＝6.9Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.98(t,J＝6.9Hz,2H),2.36(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(吡啶-3-基甲基)脲(98).
Figure BDA0003321903570000861
向在冰水浴上的羰基二咪唑(16.5mg,1当量)于0.5mL DMF中的搅拌溶液中逐滴添加Int 4-1(28mg,1当量)于0.5mL DMF中的溶液。将黄色溶液在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下再搅拌30分钟。向其中添加吡啶-3-基甲胺(16.2mg,1.5当量)并在室温下搅拌16小时。将反应物用20mL H2O稀释并用EtOAc(3x10mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色固体的标题化合物。ESI-MS[M+1]：409.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.54(d,J＝2.0Hz,1H),8.45(dd,J＝4.8,1.7Hz,1H),7.65(dt,J＝7.9,2.0Hz,1H),7.40(d,J＝9.1Hz,1H),7.19(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),6.60(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.43(d,J＝2.6Hz,1H),5.77(s,1H),5.51(s,1H),4.39(d,J＝5.9Hz,2H),3.41(q,J＝7.1Hz,4H),3.32(q,J＝6.7Hz,2H),2.81(t,J＝7.2Hz,2H),2.37(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(2-(吡啶-3-基)乙基)脲(99).使用2-(吡啶-3-基)乙-1-胺，类似于98来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：423.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.43(dd,J＝14.1,3.4Hz,2H),7.55(d,J＝7.6Hz,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.20(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H),6.61(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.46(d,J＝2.5Hz,1H),5.27(d,J＝9.1Hz,2H),3.44(dq,J＝21.1,6.9Hz,6H),3.30(q,J＝6.7Hz,2H),2.82(q,J＝7.4Hz,4H),2.39(s,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)氨基甲酸吡啶-3-基甲酯(100).使用Int 4-1和(吡啶-3-基甲基)碳酸4-硝基苯酯，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：410.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.62(d,J＝2.1Hz,1H),8.60–8.54(m,1H),7.70(dt,J＝7.9,2.0Hz,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.30(d,J＝4.9Hz,1H),7.28(s,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.12(s,2H),3.41(dq,J＝16.2,6.8Hz,6H),2.88(t,J＝6.9Hz,2H),2.36(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
((6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(101).使用(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：478.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.66(s,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),7.62(d,J＝8.1Hz,1H),7.40(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.38(s,1H),4.46(d,J＝6.3Hz,2H),4.29(t,J＝7.0Hz,2H),3.43(q,J＝7.1Hz,5H),2.99(t,J＝6.9Hz,2H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
甲基(2-(吡啶-3-基)乙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(102).使用N-甲基-2-(吡啶-3-基)乙-1-胺，类似于78来制备标题化合物，得到呈粘性黄色油状的102(15.1mg,84％)。ESI-MS[M+1]：438.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.57–8.48(m,1H),7.65–7.54(m,1H),7.46–7.35(m,1H),7.18–7.05(m,2H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.19(ddt,J＝20.8,13.8,7.0Hz,2H),3.63(dt,J＝14.5,7.4Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.96(q,J＝7.3,5.9Hz,5H),2.87(s,2H),2.80(s,2H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
(5-乙酰胺基吡啶-2-基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(103).使用N-(6-氨基吡啶-3-基)乙酰胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：453.2。
氮杂环丁烷-1,3-二甲酸1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)3-甲酯(104).使用氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：417.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.23(t,J＝6.9Hz,2H),4.15(d,J＝7.5Hz,4H),3.81–3.68(m,5H),3.49–3.35(m,5H),2.98(t,J＝6.9Hz,2H),2.40(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
4-(((2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙氧基)羰基)氨基)哌啶-1-甲酸乙酯(105).使用4-氨基哌啶-1-甲酸乙酯，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：474.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.5Hz,1H),4.65(d,J＝8.0Hz,1H),4.14(q,J＝7.1Hz,3H),3.42(q,J＝7.1Hz,6H),2.39(s,4H),1.24(dt,J＝20.8,6.9Hz,17H)。
3-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(106).使用吡咯烷-3-基甲醇，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：403.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,2H),6.61(dd,J＝9.0,2.5Hz,2H),6.50(d,J＝2.6Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,10H),1.22(t,J＝7.1Hz,13H)。
4-(环丙基磺酰基)哌嗪-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(107).使用1-(环丙基磺酰基)哌嗪，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：492.3。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.28(t,J＝7.0Hz,2H),3.57(s,4H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.27(d,J＝6.5Hz,4H),3.01(t,J＝7.0Hz,2H),2.39(s,3H),2.25(tt,J＝7.9,4.9Hz,1H),1.26–1.12(m,7H),1.16(s,1H),1.07–0.96(m,2H)。
3,3-二氟氮杂环丁烷-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(108).使用3,3-二氟氮杂环丁烷，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：395.1。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝9.0Hz,1H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.36–4.23(m,6H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.00(t,J＝6.9Hz,2H),2.39(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
4-(吡嗪-2-基)哌嗪-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(109).使用2-(哌嗪-1-基)吡嗪，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：466.3。1HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.15(d,J＝1.6Hz,1H),8.08(dd,J＝2.6,1.5Hz,1H),7.90(d,J＝2.6Hz,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),3.60(s,9H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.03(t,J＝7.0Hz,2H),2.41(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
2-硫代-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯2,2-二氧化物(110).使用2-硫代-6-氮杂螺[3.3]庚烷2,2-二氧化物，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：449.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.33(s,4H),4.24(t,J＝6.7Hz,2H),4.20(s,4H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.02–2.93(m,2H),2.38(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
3-羟基-3-甲基吡咯烷-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(111).使用3-甲基吡咯烷-3-醇，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：403.2。1HNMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),7.28(s,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.35–4.14(m,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,5H),3.03(td,J＝13.8,13.3,6.7Hz,1H),3.01–2.91(m,1H),2.40(s,3H),1.99–1.89(m,1H),1.94–1.79(m,1H),1.43(d,J＝9.4Hz,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
硫代吗啉-4-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯1,1-二氧化物(112).使用硫吗啉1,1-二氧化物，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：437.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.62(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.31(t,J＝6.7Hz,2H),3.97(s,4H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.03(q,J＝6.8,5.3Hz,6H),2.39(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
4-(3-甲基异噁唑-5-基)哌嗪-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(113).使用3-甲基-5-(哌嗪-1-基)异噁唑，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：469.3。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.41(d,J＝9.0Hz,1H),6.61(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.29(t,J＝6.9Hz,2H),3.58(s,9H),3.43(q,J＝7.1Hz,4H),3.02(t,J＝7.0Hz,2H),2.40(s,3H),2.24(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(114).使用1-(吡啶-2-基)哌嗪，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：465.3。1HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.55(dt,J＝4.5,1.5Hz,1H),7.64(td,J＝7.7,1.9Hz,1H),7.42(d,J＝9.0Hz,1H),7.15(dd,J＝7.5,5.0Hz,2H),6.60(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.51(d,J＝2.6Hz,1H),4.35(s,1H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.02(t,J＝7.1Hz,2H),2.88(ddt,J＝15.7,8.4,3.6Hz,4H),2.42(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
4-(2H-四唑-5-基)哌嗪-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(115).使用1-(2H-四唑-5-基)哌嗪，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：456.2。
4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(116).使用2-(哌嗪-1-基)嘧啶，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：466.2。1HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.33(d,J＝4.7Hz,2H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),6.60(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.57–6.48(m,2H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),3.82(s,4H),3.54(s,4H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.03(t,J＝7.0Hz,2H),2.41(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
(3-乙酰胺基苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(117).使用N-(3-(氨甲基)苯基)乙酰胺，类似于78来制备标题化合物，得到呈白色固体状的117(11.0mg,59％)。ESI-MS[M+1]：466.2。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.91(s,1H),7.66(d,J＝7.6Hz,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.28(s,1H),7.25(d,J＝7.9Hz,1H),7.04(s,1H),6.97(d,J＝7.6Hz,1H),6.47(d,J＝2.6Hz,1H),4.35(d,J＝6.2Hz,2H),4.31(s,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),3.01(t,J＝6.9Hz,2H),2.38(s,3H),2.18(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,6H)。
4-(吡啶-3-基甲基)哌啶-1-甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(118).使用3-(哌啶-4-基甲基)吡啶，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：478.3。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.47(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),8.41(d,J＝2.2Hz,1H),7.49–7.37(m,2H),7.23(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),6.60(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),4.23(t,J＝7.0Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,5H),2.99(t,J＝7.1Hz,3H),2.68(t,J＝12.9Hz,3H),2.54(d,J＝7.1Hz,2H),2.38(s,3H),1.68(ddp,J＝11.0,7.3,3.6Hz,1H),1.64(s,1H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
4-((((2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲酸(119).使用4-(氨甲基)苯甲酸，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：453.2。
(4-((氨氧基)羰基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(120).使用119和氯化铵，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：468.2。
(4-(((甲氨基)氧基)羰基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(121).使用119和甲胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：482.2。
(4-(((二甲氨基)氧基)羰基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(122).使用119和二甲胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：496.3。
3-((((2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲酸(123).使用3-(氨甲基)苯甲酸，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：453.2。
(3-((氨氧基)羰基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(124).使用123和氯化铵，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：468.2。
(3-(((甲氨基)氧基)羰基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(125).使用123和甲胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：482.2。
(3-(((二甲氨基)氧基)羰基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(126).使用123和二甲胺，类似于55来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：496.3。
((5-乙酰胺基吡啶-2-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(127).使用N-(6-(氨甲基)吡啶-3-基)乙酰胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：467.2。
((5-乙酰胺基吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(128).使用N-(5-(氨甲基)吡啶-3-基)乙酰胺，类似于78来制备标题化合物，得到呈淡黄色固体状的24(10.3mg,65％)。ESI-MS[M+1]：467.2。
方案6
Figure BDA0003321903570000941
3-(氨甲基)-7-(二乙氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(Int 6-1).使用N-(5-(氨甲基)吡啶-3-基)乙酰胺，类似于Int 4-1来制备标题中间体，得到呈黄色固体状的Int 6-1(683mg,15％，经2步)。ESI-MS[M+1]：261。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.29(br s,3H),7.66(d,J＝9.2Hz,1H),6.88-6.72(m,1H),6.68-6.53(m,1H),3.91(q,J＝5.6Hz,2H),3.44(q,J＝7.2Hz,4H),2.47(s,3H),1.11(t,J＝7.2Hz,6H)。
3-((7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)甲基)咪唑烷-2,4-二酮(129).以来自Int 6-1的2个步骤来制备标题化合物。首先，与制备化合物98类似地进行与甘氨酸甲酯盐酸盐的尿素形成，并通过快速柱色谱法(SiO2，EtOAc/己烷)纯化尿素中间体。其次，将尿素中间体(25mg)在5M HCl水溶液中回流1小时。将溶液用固体Na2CO3中和并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100％EtOAc)纯化残余物，得到呈黄色固体状的标题化合物。ESI-MS[M+1]：344.1。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)咪唑烷-2,4-二酮(130).类似于129，从Int 4-1开始，以两步制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：358.1。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-甲脲(131).使用甲胺，类似于98来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：332.1。
(2-(吡啶-2-基氨基)乙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(132).使用N1-(吡啶-2-基)乙-1,2-二胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：439.2。
(3-(二甲氨基)丙基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(133).使用N1,N1-二甲基丙-1,3-二胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：404.2。
N,N-二乙基-4-甲基喹啉-7-胺(134).将化合物25(30mg)于POCl3(2mL)中的搅拌溶液在100℃下加热1小时。然后，将溶液倒在冰上并用固体Na2CO3碱化。用EtOAc(3x20mL)萃取悬浮液。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物溶于(5mL)乙酸中并向其中添加10％钯碳(10mg)。在室温下使用氢气球(1atm)将悬浮液氢化1小时，然后通过硅藻土过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈粘性亮黄色油状的标题化合物。ESI-MS[M+1]：215.0。
(3-((二甲氨基)甲基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(135).使用1-(3-(氨甲基)苯基)-N,N-二甲基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：466.2。
7-(二乙氨基)-4-乙基-2H-色满-2-酮(136).使用3-氧代戊酸甲酯，类似于Int 3-1-1来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：246.0。
((1H-吲哚-5-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(137).使用(1H-吲哚-5-基)甲胺。类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：448.2。
((6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(138).使用5-(氨甲基)吡啶-2(1H)-酮，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：426.2。
(异喹啉-1-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(139).使用异喹啉-1-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：460.3。
(异喹啉-4-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(140).使用异喹啉-4-基甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：460.3。
(3-(1H-咪唑-4-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(141).使用(3-(1H-咪唑-4-基)苯基)甲胺，类似于78来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的141(13.1mg,61％)。ESI-MS[M+1]：475.3。
((1H-苯并[d]咪唑-6-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(142).使用(1H-苯并[d]咪唑-6-基)甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：449.2。
((1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(143).使用7-(氨甲基)异喹啉-1(2H)-酮，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：476.3。
(3-氨基甲酰基-4-氟苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(144).使用5-(氨甲基)-2-氟苯甲酰胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：470.2。
(3-氨基甲酰基-5-氟苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(145).使用5-(氨甲基)-3-氟苯甲酰胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：470.2。
(哌啶-3-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(146).以两步来制备标题化合物。首先，使用3-(氨甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，类似于78来制备Boc-保护的胺，并通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)纯化。其次，向Boc保护的胺于DCM(2mL)中的搅拌溶液中添加纯TFA(1mL)并将混合物在室温下搅拌16小时。将混合物在减压下浓缩并通过反相制备型HPLC纯化，得到黄色胶状的146(10.2mg，71％，经2步)。ESI-MS[M+1]：416.2。
(哌啶-4-基甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(147).使用4-(氨甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，类似于146来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：416.2。
((1-甲基哌啶-4-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(148).使用(1-甲基哌啶-4-基)甲胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：430.3。
(3-氨磺酰基苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(149).使用3-(氨甲基)苯磺酰胺，类似于78来制备标题化合物。ESI-MS[M+1]：488.3。
N-(4-(二乙氨基)苯基)-2-(2,5-二氧代咪唑烷-1-基)乙酰胺(150).向2-(2,5-二氧代咪唑烷-1-基)乙酸(20mg,1当量)和DIPEA(50μL)于DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加HATU(53mg,1.1当量)并在室温下搅拌5min。向其中添加N1,N1-二乙苯-1,4-二胺(32μL,1.5当量)并在室温下搅拌16小时。在减压下浓缩混合物并通过反相制备型HPLC纯化。将所需级分冻干，溶解在20mM HCl水溶液中，并冻干，得到呈吸湿性白色固体状的标题化合物。ESI-MS[M+1]：305.2。
2-(2,5-二氧代咪唑烷-1-基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺(151).使用4-(三氟甲基)苯胺盐酸盐，类似于150来制备标题化合物。ESI-MS[M-1]：300.2。
方案7.
Figure BDA0003321903570000981
3-溴-4-甲基-7-(1-苯基乙氧基)-2H-色满-2-酮(Int 7-1).向4-甲基-7-(1-苯基乙氧基)-2H-色满-2-酮(50mg,1当量)于MeCN(2mL)中的搅拌溶液中添加NBS(35.6mg,0.2mmol,1.1当量)并将反应在室温下搅拌16小时。在减压下浓缩无色溶液并通过快速柱色谱法(SiO2，在己烷中的0至20％EtOAc)纯化，得到呈白色固体状的Int 7-1(58.2mg，90％)。
4-甲基-3-(吗啉代甲基)-7-(1-苯基乙氧基)-2H-色满-2-酮(152).将Int 7-1(20mg,0.056mmol,1当量)、(吗啉-4-基)甲基三氟硼酸钾(18mg,0.084mol,1.5当量)、RuPhos(5mg,0.011mmol,0.2当量)和Cs2CO3(55mg,0.17mmol,3当量)于甲苯(0.375mL)和H2O(0.125mL)中的混合物在微波小瓶中用氩气喷洒2分钟，伴随搅拌。向混合物中添加Pd(dba)2(3.2mg,0.056mmol,0.1当量)并进一步再喷洒1分钟。将小瓶密封并在90℃加热16小时。最初的红色双相混合物变成深黄橙色，并出现黑色沉淀。然后将反应物用水(15mL)稀释并用EtOAc(3x10mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过反相制备型HPLC纯化残余物，得到呈粘性无色油状的152(3.5mg，17％)。ESI-MS[M+1]：380.2。
方案8.
Figure BDA0003321903570000991
(3-(4,4,5-三甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(Int 8-1).使用(3-(4,4,5-三甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)甲胺，类似于78来制备标题中间体，得到呈黄色固体状的Int 8-1(204.4mg,86％)。LC-MS[ESI,M+1]：535.2
(3-(1H-咪唑-2-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(153).将Int 8-1(15mg,1当量)、2-碘-1H-咪唑-1-甲酸叔丁酯(12mg,1.5当量)和K2CO3(15.5mg,4当量)于1,4-二噁烷(0.9mL)和H2O(0.3mL)中的混合物在微波小瓶中用氩气喷洒2分钟，伴随搅拌。向混合物中添加Pd(PPh3)4(5mg,0.15当量)且进一步再喷洒1分钟。将小瓶密封并在90℃加热8小时。然后将反应物用水(20mL)稀释并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，10至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色固体状的153。LC-MS[ESI,M+1]：475.3。
(3-(吡啶-2-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(154).使用2-氯吡啶，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：486.3。
(3-(嘧啶-2-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(155).使用2-氯嘧啶，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：487.3。
(3-(嘧啶-5-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(156).使用5-溴嘧啶，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：487.3。
(3-(吡嗪-2-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(157).使用氯吡嗪，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：487.3。
方案9.
Figure BDA0003321903570001011
2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙醛(Int 9-1)
在0℃下向53(200mg,726μmol,1当量)于DCM(5mL)中的混合物中添加DMP(462mg,1.09mmol,1.5当量)。将混合物在20℃下搅拌12小时。通过硅藻土垫过滤反应混合物并且在减压下浓缩滤液。通过反相快速色谱法纯化残余物。收集所需级分并用饱和NaHCO3溶液中和，在真空下浓缩以除去MeCN，并用EtOAc(2×50mL)萃取。将有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到呈粘性亮黄橙色油状的Int 9-1(160mg，574μmol，79％产率，98％纯度)，其可立即用于下一步。LC-MS[ESI,M+1]：274.2。
4-氨基-4-(((2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(Int 9-2).向Int 9-1(380mg,1.39mmol,1当量)于MeOH(5mL)中的溶液中添加4-氨基-4-(氨甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(351mg,1.53mmol,1.1当量)和AcOH(83.5mg,1.39mmol,79.5uL,1当量)。在20℃下搅拌混合物1小时。然后在0℃下添加NaBH3CN(262mg,4.17mmol,3当量)，并将混合物在20℃下搅拌12小时。完成后，将反应混合物在0℃下用水(1mL)淬灭，然后在减压下浓缩。通过反相制备型HPLC纯化残余物。收集所需级分并用饱和NaHCO3溶液中和，在真空下浓缩以除去MeCN，并用EtOAc(6×30mL)萃取。将有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到呈粘性黄色油状的化合物Int 9-2(275mg，554μmol，40％产率，98％纯度)。LC-MS[ESI,M+1]：487.5。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-2-氧代-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(Int 9-3).在0℃下，在N2下向Int 9-2(260mg,534μmol,1当量)于DCM(10mL)中的混合物中添加CDI(260mg,1.60mmol,3当量)。在20℃下搅拌混合物12小时。用水(1mL)淬灭反应混合物，然后经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过反相制备型HPLC纯化残余物。收集所需级分并用饱和NaHCO3溶液中和，在真空下浓缩以除去MeCN，并用EtOAc(3×30mL)萃取。将有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到呈粘性黄色油状的Int 9-3(186mg，359μmol，67％产率，99％纯度)，其在真空下固化。LC-MS[ESI,M+1]：513.4。1H NMR(400MHz,CDCl3-d)δ＝7.40(d,J＝9.2Hz,1H),6.60(dd,J＝2.4Hz,8.8HZ,1H),6.50(d,J＝2.4Hz,1H),4.66(s,1H),3.47-3.35(m,12H),2.92-2.80(m,2H),2.42(s,3H),1.67-1.61(m,4H),1.48(s,9H),1.21(t,J＝7.2Hz,6H)。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2-酮(Int 9-4).向Int 9-3(160mg,312μmol,1当量)于MeCN(1mL)中的混合物中添加HCl/二噁烷(4M,5mL,64.1当量)。将混合物在15℃下搅拌30min。将反应混合物在减压下浓缩。然后将残余物溶解于DCM(15mL)中并用饱和NaHCO3溶液将pH调节至8。将所分离的水层用DCM(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(5mL×1)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，得到呈黄色固体状的Int 9-4(90mg,216μmol,69％产率,99％纯度)。LC-MS[ESI,M+1]：413.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-苯基-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2-酮(158).在N2气氛下向Int 9-4(70.0mg,170μmol,1当量)和碘苯(138mg,678μmol,75.7μL,4当量)于甲苯(6mL)中的混合物中一次性添加Xantphos(19.6mg,33.9μmol,0.2当量)、Xantphos Pd G3(16.1mg,17.0μmol,0.1当量)和Cs2CO3(166mg,509μmol,3当量)。将混合物在110℃下搅拌12小时。向反应混合物中添加水(10mL)，然后用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL×1)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，DCM/MeOH＝100/1至5/1)纯化并与MeOH一起研磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(46.6mg，88.5μmol，52％产率，92.8％纯度)。LCMS[ESI,M+1]：489.4。1H NMR(400MHz,CDCl3-d)δ＝7.42(d,J＝8.8Hz,1H),7.29(s,1H),7.25(s,1H),6.93(d,J＝7.6Hz,2H),6.87(t,J＝7.2Hz,1H),6.60(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),6.50(d,J＝2.4Hz,1H),4.54(s,1H),3.41-3.31(m,8H),3.25-3.12(m,4H),2.88(t,J＝7.6Hz,2H),2.43(s,3H),1.86-1.82(m,4H),1.21(t,J＝7.2Hz,6H)。
(3-(1H-吡唑-5-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(159).使用5-溴-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：475.3。
(3-(5-甲基-1H-咪唑-4-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(160).使用4-溴-5-甲基-1H-咪唑-1-甲酸叔丁酯，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：489.3。
(3-(吡啶-2-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-3-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(161).使用3-溴吡啶，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：486.3。
(3-(吡啶-4-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(162).使用4-溴吡啶盐酸盐，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：486.3。
(3-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(163).使用3-溴吡啶-2(1H)-酮，类似于153来制备标题化合物，得到呈白色固体状的163(4.4mg,40％)。LC-MS[ESI,M+1]：502.3。
(3-(1H-吡唑-4-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(164).使用4-溴-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：475.3。
(3-(1H-1,2,4-三唑-5-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(165).使用5-溴-1H-1,2,4-三唑-1-甲酸叔丁酯，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：476.3。
(3-(哒嗪-3-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(166).使用3-氯哒嗪，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：487.3。
(3-(噁唑-2-基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(167).使用2-氯噁唑，类似于153来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：476.3。
4-甲基-7-(戊-3-基)-2H-色满-2-酮(168).将7-碘-4-甲基-2H-色满-2-酮(40mg,1当量)、1,2-双(联苯磷酰基)苯(6.3mg,0.1当量)、4,4'-二-叔丁基-2,2'-联吡啶(3.8mg,0.1当量)和NiI2(9.4mg,0.214当量)于DMPU(1mL)中的混合物用氩气喷洒3min，伴随搅拌。在氩气流下，依次添加吡啶(2.3μL,0.2当量)、3-溴戊烷(25.4mg,1.2当量)和锰金属(15.4mg,2当量)。密封小瓶并将深红色/灰色悬浮液在80℃下加热16小时，变成深橙色/棕色，最后变成深黄色/棕色。通过硅藻土过滤悬浮液并用EtOAc(20mL)稀释。将有机层用H2O(2x20mL)洗涤，用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥并浓缩。通过反相制备型HPLC纯化残余物，得到呈粘性无色油状的标题化合物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.17–7.08(m,2H),6.26(q,J＝1.3Hz,1H),2.51–2.39(m,4H),1.83–1.68(m,2H),1.67–1.51(m,2H),0.80(t,J＝7.4Hz,6H)。
4-甲基-7-(三氟甲基)-2H-色满-2-酮(169).将7-碘-4-甲基-2H-色满-2-酮(30mg,1当量)、CuI(4mg,0.2当量)、1,10-菲咯啉(3.8mg,0.2当量)和KF(18.3mg,3当量)的混合物在氩气下置于密封的微波小瓶中。此后，依次添加DMSO(0.5mL)、B(OMe)3(55mg,5当量)和TMSCF3(75mg,5当量)。将深橙色溶液在60℃下搅拌16小时并变成深绿色。然后将反应物用水(20mL)稀释并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，0至15％EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色固体状的标题化合物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.75(d,J＝8.3Hz,1H),7.64–7.54(m,2H),6.43(q,J＝1.4Hz,1H),2.51(d,J＝1.3Hz,3H)。19F NMR(376MHz,氯仿-d)δ-63.15ppm。
(3-(N-羟基氨基甲酰胺基)苄基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(170).以两步来制备标题化合物。在第一步中，类似于78的制备，使Int 5-1与3-(氨甲基)苄腈反应。将中间体化合物悬浮在EtOH(4mL)中并向搅拌的悬浮液中添加H2NOH(150μL,50％水溶液)并在室温下搅拌16小时。然后将反应物用水(20mL)稀释并用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，在己烷中的0至100％EtOAc)纯化残余物，得到呈黄色固体状的标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：467.2。
4-甲基-7-(1-(吡啶-3-基)乙氧基)-2H-色满-2-酮(171).使用3-(1-溴乙基)吡啶，类似于32来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：282.0。
4-甲基-7-(1-(吡啶-4-基)乙氧基)-2H-色满-2-酮(172).使用4-(1-溴乙基)吡啶，类似于32来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：282.0。
4-甲基-7-(1-(吡嗪-2-基)乙氧基)-2H-色满-2-酮(173).使用2-(1-溴乙基)吡嗪，类似于32来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：283.0。
4-甲基-7-(1-(吡啶-2-基)乙氧基)-2H-色满-2-酮(174).使用2-(1-溴乙基)吡啶，类似于32来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：282.0。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(175).将53(200mg,0.73mmol,1当量)、2,4-二氧代-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(215mg,0.80mmol,1.1当量)和PPh3(382mg,1.46mmol,2当量)于无水THF(5mL)中的悬浮液置于氩气下并在冰浴上冷却。经2分钟向搅拌悬浮液中逐滴添加偶氮二甲酸二异丙酯(288μL,1.46mmol,2当量)。将橙色悬浮液在冰上搅拌10分钟，然后在室温下再搅拌4小时，在此期间乙内酰脲起始材料逐渐溶解。在减压下浓缩混合物并通过快速柱色谱法(SiO2，0至50％EtOAc/己烷)纯化以提供呈粘性黄色油状的Boc-保护的螺-乙内酰脲香豆素与Ph3PO的混合物。然后向此残余物于MeOH(3mL)中的搅拌溶液中逐滴添加浓HCl(1mL)并在室温下搅拌过夜，在此期间出现白色沉淀。将反应用水(30mL)稀释并用EtOAc(15mL)洗涤一次以除去Ph3PO。此后，将水层通过添加固体Na2CO3来碱化，得到亮黄色溶液，将其用DCM(6x20mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到呈白色固体状的标题化合物(257.5mg，71％，经2步)。通过反相制备型HPLC进一步纯化样品。LC-MS[ESI,M+1]：427.4。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(1H-咪唑-4-羰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(176).使用175和1H-咪唑-4-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的176(6.6mg,37％,2HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：521.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(1H-咪唑-2-羰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(177).使用175和1H-咪唑-2-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：521.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(178).使用175和2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的176(8.1mg,46％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：548.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(179).使用2,4-二氧代-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸叔丁酯，类似于175来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的179(274.3mg,91％，经2步)。LC-MS[ESI,M+1]：413.2。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(1H-咪唑-4-羰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(180).使用179和1H-咪唑-4-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的180(8.6mg,50％,2HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：507.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(1H-咪唑-2-羰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(181).使用179和1H-咪唑-2-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：507.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(182).使用179和2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的182(10.6mg,62％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：534.3。
4-甲基-3-(吗啉代甲基)-7-(2-苯丙氧基)-2H-色满-2-酮(183).使用43作为起始材料，类似于152以两步来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：394.2。
4-甲基-3-(吗啉代甲基)-7-((1-苯基丙-2-基)氧基)-2H-色满-2-酮(184).使用47作为起始材料，类似于152以两步来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：394.2。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(嘧啶-2-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(185).将175(10mg,1当量)、2-氯嘧啶(5.3mg,2当量)、DIPEA(12μL,3当量)于DMF(1mL)中的搅拌溶液在80℃下加热16小时。在减压下浓缩混合物并通过快速柱色谱法纯化以得到呈黄色固体状的标题化合物(8.7mg，75％)。在其他实例中，纯化是通过反相制备型HPLC完成的。LC-MS[ESI,M+1]：505.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(186).使用2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：573.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(187).使用2-氯-5-(三氟甲基)吡啶，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：572.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(9H-嘌呤-6-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(188).使用6-氯嘌呤，类似于185来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的188(9.2mg,69％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：545.3。
2-(3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-2,4-二氧代-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-5-甲腈(189).使用2-氯嘧啶-5-甲腈，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：530.3。
2-(3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-2,4-二氧代-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)嘧啶-4-甲腈(190).使用2-氯嘧啶-4-甲腈，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：530.3。
6-(3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-2,4-二氧代-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)烟腈(191).使用6-氯烟腈，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：529.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(192).使用4-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶，类似于185来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的192(8.1mg,61％,HCl盐)。.LC-MS[ESI,M+1]：545.6。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(9H-嘌呤-2-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(193).使用2-氯-9H-嘌呤，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：545.6。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(嘧啶-2-基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(194).使用179，类似于185来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的194(8.6mg,68％)。LC-MS[ESI,M+1]：491.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(195).使用179和2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶作为起始材料，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：559.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(196).使用179和2-氯-5-(三氟甲基)吡啶作为起始材料，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：558.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(9H-嘌呤-6-基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(197).使用179和6-氯嘌呤作为起始材料，类似于185来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的197(10.1mg,74％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：531.3。
4-(3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-2,4-二氧代-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-8-羰基)苯甲酰胺(198).使用175和4-氨基甲酰基苯甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：574.4。
4-(3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-2,4-二氧代-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-7-羰基)苯甲酰胺(199).使用179和4-氨基甲酰基苯甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：560.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(苯磺酰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(200).在冰水浴上向175(10mg,1当量)和DIPEA(12μL)于DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加苯磺酰氯(3.8μL,1.3当量)。将反应在0℃下搅拌3h，然后在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色固体的标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：567.4。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(苯磺酰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(201).使用179，类似于200来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的201(12.7mg，定量)。LC-MS[ESI,M+1]：553.4。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(吡啶-3-基磺酰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(202).使用179和吡啶-3-磺酰氯作为起始材料，类似于200来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的202(11.8mg,93％)。LC-MS[ESI,M+1]：554.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(乙磺酰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(203).使用179和乙磺酰氯作为起始材料，类似于200来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：505.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-N-甲基-2,4-二氧代-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-7-磺酰胺(204).使用179和甲基氨磺酰氯作为起始材料，类似于200来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：506.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(嘧啶-2-羰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(205).使用179和嘧啶-2-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：519.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(嘧啶-2-羰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(206).使用175和嘧啶-2-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：533.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(嘧啶-4-羰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(207).使用179和嘧啶-4-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：519.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(嘧啶-4-羰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(208).使用175和嘧啶-4-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：533.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(嘧啶-5-羰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(209).使用179和嘧啶-5-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：519.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(嘧啶-5-羰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(210).使用175和嘧啶-5-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：533.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-7-(吡嗪-2-羰基)-1,3,7-三氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(211).使用179和吡嗪-2-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：519.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(吡嗪-2-羰基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(212).使用175和吡嗪-2-甲酸作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：533.3。
3-((7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)甲基)-5-异丁基咪唑烷-2,4-二酮(213).使用Int 2-3和5-异丁基咪唑烷-2,4-二酮作为起始材料，类似于用于制备175的第一步骤来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：400.2。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-5-异丁基咪唑烷-2,4-二酮(214).使用5-异丁基咪唑烷-2,4-二酮，类似于用于制备175的第一步骤来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：414.2。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(215).使用8-氯咪唑并[1,2-a]吡嗪，类似于185来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的215(6.4mg,48％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：544.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(216).使用8-氯咪唑并[1,2-a]吡嗪，类似于185来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：559.3。
8-([1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-基)-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(217).使用8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪，类似于185来制备标题化合物，得到呈淡黄色固体状的217(10.9mg,76％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：545.3。
((2'-羟基-[1,1'-联苯]-3-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(218).以两步来制备标题化合物。第一步类似于使用1-碘-2-(甲氧基甲氧基)苯制备153。接下来，将MOM保护的中间体(～15mg)在MeOH(3mL)中的0.5M HCl中的溶液在室温下搅拌16小时。将反应通过添加饱和NaHCO3来淬灭并用EtOAc(3x10mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤一次，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩以获得呈棕色固体状的标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：501.3。
氟硫酸3'-((((2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙氧基)羰基)氨基)甲基)-[1,1'-联苯]-2-酯(219).将218(12.2mg,1当量)和DIPEA(3当量)于MeCN(2mL)中的溶液上方的气氛抽空并使用气球，用SO2F2气体(1atm)重新填充。将溶液在室温下搅拌2h并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色胶状的标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：583.3。
((2'-氧代-1',2'-二氢-[3,3'-联吡啶]-5-基)甲基)氨基甲酸2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酯(220).使用5'-(氨甲基)-[3,3'-联吡啶]-2(1H)-酮，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：503.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(嘧啶-2-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2-酮(221).使用Int 9-4，类似于185来制备标题化合物，得到呈黄色固体状的221(8.1mg,40％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：491.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2-酮(222).使用Int 9-4和4-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶作为起始材料，类似于185来制备标题化合物，得到呈淡黄色固体状的222(8.4mg,38％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：531.3。
3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-8-(咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸烷-2-酮(223).使用Int 9-4和8-氯咪唑并[1,2-a]吡嗪作为起始材料，类似于185来制备标题化合物，得到呈棕色固体状的223(4.3mg,20％,HCl盐)。LC-MS[ESI,M+1]：530.4。
4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲腈(224).使用文献方法制备标题化合物。表征数据与文献相符。
4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酸(225).使用文献方法制备标题化合物。表征数据与文献相符。
4-甲基-2-氧代-N-(吡啶-2-基甲基)-2H-色烯-7-甲酰胺(226).使用225和吡啶-2-基甲胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：295.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.38(t,J＝5.9Hz,1H),8.56(ddd,J＝4.9,1.8,0.9Hz,1H),7.93–7.88(m,2H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.41(d,J＝7.9Hz,1H),7.36–7.31(m,1H),5.76(s,1H),4.63(d,J＝5.9Hz,1H),2.48(d,J＝1.3Hz,2H)。
4-甲基-N-(萘-2-基)-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(227).使用225和萘-2-胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M-1]：328.0。
4-甲基-2-氧代-N-(吡啶-4-基甲基)-2H-色烯-7-甲酰胺(228).使用225和吡啶-4-基甲胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：295.0。
N-(3,5-二氯-4-羟苯基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(229).使用225和4-氨基-2,6-二氯苯酚作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：365.0。
N-(4-羟基苄基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(230).使用225和4-(氨甲基)苯酚作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：310.0。
7-(二烯丙基氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(231).使用225和烯丙基溴作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的231和240。LC-MS[ESI,M+1]：256.0。
N-(4-羟基苯乙基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(232).使用225和4-(2-氨乙基)苯酚作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：324.0。
4-甲基-2-氧代-N-(喹啉-2-基)-2H-色烯-7-甲酰胺(233).使用225和喹啉-2-胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：331.0。
4-甲基-2-氧代-N-(喹啉-4-基)-2H-色烯-7-甲酰胺(234).使用225和喹啉-4-胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：331.0。
4-甲基-2-氧代-N-(喹啉-6-基)-2H-色烯-7-甲酰胺(235).使用225和喹啉-6-胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：331.0。
N-((1H-吲哚-3-基)甲基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(236).使用225和(1H-吲哚-3-基)甲胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：333.1。
N-((1H-吲哚-5-基)甲基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(237).使用225和(1H-吲哚-5-基)甲胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：333.1。
N-(1H-苯并[d]咪唑-6-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(238).使用225和1H-苯并[d]咪唑-6-胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：320.0。
N-(苯并[d]噻唑-5-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-甲酰胺(239).使用225和苯并[d]噻唑-5-胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：337.1。
7-(烯丙氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(240).使用225和烯丙基溴作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的231和240，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：216.0。
7-(二丙氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(241).使用225和1-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的241和242，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：260.0。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.39(d,J＝9.0Hz,1H),6.59(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),5.97(q,J＝1.2Hz,1H),3.34–3.28(m,4H),2.36(d,J＝1.2Hz,3H),1.72–1.61(m,3H),0.97(t,J＝7.4Hz,5H)。
4-甲基-7-(丙氨基)-2H-色满-2-酮(242).使用225和1-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的241和242，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：218.0。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.37(d,J＝8.7Hz,1H),6.54(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.48(d,J＝2.3Hz,1H),6.01(d,J＝1.3Hz,1H),3.83(s,3H),3.17(t,J＝7.1Hz,2H),2.37(d,J＝1.2Hz,3H),1.70(h,J＝7.3Hz,2H),1.04(t,J＝7.4Hz,3H)。
7-(双(2-甲基烯丙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(243).使用225和3-溴-2-甲基丙-1-烯作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的243和244，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：284.1。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.38(d,J＝8.9Hz,1H),6.56(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.97(t,J＝1.3Hz,1H),4.75(t,J＝1.5Hz,2H),3.88(s,4H),2.34(d,J＝1.2Hz,3H),1.77(s,6H)。
4-甲基-7-((2-甲基烯丙基)氨基)-2H-色满-2-酮(244).使用225和3-溴-2-甲基丙-1-烯作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的243和244，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：230.0。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.36(d,J＝8.7Hz,1H),6.54(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.46(d,J＝2.4Hz,1H),5.98(q,J＝1.2Hz,1H),4.96(tt,J＝1.6,0.9Hz,1H),4.92(p,J＝1.4Hz,1H),3.75(d,J＝1.5Hz,2H),2.34(d,J＝1.2Hz,3H),1.79(dd,J＝1.6,0.8Hz,3H)。
7-(双(环丙基甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(245).使用225和(溴甲基)环丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的245和246，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：284.1。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.46(d,J＝8.9Hz,1H),6.88(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.77(d,J＝2.6Hz,1H),6.04(d,J＝1.3Hz,1H),2.76(s,3H),2.39(d,J＝1.2Hz,2H),1.14–1.02(m,2H),0.66–0.54(m,3H),0.29(h,J＝4.8,4.1Hz,3H)。
7-((环丙基甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(246).使用225和(溴甲基)环丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的245和246，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：230.0。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.37(d,J＝8.7Hz,1H),6.54(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.45(d,J＝2.3Hz,1H),6.00(t,J＝1.2Hz,1H),3.61(s,2H),3.03(d,J＝7.0Hz,2H),2.36(d,J＝1.2Hz,3H),1.18–1.07(m,1H),0.63–0.53(m,1H),0.30(dt,J＝6.1,4.6Hz,2H)。
7-(丁-3-烯-1-基氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(247).使用225和4-碘丁-1-烯作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：230.0。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.36(d,J＝8.7Hz,1H),6.52(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.46(d,J＝2.4Hz,1H),5.99(q,J＝1.1Hz,1H),5.84(ddt,J＝17.0,10.2,6.8Hz,1H),5.22–5.15(m,1H),5.19–5.13(m,1H),3.26(t,J＝6.7Hz,2H),2.43(qt,J＝6.8,1.3Hz,2H),2.35(d,J＝1.2Hz,4H)。
7-(二(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(248).使用225和炔丙基溴作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的248和249，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：252.0。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.51(d,J＝8.8Hz,1H),6.87(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.84(d,J＝2.5Hz,1H),6.10(q,J＝1.2Hz,1H),4.21(d,J＝2.4Hz,4H),2.40(d,J＝1.2Hz,3H),2.32(t,J＝2.4Hz,2H)。
4-甲基-7-(丙-2-炔-1-基氨基)-2H-色满-2-酮(249).使用225和炔丙基溴作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的248和249，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。表征数据与文献相符。
7-(双(3-氟丙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(250).使用225和1-氟-3-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的250和251，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：296.0。
7-((3-氟丙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(251).使用225和1-氟-3-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物，得到呈产物混合物形式的250和251，将其通过快速柱色谱法(SiO2,EtOAc/己烷)分离。LC-MS[ESI,M+1]：236.0。
7-(烯丙基(甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(252).使用240和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：230.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.52(d,J＝8.9Hz,1H),6.73(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.55(d,J＝2.6Hz,1H),5.97(q,J＝1.2Hz,1H),5.84(ddt,J＝17.3,10.1,4.8Hz,1H),5.15(dq,J＝10.3,1.7Hz,1H),4.07(dt,J＝4.9,1.8Hz,2H),3.02(s,3H),2.34(d,J＝1.2Hz,2H)。
4-甲基-7-(甲基(丙基)氨基)-2H-色满-2-酮(253).使用242和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：232.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.50(d,J＝8.9Hz,1H),6.73(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.6Hz,1H),5.95(d,J＝1.3Hz,1H),3.41–3.36(m,2H),2.99(s,3H),2.33(d,J＝1.2Hz,3H),1.56(七重峰,J＝7.4,7.0Hz,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。
4-甲基-7-(甲基(2-甲基烯丙基)氨基)-2H-色满-2-酮(254).使用244和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：244.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.51(d,J＝9.0Hz,1H),6.70(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.6Hz,1H),5.96(t,J＝1.2Hz,1H),4.83(p,J＝1.5Hz,1H),3.98(s,2H),3.04(s,3H),2.34(d,J＝1.2Hz,3H),1.69(t,J＝1.1Hz,3H)。
7-((环丙基甲基)(甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(255).使用246和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：244.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.52(d,J＝9.0Hz,1H),6.79(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.58(d,J＝2.6Hz,1H),5.96(t,J＝1.2Hz,1H),3.36(s,1H),3.03(s,3H),2.34(d,J＝1.2Hz,4H),1.08–0.97(m,1H),0.52–0.42(m,2H),0.34–0.24(m,2H)。
7-(丁-3-烯-1-基(甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(256).使用247和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：244.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.52(d,J＝9.0Hz,1H),6.74(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.54(d,J＝2.6Hz,1H),5.96(q,J＝1.1Hz,1H),5.86(ddt,J＝17.2,10.2,6.9Hz,1H),5.03(ddd,J＝10.2,2.1,1.1Hz,1H),3.54–3.48(m,2H),3.00(s,3H),2.36–2.26(m,5H)。
4-甲基-7-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-2H-色满-2-酮(257).使用249和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：228.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.58(d,J＝8.9Hz,1H),6.86(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.76–6.69(m,1H),6.04(q,J＝1.1Hz,1H),4.27(d,J＝2.4Hz,1H),3.16(t,J＝2.4Hz,1H),3.05–3.00(m,4H),2.35(dt,J＝11.3,0.9Hz,3H)。
7-((3-氟丙基)(甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(258).使用251和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：250.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.52(d,J＝8.9Hz,1H),6.74(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.56(d,J＝2.5Hz,1H),5.97(t,J＝1.2Hz,1H),4.51(dt,J＝47.4,5.8Hz,2H),3.62–3.43(m,2H),3.00(s,3H),2.34(d,J＝1.2Hz,3H),2.03–1.81(m,2H)。
7-(烯丙基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(259).使用249和烯丙基溴作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：254.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.57(d,J＝9.0Hz,1H),6.81(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.66(d,J＝2.5Hz,1H),6.03(t,J＝1.3Hz,1H),5.88(ddt,J＝17.2,10.2,5.0Hz,1H),5.22(dq,J＝17.2,1.8Hz,1H),5.18(dq,J＝10.4,1.6Hz,1H),4.25(d,J＝2.4Hz,2H),4.11(dt,J＝5.1,1.8Hz,2H),3.23(t,J＝2.4Hz,1H),2.36(d,J＝1.2Hz,3H)。
4-甲基-7-(丙-2-炔-1-基(丙基)氨基)-2H-色满-2-酮(260).使用249和1-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：256.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.55(d,J＝8.9Hz,1H),6.81(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.65(d,J＝2.6Hz,1H),6.01(d,J＝1.3Hz,1H),4.23(d,J＝2.5Hz,2H),3.42(s,1H),3.20(t,J＝2.4Hz,1H),2.35(d,J＝1.2Hz,4H),1.62(h,J＝7.4Hz,2H),0.91(t,J＝7.4Hz,4H)。
4-甲基-7-((2-甲基烯丙基)(丙-2-炔-1-基)氨基)-2H-色满-2-酮(261).使用249和3-溴-2-甲基丙-1-烯作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：268.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.56(d,J＝8.9Hz,1H),6.78(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.62(d,J＝2.5Hz,1H),6.02(t,J＝1.2Hz,1H),4.81–4.77(m,1H),4.23(d,J＝2.4Hz,2H),3.99(s,2H),3.24(t,J＝2.4Hz,1H),2.35(d,J＝1.2Hz,3H),1.72(s,3H)。
7-((环丙基甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(262).使用249和(溴甲基)环丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：268.0。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.57(d,J＝8.9Hz,1H),6.88(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.71(d,J＝2.6Hz,1H),6.03(d,J＝1.3Hz,1H),4.29(d,J＝2.4Hz,2H),3.36(d,J＝6.6Hz,2H),3.18(t,J＝2.3Hz,1H),2.36(d,J＝1.2Hz,3H),1.08(dtdd,J＝11.4,7.8,6.4,4.9Hz,1H),0.53–0.45(m,2H),0.43–0.30(m,2H)。
7-(丁-3-烯-1-基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(263).使用249和4-碘丁-1-烯作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：268.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.57(d,J＝8.9Hz,1H),6.83(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.67(d,J＝2.6Hz,1H),6.02(d,J＝1.4Hz,1H),5.88(ddt,J＝17.1,10.2,6.8Hz,1H),5.14(dt,J＝17.2,1.8Hz,1H),5.05(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.25(d,J＝2.4Hz,2H),3.53(dd,J＝8.6,6.4Hz,2H),3.21(t,J＝2.3Hz,1H),2.43–2.32(m,5H)。
7-((3-氟丙基)(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(264).使用249和1-氟-3-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：274.0。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.58(d,J＝8.9Hz,1H),6.83(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),6.69(d,J＝2.6Hz,1H),6.03(d,J＝1.4Hz,1H),4.55(dt,J＝47.3,5.8Hz,2H),4.25(d,J＝2.4Hz,2H),3.69–3.48(m,2H),3.22(t,J＝2.4Hz,1H),2.36(d,J＝1.2Hz,3H),2.14–1.84(m,2H)。
4-甲基-7-((3,3,3-三氟丙基)氨基)-2H-色满-2-酮(265).使用1,1,1-三氟-3-碘丙烷，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：271.9。
7-(二甲氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(266).使用甲基碘，类似于36来制备标题化合物。表征数据与文献相符。
4-甲基-2-氧代-N-(丙-2-炔-1-基)-2H-色烯-7-甲酰胺(267).使用225和炔丙胺作为起始材料，类似于150来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：242.0。
7-(乙基(甲基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(268).使用270和甲基碘作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：218.0。
2-((4-甲基-2-氧代-2H-色满-7-基)氨基)乙腈(269).使用溴乙腈，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：214.9。1H NMR(600MHz,丙酮-d6)δ7.60(d,J＝8.7Hz,1H),6.83(ddd,J＝8.6,2.3,0.8Hz,1H),6.70(dd,J＝2.4,1.4Hz,1H),6.42(s,1H),6.03(s,1H),4.47(d,J＝6.4Hz,1H),2.41(d,J＝1.2Hz,2H)。
7-(乙氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(270).使用碘乙烷，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：203.9。1H NMR(600MHz,丙酮-d6)δ7.45(d,J＝8.7Hz,1H),6.64(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.42(d,J＝2.3Hz,1H),5.89(q,J＝1.2Hz,1H),5.83(s,1H),3.25(qd,J＝7.1,5.1Hz,2H),2.36(d,J＝1.2Hz,2H),1.27(td,J＝7.2,1.2Hz,4H)。
7-(乙基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(271).使用270和炔丙基溴作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：242.0。
2-(乙基(4-甲基-2-氧代-2H-色满-7-基)氨基)乙腈(272).使用270和溴乙腈作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：243.0。
7-(乙基(2-氟乙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(273).使用270和1-氟-3-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：250.0。
7-(乙基(异丙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(274).使用270和2-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：246.0。1H NMR(600MHz,丙酮-d6)δ7.52(d,J＝9.0Hz,1H),6.82(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.58(d,J＝2.7Hz,1H),5.90(q,J＝1.2Hz,1H),4.27(七重峰,J＝6.6Hz,1H),3.44(q,J＝7.1Hz,2H),2.38(d,J＝1.2Hz,2H),1.28(d,J＝6.6Hz,5H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H)。
7-(乙基(丙基)氨基)-4-甲基-2H-色满-2-酮(275).使用270和1-碘丙烷作为起始材料，类似于36来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：246.0。1H NMR(600MHz,丙酮-d6)δ7.50(d,J＝9.0Hz,1H),6.72(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.89(q,J＝1.2Hz,1H),3.53(q,J＝7.1Hz,2H),3.43–3.37(m,2H),2.37(d,J＝1.2Hz,3H),1.74–1.64(m,2H),1.21(t,J＝7.1Hz,3H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(吡啶-2-基甲基)脲(276).使用吡啶-2-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：409.2。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(吡啶-4-基甲基)脲(277).使用吡啶-4-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：409.2。
1-苄基-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲(278).使用苄胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：408.2。
1-((1H-吲哚-5-基)甲基)-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲(279).使用(1H-吲哚-5-基)甲胺。类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：447.3。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(4-羟基苯乙基)脲(280).使用4-(2-氨乙基)苯酚，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：438.2。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.15(s,1H),7.51(d,J＝9.0Hz,1H),6.99–6.91(m,2H),6.72–6.63(m,3H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.94(s,1H),5.76(s,1H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.15–3.07(m,4H),2.62(t,J＝6.9Hz,2H),2.49(d,J＝7.2Hz,1H),2.31(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲(281).使用2-(1H-咪唑-5-基)乙-1-胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：412.2。
1-((6-氯吡啶-2-基)甲基)-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲(282).使用(6-氯吡啶-2-基)甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：443.6。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.75(t,J＝7.7Hz,1H),7.52(d,J＝9.1Hz,1H),7.37–7.31(m,1H),7.22(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H),6.70(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.50(d,J＝2.6Hz,1H),6.49(s,1H),6.23(s,2H),4.24(s,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.15(t,J＝6.9Hz,2H),2.64(t,J＝6.9Hz,2H),2.32(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲(283).使用[1,1'-联苯]-4-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：484.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.66–7.60(m,2H),7.58–7.50(m,3H),7.50–7.42(m,2H),7.39–7.32(m,1H),7.31–7.24(m,2H),6.69(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.42(s,1H),6.05(s,1H),4.22(s,2H),3.41(q,J＝7.0Hz,4H),3.18(t,J＝6.9Hz,2H),2.66(t,J＝6.8Hz,2H),2.34(s,3H),1.10(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-([1,1'-联苯]-3-基甲基)-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲(284).使用[1,1'-联苯]-3-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：484.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.67–7.60(m,2H),7.57–7.42(m,5H),7.42–7.34(m,2H),7.22(dt,J＝7.6,1.4Hz,1H),6.48(d,J＝2.5Hz,1H),6.40(s,1H),6.06(s,1H),4.26(s,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.16(t,J＝6.9Hz,2H),2.65(t,J＝6.9Hz,2H),2.54(s,1H),2.28(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(萘-1-基甲基)脲(285).使用萘-1-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：458.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.12–8.04(m,1H),7.98–7.90(m,1H),7.82(d,J＝8.1Hz,1H),7.58–7.50(m,2H),7.54–7.47(m,1H),7.47–7.36(m,2H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.35(s,1H),6.01(s,1H),4.65(s,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.18(t,J＝6.9Hz,2H),2.66(t,J＝6.9Hz,2H),2.53(s,1H),2.31(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-((6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)甲基)脲(286).使用5-(氨甲基)吡啶-2(1H)-酮，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：425.2。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.51(d,J＝9.0Hz,1H),7.36(dd,J＝9.4,2.6Hz,1H),7.21(d,J＝2.6Hz,1H),6.69(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.31(d,J＝9.4Hz,1H),6.21(s,1H),6.02(s,1H),3.90(s,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.13(dt,J＝13.8,5.0Hz,2H),2.63(t,J＝6.9Hz,2H),2.30(s,3H),1.27(dd,J＝9.2,6.7Hz,2H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(喹啉-4-基甲基)脲(287).使用喹啉-4-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：459.3。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.07(s,1H),8.50(s,1H),8.32(s,1H),8.12(dd,J＝10.3,4.8Hz,1H),8.01(d,J＝8.7Hz,1H),7.85(tt,J＝16.9,7.3Hz,1H),7.76–7.69(m,1H),7.60–7.49(m,1H),6.69(s,1H),6.54–6.47(m,1H),3.62(ddt,J＝11.1,7.4,4.2Hz,1H),3.49–3.38(m,4H),3.15(qd,J＝7.5,4.3Hz,1H),2.83(d,J＝6.7Hz,1H),2.44–2.37(m,2H),1.12(p,J＝6.3,5.7Hz,5H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(喹啉-3-基甲基)脲(288).使用喹啉-3-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：459.3。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(异喹啉-4-基甲基)脲(289).使用异喹啉-4-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：459.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.48(d,J＝8.2Hz,1H),8.45(s,1H),8.40(d,J＝8.5Hz,1H),8.15(ddd,J＝8.4,6.9,1.3Hz,1H),7.98(ddd,J＝8.1,6.9,1.0Hz,1H),7.46(d,J＝9.1Hz,1H),6.68(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.64(s,1H),6.47(d,J＝2.6Hz,1H),6.25(s,1H),4.76(d,J＝5.3Hz,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),2.65(t,J＝6.9Hz,2H),2.27(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(异喹啉-1-基甲基)脲(290).使用异喹啉-1-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：459.3。
1-(3-(1H-咪唑-4-基)苄基)-3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲(291).使用(3-(1H-咪唑-4-基)苯基)甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：474.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.90–7.80(m,3H),7.70(d,J＝1.0Hz,1H),7.53–7.43(m,3H),7.38(dd,J＝8.5,1.8Hz,1H),6.69(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.44(s,1H),6.08(s,1H),5.76(s,2H),4.36(s,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.18(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(t,J＝6.9Hz,2H),2.33(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(萘-2-基甲基)脲(292).使用萘-2-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：474.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.90–7.80(m,3H),7.70(s,1H),7.53–7.43(m,3H),7.38(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),6.69(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.44(s,1H),6.08(s,1H),4.36(s,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.18(t,J＝6.9Hz,2H),2.67(t,J＝6.9Hz,2H),2.33(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(喹啉-2-基甲基)脲(293).使用喹啉-2-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：459.3。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(嘧啶-4-基甲基)脲(294).使用嘧啶-4-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：410.2。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-(异喹啉-3-基甲基)脲(295).使用异喹啉-3-基甲胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：459.3。
1-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)-3-((1-氧代-1,2-二氢异喹啉-6-基)甲基)脲(296).使用6-(氨甲基)异喹啉-1(2H)-酮，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：475.3。
3-((3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲基)甲基)-5-氟苯甲酸(297).使用3-(氨甲基)-5-氟苯甲酸，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：470.2。
3-((3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲基)甲基)苯甲酰胺(298).使用3-(氨甲基)苯甲酰胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：451.2。
3-((3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲基)甲基)苯磺酰胺(299).使用3-(氨甲基)苯磺酰胺，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：487.3。
方案10.
Figure BDA0003321903570001321
4-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙基)-7-(二乙氨基)-2H-色满-2-酮(Int10-1).在0℃下向LDA(2M，于己烷中，32.4mL,1.50当量)于THF(50mL)中的溶液中添加N-[双(二甲氨基)磷酰基]-N-甲基-甲胺(11.6g,64.9mmol,11.4mL,1.50当量)。在0℃下搅拌5分钟之后，在0℃下经10分钟缓慢添加7-(二乙氨基)-4-甲基-色满-2-酮(10.0g,43.2mmol,1.00当量)于THF(50mL)中的溶液。使所得混合物在0℃下搅拌45分钟，并在0℃下向其中缓慢添加叔丁基-(2-碘乙氧基)-二甲基-硅烷(12.4g,43.3mmol,1.00当量)于THF(50mL)中的溶液。将温度再保持30分钟，然后将混合物缓慢升温至30℃。完成后，将混合物用饱和碳酸氢钠(20mL)猝灭并用乙酸乙酯(50mL)稀释。将分离的有机层经硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。通过硅胶柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至3/1)纯化混合物。获得呈黄色胶状的标题中间体Int 10-1(5.00g,12.8mmol,30％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.46(d,J＝8.8Hz,1H),6.58(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),6.50(d,J＝2.4Hz,1H),5.94(s,1H),3.71(br t,J＝5.6Hz,2H),3.43(q,J＝7.2Hz,4H),2.80-2.70(m,2H),1.90-1.82(m,2H),1.20(t,J＝7.2Hz,6H),0.92(s,9H),0.07(s,6H)。
7-(二乙氨基)-4-(3-羟丙基)-2H-色满-2-酮(Int 10-2).向4-[3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基丙基]-7-(二乙氨基)色满-2-酮(5.00g,12.8mmol,4.00当量)于THF(100mL)中的溶液中添加TBAF(1M,19.3mL,6.00当量)。在30℃下搅拌反应混合物2小时。将反应混合物用水(200mL)稀释，并用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL×2)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。通过硅胶柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1)纯化残余物。获得呈黄色油状的化合物7-(二乙氨基)-4-(3-羟丙基)色满-2-酮(0.27g,976μmol,30％产率，99％纯度)。LC-MS[ESI,M+1]：276.1。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.46(d,J＝9.2Hz,1H),6.60(dd,J＝2.4,9.2Hz,1H),6.50(d,J＝2.8Hz,1H),6.0(s,1H),3.78(br t,J＝5.6Hz,2H),3.40(q,J＝7.2Hz,4H),2.84-2.78(m,2H),1.98-1.88(m,2H),1.63-1.57(m,1H),1.22(t,J＝7.2Hz,6H)。
(4-硝基苯基)碳酸3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4-基)丙酯(Int10-3).使用Int 10-2，类似于Int 5-1来制备标题中间体，得到橙色固体。LC-MS[ESI,M+1]：441.2。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.36–8.29(m,2H),7.60–7.52(m,3H),6.69(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.6Hz,1H),5.97(d,J＝0.9Hz,1H),4.35(t,J＝6.4Hz,2H),3.43(q,J＝7.0Hz,4H),2.86–2.79(m,2H),2.11–2.00(m,2H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
苄基氨基甲酸3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4-基)丙酯(300).使用Int 10-3和苄胺作为起始材料，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：409.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.74(t,J＝6.2Hz,1H),7.53(d,J＝9.0Hz,1H),7.32(t,J＝7.6Hz,2H),7.29–7.20(m,3H),6.67(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.5Hz,1H),5.92(s,1H),4.20(d,J＝6.2Hz,2H),4.05(t,J＝6.4Hz,2H),3.43(q,J＝7.0Hz,4H),2.76(t,J＝7.7Hz,2H),1.90(t,J＝7.6Hz,2H),1.13(t,J＝7.0Hz,6H)。
(吡啶-4-基甲基)氨基甲酸3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4-基)丙酯(301).使用Int 10-3和吡啶-4-基甲胺作为起始材料，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：410.2。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.76(s,2H),8.27(d,J＝8.1Hz,1H),7.92(t,J＝6.0Hz,1H),7.53(d,J＝9.0Hz,1H),6.68(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.5Hz,1H),5.91(s,1H),4.37(d,J＝6.1Hz,2H),4.06(t,J＝6.5Hz,2H),3.43(q,J＝7.0Hz,4H),2.75(dd,J＝14.1,6.5Hz,2H),1.91(p,J＝6.7Hz,2H),1.13(t,J＝7.0Hz,6H)。
(3-氨基甲酰基苄基)氨基甲酸3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4-基)丙酯(302).使用Int 10-3和3-(氨甲基)苯甲酰胺作为起始材料，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：452.2。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.95(s,1H),7.82–7.71(m,3H),7.53(d,J＝9.0Hz,1H),7.46–7.36(m,2H),7.34(s,1H),6.67(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.6Hz,1H),5.92(s,1H),4.24(d,J＝6.2Hz,2H),4.06(t,J＝6.4Hz,2H),3.43(q,J＝7.0Hz,4H),2.75(q,J＝6.9,6.1Hz,2H),1.90(p,J＝6.7Hz,2H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
(3-氨磺酰苄基)氨基甲酸3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4-基)丙酯(303).使用Int 10-3和3-(氨甲基)苯磺酰胺作为起始材料，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：488.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.86(t,J＝6.2Hz,1H),7.77–7.68(m,2H),7.58–7.47(m,2H),7.48(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.36(s,2H),6.69(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),6.52(d,J＝2.5Hz,1H),5.92(s,1H),4.27(d,J＝6.2Hz,2H),4.06(t,J＝6.5Hz,2H),3.43(q,J＝7.0Hz,4H),2.76(q,J＝7.5Hz,2H),1.91(p,J＝6.7Hz,2H),1.13(t,J＝7.0Hz,6H)。
(3-(1H-咪唑-4-基)苄基)氨基甲酸3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4-基)丙酯(304).使用Int 10-3和(3-(1H-咪唑-4-基)苯基)甲胺作为起始材料，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：475.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.20(s,1H),8.14(s,1H),7.80(t,J＝6.1Hz,1H),7.74–7.66(m,2H),7.57–7.44(m,2H),7.39–7.32(m,1H),6.66(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.6Hz,1H),5.92(s,1H),4.76(s,1H),4.27(d,J＝6.1Hz,2H),4.06(t,J＝6.5Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.76(dd,J＝16.2,8.5Hz,2H),1.91(p,J＝6.6Hz,2H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
3-(3-((((3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4-基)丙氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)丙酸(305).使用Int 10-3和3-(3-(氨甲基)苯基)丙酸作为起始材料，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：481.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.70(t,J＝5.8Hz,1H),7.54(d,J＝9.0Hz,1H),7.23(t,J＝7.6Hz,1H),7.15–7.06(m,3H),6.67(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.5Hz,1H),5.92(s,1H),4.17(d,J＝6.2Hz,2H),4.05(t,J＝6.4Hz,2H),3.43(q,J＝7.0Hz,5H),2.78(dt,J＝24.4,7.8Hz,4H),1.90(p,J＝6.7Hz,2H),1.33–1.22(m,1H),1.13(t,J＝7.0Hz,6H)。
3-(3-((((3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色满-4基)丙氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)丙酸甲酯(306).使用Int 10-3和3-(3-(氨甲基)苯基)丙酸甲酯作为起始材料，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：495.3。
3-(3-((3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲基)甲基)苯基)丙酸(307).使用3-(3-(氨甲基)苯基)丙酸，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：480.3。
3-(3-((3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲基)甲基)苯基)丙酸甲酯(308).使用3-(3-(氨甲基)苯基)丙酸甲酯，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：494.3。
3-(3-((((2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)丙酸(309).使用3-(3-(氨甲基)苯基)丙酸，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：481.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.73(t,J＝6.2Hz,1H),7.54(d,J＝9.1Hz,1H),7.23(t,J＝7.9Hz,1H),6.82(t,J＝2.0Hz,1H),6.77(dd,J＝8.2,2.6Hz,1H),6.68(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.52(d,J＝2.6Hz,1H),4.64(s,2H),4.17(d,J＝6.2Hz,2H),3.43(q,J＝7.0Hz,5H),2.80–2.71(m,2H),1.13(t,J＝7.0Hz,6H)。
3-(3-((((2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)丙酸甲酯(310).使用3-(3-(氨甲基)苯基)丙酸甲酯，类似于78来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：495.3。
2-(3-((3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲基)甲基)苯氧基)乙酸(311).使用2-(3-(氨甲基)苯氧基)乙酸，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：482.3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.52(d,J＝9.1Hz,1H),7.19(t,J＝7.8Hz,1H),6.84–6.72(m,3H),6.69(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),6.49(d,J＝2.6Hz,1H),6.32(s,1H),6.04(s,1H),4.64(s,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,4H),3.15(t,J＝6.8Hz,2H),2.65(t,J＝6.9Hz,2H),2.32(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H)。
2-(3-((3-(2-(7-(二乙氨基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙基)脲基)甲基)苯氧基)乙酸甲酯(312).使用2-(3-(氨甲基)苯氧基)乙酸甲酯，类似于98来制备标题化合物。LC-MS[ESI,M+1]：496.3。
一般生物学方法和材料
重组蛋白在大肠杆菌中表达，并如前所述进行纯化(4)。WIL-FL K83C和JTO-FLK83C与荧光素马来酰亚胺(Vector Laboratories)缀合，并将标记的蛋白质WIL-FL*和JTO-FL*分别通过离子交换色谱法纯化。从400mL细菌培养物中获得大约40mg(1.7μmol单体当量)纯的、天然折叠的WIL-FL K79C。500nmol的此LC与2当量的荧光素马来酰亚胺反应，再纯化后产生420nmol的WIL-FL*。以相似的总产率产生了75nmol的JTO-FL*。筛选活动需要223nmol的WIL-FL*和40nmol的JTO-FL*。蛋白水解测定通常通过在37℃或环境温度(22℃)下于PBS中孵育LC(未标记的LC为10μM，荧光素标记的LC为20nM)与蛋白酶K(ThermoFisher，200nM)来进行以用于筛选。FP是使用Jasco 8600荧光计(λex＝488nm,λem＝520nm)或配备偏振激发和发射滤光片(λex＝485±20nm,λem＝535±20nm)和505nm分色镜的PerkinElmer EnVision读板机来测量。使用以下公式计算FP值：
Figure BDA0003321903570001371
P是偏振，FS和FP分别是平行和垂直偏振光的发射强度，且G是染料和仪器特定的校正因子。值报告为mP。对于高通量筛选，在1536孔平板中分析来自Scripps Florida筛选文库的653,085个小分子。最终LC浓度为5μl中的10nM。小分子通过pintool从DMSO储备板添加至6.8μM化合物和0.68％DMSO的最终浓度。使用Molecular Devices Gemini读板仪(λex＝373nm,λem＝480nm)测量1与LC的荧光结合。JTO-FL的晶体使用由20％PEG 3350和0.2MNH4H2PO4组成的结晶缓冲液在23℃下通过坐滴蒸汽扩散生长。为了生成JTO-FL·1复合体，apo JTO-FL晶体用10倍摩尔过量的1浸泡10天。在光束线23-ID-D(对于apo JTO-FL)或23-ID-B(对于JTO-FL·1)下，在Advanced Photon Source(Argonne,IL)处，以80K和
Figure BDA0003321903570001381
的波长收集衍射数据。细化的模型存放在Protein Data Bank中，apo JTO-FL的登录码为6MG4，且JTO-FL·1的登录码为6MG5。用于NMR的所有样品均在50mM Bis Tris,pH 6.4、1mMEDTA、10％D2O中缓冲。1H,15N实验是在37℃下在配备低温冷却的x、y、z梯度探头的14.1TBruker AVANCE III HD光谱仪上记录的。SV-AUC、去折叠和聚集实验如先前所述进行(4)。
蛋白质表达和纯化.如前所述(1)，全长LC在大肠杆菌中表达为包涵体。简而言之，通过五轮超声处理和离心从细胞中分离出包涵体；将其溶解在含有5mM DTT的4M GuHCl中；通过逐滴稀释到含有5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.5的Tris-Cl中重新折叠；并通过硫酸铵沉淀，然后进行离子交换和尺寸排阻色谱法来纯化。LC V结构域使用pelB前导序列在大肠杆菌的周质中表达；通过周质休克分离；并通过硫酸铵沉淀，然后进行离子交换和尺寸排阻色谱法来纯化。
从ALMC2浆细胞系中分泌后纯化ALMC2 LC(2)。ALMC2细胞在含有5％胎牛血清(FBS)、292μg/ml谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2ng/ml nM白细胞介素-6(Thermo)的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)中生长。将大约450,000,000个细胞(300ml培养物)沉淀并重新悬浮在300ml不含FBS和酚红指示剂但含有谷氨酰胺、青霉素、链霉素和白细胞介素-6的IMDM中。允许细胞分泌蛋白质24小时，然后通过离心和过滤去除细胞。将含有ALMC2 LC的培养基针对25mM Tris-Cl(pH 8)透析过夜。LC通过使用FastflowQ柱(GE)的离子交换色谱法浓缩。通过使洗脱液穿过蛋白A柱(GE)去除ALMC IgG，并对LC进行透析，然后通过使用MonoQ柱(GE)的离子交换色谱法来纯化。
5J8 Fab在HEK293F悬浮细胞中表达，并通过Ni-NTA和离子交换色谱法纯化，如前所述(3)。
蛋白质标记.根据制造商说明书，使用Novagen QuikChange或NEB SDM诱变方案，通过突变将表面暴露的半胱氨酸残基掺入到LC中。LC(20-50μM)如上所述表达并通过与等摩尔的荧光素马来酰亚胺(Vector Laboratories)在室温(22℃)下反应1小时而与荧光素缀合。通过离子交换色谱法除去未反应的荧光素。通过吸光度光谱测定标记效率为50％，对应于每个LC二聚体的单个荧光素分子。重新折叠时LC错误折叠(4)或谷胱甘肽对K83C LC的修饰可能解释了缀合的蛋白产物中的一定异质性。实验(图1)显示LC的蛋白水解导致荧光偏振发生足够大的变化，因此没有尝试进一步优化标记和纯化。
蛋白水解测定.除非另有说明，否则LC与蛋白酶K(100nM；Thermo)在磷酸盐缓冲盐水(PBS、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)中孵育，然后将反应用苯甲基磺酰氟(100μM)淬灭并通过SDS-PAGE或荧光偏振量化剩余的LC。图1b中的实验通过分别向5μM WIL-FL或JTO-FL中添加20nM WIL-FL*或JTO-FL*来测量标记和未标记LC的同时蛋白水解。记录SDS-PAGE凝胶的荧光素荧光图像，然后对凝胶进行考马斯染色和成像。为清晰起见，显示的凝胶图像在量化后对比度增加。
荧光偏振测量.在装有偏振滤光片及激发和发射单色器的Jasco 8600荧光计中测量比色皿中的FP，使用488nm的激发波长和520nm的发射波长。平板上的FP是使用配备有偏振激发和发射滤光片(λex＝485±20nm，λem＝535±20nm)及505nm分色镜的Perkin ElmerEnVision读板机来测量的。所有测量均使用含0.02％(v/v)Pluronic F-127洗涤剂(Thermo)的PBS中荧光素标记的LC(20nM)。使用以下公式计算荧光偏振：
Figure BDA0003321903570001401
P是偏振，FS和FP分别是平行和垂直偏振光的发射强度，且G是染料和仪器特定的校正因子。使用以下公式计算总荧光：
TF＝FS+2FP
添加洗涤剂似乎防止LC与平板的聚苯乙烯表面结合时发生变性，因为它不会影响石英比色皿中的蛋白水解动力学。
试验性筛选.为了以平板形式进行筛选，在室温(通常为22℃)下孵育24小时后，通过FP测量每种化合物对WIL-FL*PK蛋白水解的影响。通过将复合孔与每个平板上的高和低对照孔(n＝32)进行比较，将所测量的FP逐个平板归一化。高FP对照孔含有JTO-FL*和DMSO媒介物，不含蛋白酶K。低FP对照孔含有WIL-FL*、DMSO媒介物和蛋白酶K，以测定未配体的WIL-FL*的蛋白水解速率。使用下式计算每个平板的活性百分比：
Figure BDA0003321903570001411
为了筛选商业文库，使用Beckman Coulter BioRAPTR将在含有0.02％PluronicF-127洗涤剂的PBS,pH 7.4中的WIL-FL*和JTO-FL*分配到黑色聚苯乙烯微孔板(Greiner目录号#788076)中。最终LC浓度为10μl中的20nM，相当于10nM荧光素。使用Beckman CoulterBioMek机器人，通过50nl pintool从10mM DMSO储备溶液中添加化合物(n＝1)，最终浓度为10μM化合物和0.5％DMSO。将平板在室温(22℃)下孵育10分钟，以使化合物溶解，然后将蛋白酶K分配至500nM的最终浓度。将平板以1000rpm离心1分钟，堆叠、包裹以尽量减少蒸发，并在22℃下孵育24小时。如上所述测量FP。使用商业文库筛选命中(化合物17和18)来验证在1,536孔平板上使用的测定。
初级筛选.使用PCFP测定在1,536孔平板中筛选来自Scripps Florida筛选文库的653,085个小分子。最终LC浓度为5μl中的10nM。小分子通过pintool从DMSO储备平板添加至6.75μM化合物和0.675％DMSO的最终浓度。相对于高对照(不含蛋白酶的JTO-FL*)和低对照(含DMSO媒介物的WIL-FL*)的活性使用上述方程3来计算。2,779个小分子被选为命中，这是基于比平板的平均活性高出三个标准差的活性。此结果对应于0.4％的初始命中率。测定性能与0.75±0.03的平板平均Z'和1.36±0.02的平均信号背景比一致(平均值±sd，n＝526个平板)。两种化合物不可用于进一步研究，因此2,777个小分子在DMSO中以10mM重新铺板，以创建用于二级筛选的储备平板。
二级筛选.使用三轮二级筛选来从初级筛选中去除假阳性命中。将初级筛选中鉴定的2,777个小分子用于每个二级筛选。
首先，PCFP测定以一式三份重复，每次有2,777个初级筛选命中，其中平均Z'为0.71±0.03。鉴定了1,422个具有>20.6％活性的分子(平均值加上此数据集的三个标准差)。注意到，许多化合物显示出比JTO-FL*阳性对照更大的明显保护，将此归因于影响FP测量的小分子的自发荧光。
其次，为了去除干扰FP测量的化合物，初级筛选以一式三份重复，但在蛋白酶K处理24小时后添加化合物(图1f)。此测定的平均Z'值为0.73±0.01。真正的命中不应保留超出低对照的FP。与前一段中描述的二级筛选相比，在此测定中显示出比平均活性低1.25倍的662个小分子被保留。
第三，为了去除抑制蛋白酶K的分子，使用100nM嗜热菌蛋白酶(Thermo)以一式三份重复测定。该测定在pH 7.5的50mM Tris-Cl中进行，其中含有150mM NaCl、100μM ZnCl2、100μM CaCl2和0.02％v/v Pluronic F-127洗涤剂。添加额外的金属离子以结合离子螯合小分子并防止它们抑制金属蛋白酶。此测定产生了0.64±0.02的平均Z'。鉴定了1,578种在此测定中具有活性的化合物，将其定义为>20％活性(平均值加上此数据集的三个标准差)。其中，1,243个分子对PK和嗜热菌蛋白酶表现出相似的活性。
通过所有三次二级筛选的269个分子被保留用于进一步分析。还保留了147个额外的分子，它们通过了FP人为二级筛选，但未能通过评估蛋白酶抑制的其他两个二级筛选之一(PCFP具有PK或具有嗜热菌蛋白酶)。
浓度依赖性测定采用与二级测定相同的试剂、方案和检测系统，但以10点剂量反应滴定(3倍稀释)形式，以如上所述的三种形式中的每种，对每种选定化合物以一式三份重复测试。然后使用Assay Explorer软件(Symyx Technologies Inc.)将描述S形剂量反应曲线的四参数方程与可调基线拟合。通过在Y截距值的50％激活水平处求解X截距值，从拟合曲线生成报告的EC50值。在PK和嗜热菌蛋白酶筛选中显示出类似浓度依赖性FP保留和在FP人为反筛选中显示出对比活性的小分子被保留。
用于滴定测定的所有化合物均通过LC-MS进行分析，以确认纯度并鉴定质量。在提交用于LC-MS分析的416个样品中，386个样品确认了质量，即Scripps数据库中结构的分子量与筛选样品的LC-MS分析鉴定的分子量相匹配。根据标称方法(UV-vis光谱、MS和ELSD)所测定的，379个样品的纯度>80％。
蛋白酶抑制测定.将PK(5μl，200nM)或不含蛋白酶的缓冲液分配到微孔板的孔中。通过pintool(n＝2)添加化合物并在室温(22℃)下孵育5分钟。将5μl的EnzCheck Red荧光蛋白酶底物(Thermo)分配到孔中。荧光(λex＝580nm，λem＝620nm)以30秒的间隔读取5分钟。荧光的增加指示蛋白酶活性。一些化合物表现出明显高于媒介物的蛋白酶活性，将其归因于自发荧光。
平衡透析.根据制造商说明书，将八种化合物在含有0.02％Pluronic F-127洗涤剂的PBS中在8kDa截止值的Rapid Equilibrium Dialysis筒(Thermo)中针对20μM WIL-FL透析4小时。透析筒内和外的小分子浓度通过反相HPLC测量，并且解离常数使用以下方程计算：
Figure BDA0003321903570001441
[LC]是透析筒内的LC浓度，[配体内]和[配体外]分别是在透析筒内和外测得的小分子浓度。
等温滴定量热法(ITC).将WIL-FL透析到PBS中，并将透析液过滤并用于稀释LC和小分子以进行ITC分析。DMSO和Pluronic F-127浓度在蛋白质与配体溶液之间尽可能匹配。使用Microcal Auto ITC200将小分子(100μM)滴定到20μM LC(单体当量)中。使用Origin软件(OriginLab Corporation)分析热量。
荧光香豆素滴定.除非可用材料有限，否则LC在带有10kDa膜的离心浓缩器中浓缩至200μM。在384孔平板中制备在含有1μM 1和0.02％(v/v)Pluronic F-127的PBS中1.5倍连续稀释的LC。使用373nm的激发波长和445nm的发射波长在Gemini读板仪(MolecularDevices)上测量1的荧光。将数据逐个平板归一为WIL-FL的平台荧光值，以计算1结合的分数。这些数据最初拟合至2态、1位点结合方程：
Figure BDA0003321903570001442
KD配体为LC·1解离常数。对于缺乏链间二硫键的LC，1与二聚体结合并将单体-二聚体平衡向二聚体移动(图2e)。为了估计e的亲和力，将荧光数据拟合到3态、1位点结合方程：
Figure BDA0003321903570001451
基于NMR亲和力测量，二聚解离常数KD配体被限制在1-10μM(5)。
分析超速离心(AUC).在含有0.5％DMSO媒介物或100μM 1的PBS中的WIL-FL和WIL-V(20μM)在Beckman XL-1分析超速离心机中以50,000rpm在20℃下运行。通过在280nm处的吸光度测量沉降。使用SedFit处理数据(6)。
晶体结构测定.将纯化的JTO-FL浓缩至200μM，并使用Scripps ResearchInstitute的高通量机器人Rigaku CrystalMation平台进行结晶试验。JTO-FL的晶体使用由20％PEG 3350和0.2M NH4H2PO4组成的结晶缓冲液在23℃下通过坐滴蒸汽扩散生长。使用这些条件在同一滴中生成了菱形和板状晶体，但只有板状晶体产生了可用的衍射数据。为了生成JTO-FL·1复合体，apo JTO-FL晶体用10倍摩尔过量的1浸泡10天。收获晶体并立即在液氮中快速冷却。
在光束线23-ID-D(对于apo JTO-FL)或23-ID-B(对于JTO-FL·1)下，在AdvancedPhoton Source(Argonne,IL)处，以80K和
Figure BDA0003321903570001452
的波长从晶体收集衍射数据。使用HKL-2000(7)(对于apo JTO-FL)或XDS(8)(对于JTO-FL·1)对帧进行索引和集成，使用Pointless将空间群分配为P212121，并在Scala(9)中缩放数据。5％的反射(随机分布)被标记以便使用Rfree(10)进行模型交叉验证。
使用现有的全长CLE轻链结构(12)(PDB:1LIL)作为搜索模型，通过分子置换(MR)和Phaser(11)将apo JTO-FL结构解析为
Figure BDA0003321903570001453
分辨率。使用apo JTO-FL作为搜索模型，使用MR类似地将JTO-FL·1结构解析为
Figure BDA0003321903570001461
分辨率。两个模型都通过Coot(13)中手动调整的迭代循环进行了细化，并在Refmac5(14)中，使用各向同性热参数和所计算位置处的氢原子进行了细化。使用MolProbity(15)进行分析后的最终调整。细化的模型存放在ProteinData Bank中，apo JTO-FL的登录码为6MG4，且JTO-FL·1的登录码为6MG5。
NMR.通过将配体溶解在乙醇中制成1(40mM)的储备溶液。所有样品均在50mM BisTris,pH 6.4、1mM EDTA、10％D2O中缓冲。所有相内(对于15N WIL-V和15N JTO-V)和TROSY(对于15N WIL-FL)基的1H,15N实验均在37℃下在配备低温冷却的x、y、z梯度探头的14.1TBruker AVANCE III HD光谱仪上记录。
对于滴定，从两种母液开始生成具有不同蛋白质:1比率的样品，第一种没有配体，第二种的单体蛋白质与配体浓度之间的比率为1:2.2。两种母液中的乙醇浓度相同。对于WIL-FL、WIL-V和JTO-V，单体蛋白质的浓度分别为0.05、0.4和0.14mM。将8个LC2峰(Asn 30、Tyr 32、Trp 35、Gln 38、Gly 41、Phe 50、Gly 101)和4个LC2·L峰(Asn 30、Gln 38、Gly41、Asp 52)的强度拟合以得到WIL-FL的KD估计值。
15N横向弛豫率是根据JTO-V和WIL-V在0.4mM蛋白质浓度(含或不含1mM 1)下所需的R1和R1ρ实验计算得出的。1.7kHz的A15NγB1场在R1ρ实验的弛豫延迟期间应用。
化学交换饱和转移(CEST)实验是在0.2或0.3mM 1存在下使用多位点激发方案(16)在0.4mM的WIL-V样品上获得的。在0.35s的饱和延迟期间，每9.1ms施加4.25μs DANTE脉冲，其中γB1＝6.4kHz，提供3Hz的有效15N B1场和连续激发频率之间的110Hz间隔。在存在0.06mM 1的情况下，在0.14mM的JTO-V样品上进行了纵向双自旋顺序ZZ交换实验，其中在t1演化之后发生1-50ms的ZZ混合延迟(17)。这些实验的分析的更多细节在下面描述的补充NMR分析中给出。
针对0.2mM的WIL-V和0.1mM的JTO-V，在有或没有0.5mM1的情况下，测量自然状态的氢交换实验。将先前脱盐和冻干的蛋白质溶解在基于D2O的柠檬酸钠缓冲液pD 5.0中，该缓冲液含有1.25％v/v的纯乙醇或40mM 1储备溶液。使用以下方程将每残基交换率kex转换为自由能，其中krc是未保护酰胺的残基特定交换率(18)：
Figure BDA0003321903570001471
动力学去折叠.在37℃下使用APP SX-20停流荧光计将在含有50μM 5的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中的WIL-FL(5μM)快速稀释到50mM磷酸钠缓冲液和50μM 5中的尿素中。荧光发射>335nm的变化被测量为时间的函数(λex＝280nm)。由于1的荧光，因此无法在此基于滤光片的荧光计上测量1存在时的去折叠率。将动力学瞬态拟合到单指数曲线和提取的速率。
平衡去折叠.WIL-FL(5μM)在含有50μM 5或100μM 1的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中针对尿素进行滴定。在25℃下孵育过夜后，使用Jasco 8600荧光计(λex＝280nm,λem＝300-420nm)测量固有色氨酸荧光发射光谱。使用以下方程计算平均波长(也称为光谱质量中心)值：
Figure BDA0003321903570001481
λi和Ii分别为在i处的波长和强度。为了比较，平均波长数据被归一化。LC不会从尿素(1)中完全可逆地重新折叠，因此无法报告去折叠的自由能。通过将滴定数据拟合到2态去折叠方程来计算中点尿素浓度：
Figure BDA0003321903570001482
x是尿素浓度(M)，G是去折叠的自由能(kJ mol-1)，m是去折叠反应的变性剂依赖性(kJ mol-1M-1)，R是理想气体常数，T是以K为单位的温度，a和c是折叠和去折叠状态的荧光，b和d分别是折叠和去折叠状态的荧光的变性剂依赖性。Cm，中点浓度，是：
Figure BDA0003321903570001483
聚集.将WIL C214S透析到ddH2O中并过滤。每个1ml反应含有10μM LC、ddH2O、1％DMSO或于1％DMSO中的200μM 1、150mM NaCl和ABC缓冲液(20mM醋酸钠、20mM硼酸、20mM柠檬酸钠，pH 5，含HCl)。组分按添加它们的顺序列出。
为了通过SEC进行分析，在配备4mm搅拌棒的2ml试管(Axygen#SCT-200-B-S)中建立反应。对于每个实验，将四个反应(媒介物和1各自的两个复制品)放置在搅拌板中心顶部上的微量离心管架中。在37℃下，以大约2,000rpm的速度搅拌反应，并在指定的时间点取出60μl等分试样。将等分试样在4℃下以16,000g离心5分钟。将10μl上清液注入配备有BEH200SEC柱(Waters，Milford，MA)的Waters Acquity H-Class Bio-UPLC(超高效液相色谱)仪器中，该色谱柱用含1mM EDTA的PBS平衡。在实验结束时，将搅拌棒用1M NaOH洗涤至少3小时，然后在室温下用6M GuHCl洗涤至少3小时以去除残留的聚集体。
含硫黄素T(ThT)的聚集反应在96孔平板中建立，条件与上述反应相似，不同的是每个100μl反应还含有2μM ThT。如前所述通过摇动诱导聚集(4)。对媒介物和1的21个复制品进行总共四次以上的独立实验(平板)。
电子显微照片由Scripps Research显微镜核心设施记录。
LC稳定性的蛋白酶偶联荧光偏振测定.为了鉴定FL LC动力学稳定剂，开发了蛋白酶偶联荧光偏振(PCFP)测定(图1a)。此测定测量FL LC的蛋白酶抗性-反映了小分子结合所赋予的动力学稳定性(4,5)。AL患者来源的λ6-57FL LC(被称为WIL(23))裂解为更小的片段需要构象偏移(4)并导致LC缀合荧光素荧光团的荧光偏振(FP)降低(图1a)(24)。将表面暴露的K79C V结构域突变(根据Kabat方案编号(25))引入FL WIL和非AL FL LC JTO(23)中，经由连接的马来酰亚胺将荧光素缀合到其上。所得缀合物称为WIL-FL*和JTO-FL*，通过离子交换色谱法纯化。由于单体之间的二硫键，WIL-FL*和JTO-FL*都是专性二聚体。蛋白酶K(PK)是一种广谱丝氨酸蛋白酶，其可在生理条件(4)下有效裂解瞬时去折叠的LC，用于PCFP测定，以尽量减少LC之间的任何序列特异性裂解位点差异。
在37℃下，在磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)中测量了分别掺入未标记的WIL-FL和JTO-FL(10μM)中的WIL-FL*和JTO-FL*(20nM)的PK蛋白水解。基于SDS-PAGE的LC条带消失，两种标记的LC均以比亲本序列更高的速率降解(图1b；对于WIL-FL*，kobs＝7.6±0.3*10-4s-1，对于WIL-FL，为2.4±0.9*10-4s-1；对于JTO-FL*，为9.5±3.5*10-5s-1，而JTO-FL则没有可测量的降低，平均值±sd，n＝3)。K到C的突变及随后的荧光素缀合降低了两种LC的动力学稳定性，这可能是通过在显示溶剂化染料的区域中折叠时降低溶剂熵变化，即通过减弱疏水作用来实现的。重要的是，AL相关WIL-FL*的内切蛋白酶解明显快于动力学更稳定的JTO-FL*(图1b)。在37℃下，于PBS中用PK(500nM)处理WIL-FL*(20nM)导致FP(λex＝488nm,λem＝520nm)以一定速率(kobs＝9.9*10-4s-1)降低，这与通过SDS-PAGE测量的结果相当，而JTO-FL*的FP降低得更慢(kobs＝1.8*10-4s-1)，如所预期(图1c)。
PCFP测定被小型化为384孔微孔板形式，并证实在适合高通量筛选的条件下观察到类似的蛋白水解模式。在22℃下，于PBS中，WIL-FL*(20nM)在24小时内被PK(500nM)裂解，而JTO-FL*则裂解得更慢(图1d)。之前观察到变性剂诱导的去折叠速率与内切蛋白酶解速率之间的相关性(4)。初始实验显示，WIL-FL*和JTO-FL*的FP在PK存在下以相似的速度下降，而在PK不存在时则提高。这似乎是由于平板表面上LC的变性所致。将Pluronic F-127洗涤剂添加到未处理的平板(Greiner#655076)中可防止在不存在PK的情况下FP的提高，并产生类似于具有PK的比色皿中的蛋白水解动力学。使用含或不含Pluronic F-127洗涤剂(0.02％)的低结合平板不会改变WIL-FL*内切蛋白酶解的速率。因此，由于低结合平板的成本增加，将Pluronic F-127洗涤剂添加到未处理的平板中，用于高通量筛选和后续实验。这种洗涤剂可具有减少小分子的胶体聚集的额外益处(26)。24小时后，亲液盐硫酸钠的添加降低了WIL-FL*蛋白水解的程度，这与其稳定化作用一致(图1e)。WIL-FL*内切蛋白酶解的程度不受PK浓度的影响，这与FL LC构象从天然状态的偏移是蛋白水解的速率限制一致(4)，这种情况称为EX1动力学(图1e)。该测定表现出0.8的稳健Z'分数(27)。
对保护LC免受蛋白水解的小分子的鉴定.使用384孔PCFP测定和WIL-FL*筛选了包含16,000个小分子的商业文库。结果指导将测定进一步小型化成1,536孔平板，从而优化了WIL-FL*(10nM)、PK(250nM)和动力学稳定剂候选物(6.75μM)的浓度。筛选包含653,085个小分子的额外文库，鉴定了2,777个初级命中，显示出>20.6％(平均值+3个标准差)的WIL-FL*FP保留率(相对于指定为0％的0.68％媒介物(DMSO)对照，其中100％对应于JTO-FL*的FP，没有PK)。PCFP测定在2,777个初级筛选命中中以一式三份重复，其中1,422个分子具有>20.6％的WIL-FL*FP平均保留率。
为了鉴定和排除干扰FP测量的分子，重复该测定，但直到PK处理24小时后才添加候选稳定剂(图1f)。人为提高FP的化合物将导致两种测定配置中FP的相似表观保留。662个分子在初级筛选中的平均活性(n＝3)比在这个反筛选中高出>1.25倍(2,115个分子人为地提高了FP)。为了消除PK抑制剂，使用蛋白酶嗜热菌蛋白酶(200nM；候选稳定剂浓度6.75μM；图1g)对2,777次命中重新进行PCFP筛选，一式三份。嗜热菌蛋白酶是一种广谱金属蛋白酶，它可能不受抑制PK(一种丝氨酸蛋白酶)的化合物的抑制。绘制嗜热菌蛋白酶与PK数据的关系图在对角线上鉴定了1,243种不是蛋白酶抑制剂的化合物(图1g)。满足所有三个评估标准的269个小分子(一式三份，表现出PCFP活性，通过FP人为反筛选(图1f)，并在PCFP嗜热菌素反筛选中表现出>20％功效)被保留。
这些幸存的269种LC动力学稳定剂的效力是通过记录上一段中介绍的三种PCFP配置中的浓度依赖性数据以及似乎抑制一种或两种蛋白酶的147种候选物来测量的。选择了128种表现出剂量反应曲线的化合物用于进一步评价。通过测量它们抑制荧光肽底物的蛋白水解的能力进一步证实了这128种化合物不抑制PK。为了排除初始FP幅度的差异可导致对终点FP测量的误解的可能性，测量了PK处理后的FP动力学。128种化合物中的90种降低了相对于媒介物的FP变化的速率和幅度，与LC动力学稳定化一致。最后，为了验证FP测量报告了FL LC蛋白水解敏感性，使用SDS-PAGE测量WIL-FL*免受上述128种化合物赋予的PK蛋白水解的保护。通过此测定，26个分子稳定化FL LC。16个分子在动力学FP和SDS-PAGE测定中均显示出明显的活性(表1)。
16种命中分子分为四类(表1-化合物1-16)：香豆素(1-3,9-15)、芳基氰基丙烯酰胺(4)、联芳腙(5-6)和乙内酰脲(7-8)。来自商业文库的两种砜(17-18)也被验证为命中。
小分子1至16被鉴定为来自Scripps Florida筛选的命中，并且在PCFP和SDS-PAGE测定中都显示出明显的活性。小分子17至18被鉴定为来自商业文库的命中。包括相关但非活性香豆素19、20和21的数据以供参考。活性被归一化为来自试验性筛选(n＝1)、初级筛选(n＝1)或反筛选(平均值±sd,n＝3)的高和低对照的活性。EC50值是根据筛选过程中测量的剂量反应曲线计算的。获得了化合物1-15的LC-MS验证，观察到化合物16的多个峰，未测定化合物17-21。ND＝未测定
购买了八个代表性小分子，并通过滴定确定它们在PCFP测定中的中点有效浓度(EC50)值。使用平衡透析对每种化合物测量的解离常数(KD配体)与EC50值相似，表明结合小分子的FL LC对蛋白水解具有高度抗性。
表1:筛选使LC稳定的选定小分子和选定的非活性类似物的数据。
Figure BDA0003321903570001531
Figure BDA0003321903570001541
Figure BDA0003321903570001551
Figure BDA0003321903570001561
7-氨基-香豆素是λ6a LC的荧光动力学稳定剂。在反筛选中幸存的128个筛选命中中的24个是香豆素在7位被二乙氨基(21个分子，例如1和2；表1)或1-苯基乙氧基(3个分子，例如3；表1)修饰。香豆素通常被认为是混杂的粘合剂；然而，文库中的7,839个其他含有香豆素的分子(其中432个在7位被修饰)在反筛选后未被鉴定为命中。最初专注于化合物1，即7-二乙氨基-4-甲基香豆素，一种称为“香豆素1”的市售染料。
为了验证1的活性并研究香豆素的7位处的结构要求，测量了未标记的WIL-FL对PK蛋白水解的保护作用。WIL-FL(10μM)与1(100μM；表1和图2a)一起孵育，但不包括相关化合物19、20和21(100μM，图2a和表1)，可保护此FL LC免受PK蛋白水解(t＝2小时)。在4位缺少甲基的化合物9也能稳定化WIL-FL，但不如1有效(图2a和表1)。WIL-FL(20μM)与1(1μM)的孵育导致相对于PBS中1较弱的红移荧光(图2b，λex＝373nm)，1的荧光发射的较大增加，提示与结合相关的1的环境改变和7-二乙氨基的受限移动性对其荧光性的贡献(28)。相比之下，19(1μM)在PBS中发荧光，但在WIL-FL(20μM；图2b)存在下，其发射强度降低。1的FP从缓冲液中的0.05提高至WIL-FL·1复合体中的0.35，与旋转相关时间的增加一致。
1的荧光性使其成为研究除WIL-FL以外的LC是否可以在动力学上稳定并且其他非荧光候选动力学稳定剂是否在同一位点处结合LC的便捷探针。等温滴定量热测量指示1与WIL-FL结合，其中KD配体为3.08±0.52μM(平均值±sd，n＝3)。为了测量结合，将不同的WIL构建体滴定到含有0.02％Pluronic F-127的PBS中的1中，并以384孔平板形式测量LC·1复合体的荧光发射(图2c，λex＝373nm,λem＝445nm)。使用1(1μM)的低浓度和不同的LC浓度(从133μM至18nM以1.5倍递减的方式连续稀释)以最大限度地减少背景荧光并简化分析。化合物1与WIL-FL的结合充分拟合1位点模型，其表观KD配体为3.14±0.3μM(平均值±sd，n＝5)，而与WIL V结构域的结合对LC浓度的依赖性更大，并且不太拟合1:1结合模型(表观KD配体为79.3±5.2μM)。未检测到1(1μM)与分离的λ3C-结构域的结合(图2c)。重组FLλ6-57LC形成二硫键连接的二聚体(4)，但它们分离的V结构域在单体与二聚体之间形成平衡(4,22,29)。1与WIL-V结合的明显正协同性与诱导的LC V结构域二聚化一致。
浓度依赖性NMR化学位移数据指示WIL-V具有约5mM(22)的二聚平衡常数(KD二聚体)。将荧光数据拟合到受NMR衍生的KD二聚体约束的结合诱导二聚化模型中，造成WIL-V2·1的表观KD配体为3.0±1.2μM，表明与WIL-FL相比，WIL-V的表观亲和力较低是由于处于平衡状态的WIL-V二聚体浓度较低。由于WIL-FL与二聚WIL-V的亲和力无法区分，可以假设1仅与二聚WIL-V结合，且因此，在1(1μM)存在的情况下，根据荧光结合数据估计表观KD二聚体为1.45mM，而没有1时为5mM。
成功的动力学稳定剂应该，但不是必须，结合并稳定化具有广泛序列的患者LC(30,31)。为了询问1是否可以稳定化其他FL LC序列，测量了1与3个以上重组λ6-57FL LC二硫键连接的二聚体的结合：JTO-FL；ALMC2-FL，一种源自ALMC2细胞系的AL相关LC序列(32)；和种系序列6aJL2-FL。将这些LC在PBS中以1.5倍递减量从133μM至18nM连续稀释至1(1μM)中，产生介于1与20μM之间的KD配体值(图2d，左图)。来自WIL、ALMC2和6aJL2的分离的V结构域结合1(1μM)，亲和力降低(图2d，左图)，而JTO-V的KD配体为16.5±0.4μM(平均值±sd，n＝3)，类似于JTO-FL(20.3±1μM)，与JTO-V在此浓度下主要为二聚体一致(22)。通过C214S突变消除C结构域之间的链间二硫键会降低LC对1(1μM)的亲和力(图2d)，这与该突变对二聚体界面的去稳定化一致(4)。
为了进一步检验1在V结构域之间的界面处结合的假设，测量了1与具有突变的WIL-FL和JTO-FL变体的结合，这些突变被设计来破坏二聚体(22)。F98D突变破坏V结构域-V结构域界面，在存在或不存在C214链间二硫键的情况下，无法检测到1(1μM)的结合(图2d，右图)。F118D突变使C结构域-C结构域界面去稳定，或L117G或P141A突变使C结构域疏水核心去稳定，这些突变导致1(1μM)对WIL-FL C214S的结合亲和力降低并且在较小程度上，对JTO-FL C214S的结合亲和力降低(图2d，右图)，其中KD值与分离的V结构域所呈现的值(≈20-50μM)相似。
为了进一步研究小分子诱导LC二聚化的能力，对WIL-V和WIL-FL C214S(20μM)在1(100μM)存在或不存在的情况下进行沉降速度分析超速离心(SV-AUC)分析。连续沉降分布(图2e)示出了沉降物质的表观大小。与预期大小的偏差表明物质之间的交换，在这种情况下是单体和二聚体。结合1(100μM)后，两种LC(20μM)的大小分布都会增加。WIL-FL C214S的KD二聚体约为16μM，通过浓度依赖性SV-AUC实验估计。
在两类人LC中，λ和κ，λLC在AL中更常见，但一小部分患者会分泌κ1-33LC(12,33)。为了询问κLC是否具有与λLC相似的小分子结合位点，将1(1μM)与两个κ1-33LC(从133μM以1.5倍递减量连续稀释到18nM)一起孵育，它们代表患者来源的序列AL12-FL(34)及其种系前体κI O18/O8-FL(7)。使用与用于λ6-57LC的方案类似的方案对这些κ1-33LC进行重组表达，产生单体和二聚体LC，如由SV-AUC所示(SI附录图S7)。与这种降低的二聚化倾向一致，1与κ1-33LC的结合弱于与λ6-57LC的结合(图2f)。过量的κ1-33LC(20μM)与1(1μM)的结合提供了FL LC·1荧光(图2f，插图)。此结果表明1的结合位点存在于λ6-57和κ1-33LC的二聚体中。
为了询问表1中的非香豆素小分子是否在相同或重叠位点处与FL LC结合，测量了1(1μM)与WIL-FL(从150μM以1.5倍递减量连续稀释到20nM)在其他筛选命中(10μM)存在下的结合。LC对1的表观结合亲和力被筛选中鉴定的六个非荧光分子降低，但阴性对照二氟尼柳没有降低，二氟尼柳是一种稳定化转甲状腺素蛋白的抗炎药物(15,35)(图2g)。这些数据提示命中具有与1重叠的结合位点，或与1对WIL-FL表现出负协同结合。
AL患者的血浆中游离单克隆LC的浓度通常在1-20μM(10-100mg/dl)(36)的范围内，而抗体和白蛋白的浓度则要高得多。因此，动力学稳定剂优先于其他血浆蛋白对FL LC的结合选择性对于最小化游离FL LC的比例很重要。白蛋白结合血液中的许多小分子，通常具有μM KD值。用1(1μM)滴定白蛋白(从400μM以1.5倍递减量连续稀释到53nM)导致香豆素荧光的增加，其中表观KD为37±3μM(图2h)。在100μM二氟尼柳存在下，1对白蛋白的亲和力降低(图2h)，这与二氟尼柳与白蛋白的竞争性结合一致。
抗体中LC与重链(HC)之间的异二聚体界面在结构上不同于LC同二聚体界面。为了验证动力学稳定剂与抗体相比选择性结合FL LC二聚体，比较了1(1μM)与5J8(一种人抗流感血凝素抗体)的LC和抗原结合片段(Fab，LC:HC二聚体)的结合(从120μM以1.5倍递减量连续稀释到16nM)(37)。来自λ3类(不与AL相关)的5J8 FL LC与1结合，其中表观KD≈50μM(图2i)，这是保护5J8 LC免受PK蛋白水解的事件。相比之下，通过荧光所测量，5J8 Fab与1没有显示表观结合(图2i)，并且1不能保护5J8 Fab免受PK蛋白水解。
野生型(WT)全长λ6-57LC构建体是专性的、二硫键交联的二聚体。其他物质在单体与二聚体之间处于平衡状态。参见表2。NMR测量显示，全长C214S LC构建体在200μM下为二聚体。报告了具有二聚体样化学位移的原聚体之间结构域界面处的残基百分比。NMR数据进一步描述于Rennella等人(5)中。
表2.不同LC种类的单体-二聚体平衡概述。
Figure BDA0003321903570001601
Figure BDA0003321903570001611
对LC动力学稳定剂结合的结构洞察.确定了带有和不带有结合1的JTO-FL的晶体结构。迄今为止，尝试结晶其他LC·动力学稳定剂复合体(例如WIL-FL·1复合体)尚未成功。未结合的JTO-FL LC结构与先前公布的FL LC结构(3,5,38)非常相似(图3a)。LC同二聚体通过单体的C结构域中C214残基之间的链间二硫键共价连接。在以
Figure BDA0003321903570001612
分辨率细化的apo JTO-FL结构中，V结构域的构象与已公布的JTO-V二聚体结构中的构象相同(39)。
JTO-FL·1复合体的结构以
Figure BDA0003321903570001613
分辨率细化，在由两个V结构域形成的界面处明确显示1的密度。此结合位点与之前的报道一致，即二聚体中V结构域之间的界面可以容纳各种芳族配体(21,40)，尽管在下面鉴定的确切结合位点先前尚未观察到。1的结合位点包含来自一个原体的残基P44、Y87和F98以及来自另一个原体的Y36′、P44′和T46′(图3b)，它们一起形成未结合结构中不存在的空腔(图3c；参看右图至左图)。JTO-FL F98D变体(22)对1没有可测量的亲和力(图2d)，这与在结构中观察到的π-π堆积相互作用的破坏一致。7-二乙氨基亚结构通过V结构域-V结构域界面突出，与两个P44残基相互作用。这些相互作用可以解释在香豆素支架的7位处进行修饰的明显要求。1氢的羰基氧与T46′的侧链羟基和/或主链酰胺键合。1与Y87之间的CH-π相互作用也可促成结合自由能。1的结合导致V结构域相对于彼此旋转，从而产生界面空腔(图3c)。F98与P44′的Cα残基之间的距离从
Figure BDA0003321903570001621
增加到
Figure BDA0003321903570001622
以容纳1。LC二聚体有两对F98和P44残基，产生两个潜在的结合位点，但每个二聚体仅观察到1的一个分子。利用相同的分子间相互作用对齐1的第二个分子会导致二乙氨基亚结构之间的空间位阻。
JTO用于结合1的残基是高度保守的(图3d)。残基Y36、P44、Y87和F98分别存在于所有人种系LC基因的88％、99％、95％和100％中，而T46仅存在于两种功能性种系基因中。WIL-FL和JTO-FL中的残基46突变为亮氨酸，这是存在于75％LC种系基因中的残基，该突变略微提高1对这些FL LC的结合亲和力，表明T46'的侧链羟基并非1的结合所必需的。
为了验证1与晶体结构中鉴定的相同位点处溶液中不同的LC结合，记录了WIL-FL、WIL-V和JTO-V在不存在和存在1下的NMR谱。使用高浓度的LC(100-500μM)和溶解度限制浓度的1(高达500μM)来最大化结合态的NMR信号。2维1H-15N异核单量子相干(HSQC)实验，其中蛋白质中的每个酰胺都表示为光谱中的一个峰，允许鉴定被1的结合扰动的残基。每个光谱中相似残基的化学位移和强度扰动在添加1时发生(图4a)。在每种情况下，扰动的残基都集中在两个V结构域之间的界面上，靠近根据晶体结构结合1的位点(图4b)。在将1滴定到专性二聚体WIL-FL中后(4)，结合位点附近的酰胺出现结合状态LC2·1的新峰(图4a、b)。LC2和LC2·1的峰强度变化可以通过双态结合模型拟合，其中表观KD为19±2μM(图4c)。
浓度依赖性化学位移测量(22)指示JTO-V在用于NMR的浓度(通常大于100μM)下是二聚体，其中二聚化KD为约12.5μM。在并非被设计来测量交换率的常规HSQC实验中，1与JTO-V(140μM)以大约等摩尔的化学计量结合导致来源于LC2和LC2·1的峰之间出现交换交叉峰(图4d，红色轮廓)。ZZ交换实验(41)分别测量了JTO-V2·1复合体的1∶00±0.10μM-1s-1和57±2s-1的结合和解离率，为双态模型产生57±4μM的KD，与由荧光测量的值一致(图2d)。
1与分离的WIL-V(400μM)的结合更为复杂，因为此V结构域在不存在配体的情况下是单体(KD≈5mM)(22)，并且在添加1后变为二聚体。15N横向弛豫(R2)率(报告整体蛋白质翻滚并因此报告分子大小)在添加过量1(500μM)后，WIL-V会增加一倍，而对于JTO-V(140μM)，它们不会改变，JTO-V在没有和有1结合的情况下是二聚体(图4e)。值得注意的是，与1结合的WIL-V对于大多数界面残基表现出多个HSQC峰，并且可代表二聚体或结合配体的替代构象(图4f)。WIL-V的LC2·1复合体的多重构象的存在阻碍了KD的准确量化。化学交换饱和转移(CEST)实验(42)指示WIL-V2·1的KD<50μM，与从荧光结合滴定测定的3±1.6μM的有效KD一致(图2c)。通过透析从WIL-V中去除1产生了与起始材料无法区分的HSQC光谱，表明结合是可逆的和非共价的。因此，在结合状态谱中观察到的异质性(图4f)可能是由于替代结合模式。
接下来询问动力学稳定剂的结合如何影响不同LC的稳定性。在这些实验中，通常使用过量的动力学稳定剂(受小分子溶解度限制)使LC结合饱和，从而研究配体稳定的LC的性质，作为以纳摩尔亲和力与LC结合的小分子行为的代表。C214S突变对链间二硫键的清除导致LC动力学稳定性降低(4)和小分子结合亲和力降低(图2d)。尽管如此，1(100μM)的结合仍将WIL-FL C214S(10μM)的PK蛋白水解速率常数从6.9x10-3降至2.8x10-3s-1(图5a)。
为了证实蛋白酶抗性是由小分子结合稳定化LC天然状态集合所驱动的，通过色氨酸发射荧光测量溶液中LC的尿素介导的去折叠率(4)。1的固有荧光排除了它在这些实验中的使用。WIL-FL(5μM)在5(在50μM的溶解度限制浓度下使用的非荧光动力学稳定剂，表1)存在下以2.43s-1的速率常数(外推至不存在变性剂)去折叠，与单独的WIL-FL的3.57s-1相比(图5b)。5的结合提高FL LC的动力学稳定性，即使本实验中使用的>5M尿素浓度会降低5对FL LC的亲和力。在不存在或存在1(100μM)或5(50μM)的情况下将尿素滴定到WIL-FL(5μM)中揭示了去折叠FL LC(图5c)所需的尿素中点浓度从1.4增加到2.0M。1和5赋予的这种稳定化的大小无法区分(图5c)，表明配体结合状态同样稳定。
为了验证1的结合减少非变性条件下LC的去折叠，通过NMR测量了WIL-V和JTO-V(100μM)在没有或有1(500μM)的情况下残基特定的氢-氘交换率。这些速率(与每种酰胺相关的HSQC峰强度的降低)被转换为自由能，通过对非结构化肽中公布的酰胺交换率进行归一化来报告每种酰胺的折叠平衡。在存在1(500μM，图5d)的情况下，两个V结构域均稳定了0.6kcal/mol，表明通过结合1减少瞬时去折叠。
为了验证动力学稳定剂与重组FL LC类似地结合细胞分泌的LC，测量了ALMC2细胞分泌的LC的蛋白水解，ALMC2细胞是一种源自AL患者的细胞系(32)。纯化的ALMC2衍生的LC(5μM)被PK(100nM)裂解，速率常数为3.83x10-4s-1，而在存在1(100μM；图5e)的情况下，由PK孵育1h之后没有检测到蛋白水解。
LC聚集的抑制.全长LC在体外比其分离的V结构域更不容易聚集(4,7)。尽管可以在体外测量聚集，但尚不清楚这些实验在多大程度上重现了患者中发生的过程，其中聚集的机制未知。在药物发现的命中阶段，动力学稳定剂对FL LC聚集影响的评估由于用于去稳定FL LC以促进体外聚集的变性酸性pH值而变得复杂，这也会降低动力学稳定剂的结合亲和力，有时显著地降低。
为了评估1对FL LC聚集的影响，使用WIL-FL C214S，它形成弱二聚体(KD＝16μM)，与WIL-FL相比增加了它聚集的倾向，同时保持了对1的亲和力(图2d)WIL-FL C214S在pH 5或低于pH 5时剧烈搅拌时会聚集，形成异质聚集结构。通过淀粉样蛋白结合染料硫黄素T的荧光所评估的WIL-FL C214S聚集动力学表明，与媒介物对照相比，1显著降低了聚集速率，但这些实验中的变异性大于预期。这可能是因为给定的LC可随机形成具有不同动力学的不同聚集体结构。
因此，还通过使用尺寸排阻色谱(SEC)(4)测量可溶性二聚体LC的消失率来量化聚集。1(200μM)与WIL-FL C214S(10μM)结合使二聚体稳定并提高动力学稳定性(图5a)，导致更大比例的可溶性二聚体LC(其在pH 5下摇动64小时后从SEC柱中洗脱)，这会促进聚集。虽然单个WIL-FL C214S聚集反应在运行与运行之间呈现出动力学变化，但在存在1(200μM；蓝色虚线，图5f，n＝10)时的聚集通常比不存在1时要慢(图5f，红色虚线，n＝10)。将图5f中的所有聚集数据拟合到单个指数衰减模型，揭示WIL-FL C214S在存在1(k聚集＝0.011hr-1，图5f，粗体蓝色曲线)时比不存在1(k聚集＝0.066hr-1，图5f，粗体红色曲线，P<0.001，对数转换率的t检验)时聚集得明显更慢。
未标记的LC蛋白酶敏感性测定.WIL-FL(5μM)在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)+0.02％Pluronic F-127中与蛋白酶K(50nM)和小分子(10μM)在1％DMSO媒介物或单独的媒介物中孵育。在37℃下2小时后，用2mM苯甲基磺酰氟的甲醇溶液淬灭反应，并以14,000rpm离心2分钟。通过在等度条件(0.2mL/min，PBS+1mM EDTA，2400psi反压力，15分钟)下将10μL上清液注入配备有BEH200分析尺寸排阻柱(1.7μm，4.6x150mm)的Waters Acquity H-ClassBio-UPLC(超高效液相色谱)仪器中并监测280nm处的吸光度，对剩余的WIL-FL进行定量。每种化合物的活性给出为蛋白酶的保护倍数＝(A_化合物–A_媒介物)/(A_无_蛋白酶–A_媒介物)，其中每个“A”对应于相应处理的峰积分。LC蛋白酶敏感性测定的结果示于表3中。
表3:在10μM下WIL-FL的蛋白酶K敏感性测定中，LC对蛋白酶的保护倍数。保护：A<0.3)；3≤B<0.6；及C≥0.6。
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Figure BDA0003321903570001671
Figure BDA0003321903570001681
Figure BDA0003321903570001691
Figure BDA0003321903570001701
化合物 保护 化合物 保护 化合物 保护
293 B
294 A
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296 B
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300 A
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本公开中引用的编号参考文献
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包括出版物、专利申请和专利在内的本文所引用的所有参考文献据此以引用方式并入，其程度等同于每个出版物单独地且具体地被表示为以引用方式并入本文并且以其全文在本文得以陈述。

Claims (36)

1.一种式Ia或Ib的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003321903560000011
其中
A为H或
Figure FDA0003321903560000012
X1为O或NR0；
X2选自由以下组成的组：键、NR12、O、C(O)、C(O)NR11和CR12R11；
X3为O或NR13；
W选自由以下组成的组：键、OC(O)、C(O)O、C(O)NR14、NR14C(O)O、OC(O)NR14、NR14C(O)、NR14C(O)NR15、NR14、
Figure FDA0003321903560000013
m是选自1、2、3、4、5和6的整数；
n是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
p是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
r是选自0、1、2和3的整数；
Z1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、卤素、NR16R17、COOR18；OR18、NR16SO2R18、NR16COR18、X4(CR21R22)aCONR16R17、X4(CR21R22)aCOOR18、X4(CR21R22)aCOR18、X4(CR21R22)aNR16R17、X4(CR21R22)aOR18、SO2NR16R17、X4(CR21R22)aNR16COR18、C(N＝R23)NR24OH和
Figure FDA0003321903560000021
其中
X4为键、O或NR0；并且
a是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
Z2选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、CN、OR18和NR19R20；
Ar1为选自C6-C10-亚芳基和5至10元杂亚芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)的二价部分；
R1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、OH、(CR21R22)bOR18(b是选自0、1、2、3、4、5和6的整数)、卤素和(C1-C6)卤烷基；
R2、R3和R4独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、OH、(CR21R22)bOR18、卤素、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R0和R5-R22独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C1-C6-卤烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R16和R17独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、C(O)OR18、C(O)R18和SO2R18；
R14和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R15和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R14连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R15连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R17连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环，其中环成员选自C、O和N；
R19和R20连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R21和R22连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
或
根据式II的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003321903560000051
其中
R23–R28独立地选自由以下组成的组：H、卤基、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
Ar2为C6-C10-芳基或5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S；
q是选自0、1、2、3和4的整数；
t是选自0、1、2、3和4的整数；
其中式Ia、式Ib或式II中的任何烷基、环烷基、杂环烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、芳基、杂芳基和环部分任选地被一至六个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、卤基、C1-C6-卤烷基、-NR’2(其中各R’独立地选自由H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基和C6-C10-芳基组成的组)、-NHC(O)(OC1-C6-烷基)、-NO2、-CN、氧代、-C(O)OH、-C(O)O(C1-C6-烷基)、-C1-C6-烷基(C1-C6-烷氧基)、-C(O)NH2、-C(O)C1-C6-烷基、-OC1-C6-烷基、-Si(C1-C6-烷基)3、-S(O)0-2-(C1-C6-烷基)、C6-C10-芳基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、3至14元杂环烷基和-(C1-C6-烷基)-(3至14元杂环)(其中1-4个杂环成员独立地选自N、O和S)和-O(C6-C14-芳基)；
且其中式Ia或式Ib的化合物不是以下化合物中的任一种：
Figure FDA0003321903560000061
Figure FDA0003321903560000071
Figure FDA0003321903560000081
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式Ia。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式Ib。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中X1和X3各自为O。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中R2、R3和R4各自独立地选自H和C1-C6-烷基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中R2、R3和R4各自为H。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中R1为H或C1-C6-烷基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中R1为C1-C6-烷基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中R1为甲基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中X2为NR12且p为0、1或2。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中Z2和R12各自独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基和C3-C8-环烷基。
12.根据权利要求10或11所述的化合物，其中Z2和R12各自为C1-C6-烷基。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的化合物，其中p为0且Z2和R12各自为乙基。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中：
X2为O；
Z2为C6-C10-芳基或-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)；
p为1、2或3；且
R7和R8独立地选自H、C1-C6-烷基。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中Z2为苯基或苄基，且R7和R8独立地选自H、甲基、三氟甲基和乙基。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其中A为
Figure FDA0003321903560000101
17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中A为
Figure FDA0003321903560000102
18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中m为2且n为1。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的化合物，其中W选自由以下组成的组：
OC(O)NR14；
NR14C(O)NR15；
Figure FDA0003321903560000103
20.根据权利要求1至19中任一项所述的化合物，其中Ar1选自由以下组成的组：苯基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡嗪基、吡啶基和三唑并吡嗪基。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中Z1选自H、C1-C6-烷基和5元杂环烷基。
22.根据权利要求1所述的化合物，其中：
所述化合物具有式Ia或Ib；
X1和X3各自为O；
X2为NR12，其中R12为C1-C6-烷基；
p为0；
Z2为C1-C6-烷基；
A为
Figure FDA0003321903560000111
m为2且n为0或1；
W选自由以下组成的组：OC(O)NR14、NR14C(O)NR15、
Figure FDA0003321903560000112
R5、R6、R9和R10独立地选自H和C1-C6-烷基；
Ar1选自由以下组成的组：苯基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡嗪基、吡啶基和三唑并吡嗪基；并且
Z1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基和5元杂环烷基。
23.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自下表：
Figure FDA0003321903560000121
Figure FDA0003321903560000131
Figure FDA0003321903560000141
Figure FDA0003321903560000151
Figure FDA0003321903560000161
Figure FDA0003321903560000171
Figure FDA0003321903560000181
Figure FDA0003321903560000191
Figure FDA0003321903560000201
Figure FDA0003321903560000211
Figure FDA0003321903560000221
Figure FDA0003321903560000231
Figure FDA0003321903560000241
Figure FDA0003321903560000251
Figure FDA0003321903560000261
Figure FDA0003321903560000271
Figure FDA0003321903560000281
Figure FDA0003321903560000291
24.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式II。
25.根据权利要求1或22所述的化合物，其中q和t各自为0或1且Ar2为C6-C10-芳基。
26.根据权利要求23或25所述的化合物，其中q为1且t为0。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的化合物，其中Ar2为苯基，其任选地被-NR’2(其中各R’独立地选自由H、C1-C6-烷基组成的组)和C1-C6-卤烷基取代。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的化合物，其中R25、R26、R27和R28各自独立地为H或C1-C6-烷基。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的化合物，其中R25、R26、R27和R28各自为H。
30.根据权利要求1和23至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自下表：
Figure FDA0003321903560000301
31.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至30中任一项所述的化合物和药学上可接受的载剂。
32.一种稳定化呈其天然构象的免疫球蛋白轻链二聚体的方法，其包括使所述二聚体与有效量的式Ia或Ib化合物或其药学上可接受的盐接触：
Figure FDA0003321903560000302
其中
A为H或
Figure FDA0003321903560000303
X1为O或NR0；
X2选自由以下组成的组：键、NR12、O、C(O)、C(O)NR11和CR12R11；
X3为O或NR13；
W选自由以下组成的组：键、OC(O)、C(O)O、C(O)NR14、NR14C(O)O、OC(O)NR14、NR14C(O)、NR14C(O)NR15、NR14、
Figure FDA0003321903560000311
m是选自1、2、3、4、5和6的整数；
n是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
p是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
r是选自0、1、2和3的整数；
Z1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、卤素、NR16R17、COOR18；OR18、NR16SO2R18、NR16COR18、X4(CR21R22)aCONR16R17、X4(CR21R22)aCOOR18、X4(CR21R22)aCOR18、X4(CR21R22)aNR16R17、X4(CR21R22)aOR18、SO2NR16R17、X4(CR21R22)aNR16COR18、C(N＝R23)NR24OH和
Figure FDA0003321903560000312
其中
X4为键、O或NR0；并且
a是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
Z2选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、CN、OR18和NR19R20；
Ar1为选自C6-C10-亚芳基和5至10元杂亚芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)的二价部分；
R1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、OH、(CR21R22)bOR18(b是选自0、1、2、3、4、5和6的整数)、卤素和(C1-C6)卤烷基；
R2、R3和R4独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、OH、(CR21R22)bOR18、卤素、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R0和R5-R22独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C1-C6-卤烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R16和R17独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、C(O)OR18、C(O)R18和SO2R18；
R14和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R15和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R14连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R15连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R17连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环，其中环成员选自C、O和N；
R19和R20连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R21和R22连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
或
根据式II的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003321903560000341
其中
R23–R28独立地选自由以下组成的组：H、卤基、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
Ar2为C6-C10-芳基或5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S；
q是选自0、1、2、3和4的整数；
t是选自0、1、2、3和4的整数；
其中式Ia、式Ib或式II中的任何烷基、环烷基、杂环烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、芳基、杂芳基和环部分任选地被一至六个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、卤基、C1-C6-卤烷基、-NR’2(其中各R’独立地选自由H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基和C6-C10-芳基组成的组)、-NHC(O)(OC1-C6-烷基)、-NO2、-CN、氧代、-C(O)OH、-C(O)O(C1-C6-烷基)、-C1-C6-烷基(C1-C6-烷氧基)、-C(O)NH2、-C(O)C1-C6-烷基、-OC1-C6-烷基、-Si(C1-C6-烷基)3、-S(O)0-2-(C1-C6-烷基)、C6-C10-芳基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、3至14元杂环烷基和-(C1-C6-烷基)-(3至14元杂环)(其中1-4个杂环成员独立地选自N、O和S)和-O(C6-C14-芳基)。
33.一种治疗患者的轻链淀粉样变性的方法，其包括向所述患者施用有效量的式Ia或Ib化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003321903560000351
其中
A为H或
Figure FDA0003321903560000352
X1为O或NR0；
X2选自由以下组成的组：键、NR12、O、C(O)、C(O)NR11和CR12R11；
X3为O或NR13；
W选自由以下组成的组：键、OC(O)、C(O)O、C(O)NR14、NR14C(O)O、OC(O)NR14、NR14C(O)、NR14C(O)NR15、NR14、
Figure FDA0003321903560000361
m是选自1、2、3、4、5和6的整数；
n是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
p是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
r是选自0、1、2和3的整数；
Z1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、卤素、NR16R17、COOR18；OR18、NR16SO2R18、NR16COR18、X4(CR21R22)aCONR16R17、X4(CR21R22)aCOOR18、X4(CR21R22)aCOR18、X4(CR21R22)aNR16R17、X4(CR21R22)aOR18、SO2NR16R17、X4(CR21R22)aNR16COR18、C(N＝R23)NR24OH和
Figure FDA0003321903560000371
其中
X4为键、O或NR0；并且
a是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
Z2选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、CN、OR18和NR19R20；
Ar1为选自C6-C10-亚芳基和5至10元杂亚芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)的二价部分；
R1选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、OH、(CR21R22)bOR18(b是选自0、1、2、3、4、5和6的整数)、卤素和(C1-C6)卤烷基；
R2、R3和R4独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、OH、(CR21R22)bOR18、卤素、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R0和R5-R22独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C1-C6-卤烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
R16和R17独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、C(O)OR18、C(O)R18和SO2R18；
R14和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R15和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R9连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R14连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R15连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R16和R17连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环，其中环成员选自C、O和N；
R19和R20连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
R21和R22连同它们所结合至的原子一起任选地为3至8元环；
或
根据式II的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003321903560000391
其中
R23–R28独立地选自由以下组成的组：H、卤基、C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、3至6元杂环烷基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C2-C6-烯基、C3-C8-环烯基、3至6元杂环烯基(其中1-4个环成员独立地选自N、O和S)、C6-C10-芳基、5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、-(C1-C6-烷基)(5至10元杂芳基)(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S)；
Ar2为C6-C10-芳基或5至10元杂芳基(其中1-4个杂芳基成员独立地选自N、O和S；
q是选自0、1、2、3和4的整数；
t是选自0、1、2、3和4的整数；
其中式Ia、式Ib或式II中的任何烷基、环烷基、杂环烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、芳基、杂芳基和环部分任选地被一至六个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、卤基、C1-C6-卤烷基、-NR’2(其中各R’独立地选自由H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基和C6-C10-芳基组成的组)、-NHC(O)(OC1-C6-烷基)、-NO2、-CN、氧代、-C(O)OH、-C(O)O(C1-C6-烷基)、-C1-C6-烷基(C1-C6-烷氧基)、-C(O)NH2、-C(O)C1-C6-烷基、-OC1-C6-烷基、-Si(C1-C6-烷基)3、-S(O)0-2-(C1-C6-烷基)、C6-C10-芳基、-(C1-C6-烷基)(C6-C10-芳基)、3至14元杂环烷基和-(C1-C6-烷基)-(3至14元杂环)(其中1-4个杂环成员独立地选自N、O和S)和-O(C6-C14-芳基)。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中式Ia、式Ib或式II的化合物或其药学上可接受的选自下表：
Figure FDA0003321903560000401
Figure FDA0003321903560000411
Figure FDA0003321903560000421
Figure FDA0003321903560000431
Figure FDA0003321903560000441
Figure FDA0003321903560000451
Figure FDA0003321903560000461
Figure FDA0003321903560000471
Figure FDA0003321903560000481
Figure FDA0003321903560000491
Figure FDA0003321903560000501
Figure FDA0003321903560000511
Figure FDA0003321903560000521
Figure FDA0003321903560000531
Figure FDA0003321903560000541
Figure FDA0003321903560000551
Figure FDA0003321903560000561
Figure FDA0003321903560000571
Figure FDA0003321903560000581
Figure FDA0003321903560000591
Figure FDA0003321903560000601
35.一种稳定化呈其天然构象的免疫球蛋白轻链二聚体的方法，其包括使所述二聚体与有效量的具有下式中任一个的化合物接触：
Figure FDA0003321903560000611
或其药学上可接受的盐。
36.一种治疗患者的轻链淀粉样变性的方法，其包括向所述患者施用有效量的具有下式中任一个的化合物：
Figure FDA0003321903560000621
或其药学上可接受的盐。
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