CN114126642A - 用于生物缀合的工程化cd47细胞外结构域 - Google Patents

Abstract

本发明提供了有关工程化CD47细胞外结构域(ECD)蛋白的组合物和方法。

Description

用于生物缀合的工程化CD47细胞外结构域

交叉引用

本专利申请主张于2019年3月4日提交的编号为62/813,510的美国临时专利申请案的优先权，上述专利申请以引用方式全文并入本文中。

基于纳米颗粒(NP)的靶向递送是一种有前景的药物递送方式，包括改进癌症治疗和诊断。但是，要有效递送货物，仍需克服一些挑战。除颗粒稳定性和特异性靶向外，免疫系统逃避也是一项重大挑战。施用的大多数NP会被单核吞噬细胞系统清除，只有一小部分输注的NP剂量能够到达靶组织。肝脏和脾脏受累，而肾脏系统也参与较小NP的清除。用聚乙二醇(PEG)包覆纳米颗粒可以帮助逃避肝脏中的吞噬细胞(包括库普弗细胞)，并通过创建“隐形”刷来延长血液循环时间(参见Hong等人，临床癌症研究，5，3645–52(1999)；以及Armstrong等人，癌症，110，103–11(2007))。聚乙二醇化还可以减少靶细胞对NP的吸收，且具有潜在的免疫原性。此外，随着时间的推移，血清蛋白(例如IgG)可以调理此类NP，从而提高吞噬细胞的清除率(参见Rodriguez等人，科学，339，971-5(2013))。

CD47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，具有单个Ig样细胞外结构域和五个跨膜区。它可用作SIRPα的细胞配体，通过SIRPα的NH₂末端V样结构域来介导结合。SIRPα主要在髓样细胞(包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突状细胞(DC)、肥大细胞)及其前体细胞(包括单核细胞和造血干细胞)上表达。有关SIRPα上介导CD47结合的结构决定子的讨论信息请参阅以下出版物：Lee等人(2007)，免疫学杂志，179:7741-7750；Hatherley等人(2007)，J.B.C.，282:14567-75。有关SIRPα顺式二聚化在CD47结合中所起的作用的讨论信息请参阅以下出版物：Lee等人(2010)，J.B.C.，285:37953-63；相应综述信息请参阅以下出版物：Barclay和vanden Berg，免疫学年鉴，32，25–50(2014))。

现已提议将CD47的细胞外结构域(ECD)作为逃避吞噬作用的手段。当CD47 ECD与吞噬细胞表面显示的SIRPαECD相互作用时，它会发出“别吃我”信号以抑制吞噬作用。细菌、病毒和NP等外来物质被吞噬细胞吞噬，部分原因在于它们缺乏表面CD47。据报道，在其表面显示CD47 ECD或CD47“自身”肽的基于聚合物的NP和P22病毒样颗粒(VLP)的吞噬细胞清除率更低(参见Qie等人，科学报告，6，26269(2016)；以及Schwarz等人，ACS Nano，9，9134–47(2015))。

改进方法以降低不合需求的吞噬细胞清除率对于开发可植入器械和药物递送方式而言是有意义的，本文对此进行了探讨。

发明内容

本发明提供了有关工程化CD47细胞外结构域(ECD)蛋白的组合物和方法。所述CD47 ECD通过特定的氨基酸改变进行修饰，使其能与表面结合，其中所述CD47-ECD在所述表面上适当定向，且经修饰以与其反受体SIRPα衔接。出于CD47-ECD在降低吞噬细胞清除率方面的生物活性考虑，需要与SIRPα衔接。用于这些目的的修饰包括但不限于：(i)加入可切割的N端延伸，以产生焦谷氨酸酯N端；(ii)取代残基，以便在所述CD47-ECD与所述表面合乎需求的附接位点处引入非天然氨基酸(nnAA)。所述CD47-ECD可以利用无细胞蛋白合成(CFPS)产生。可以参考人CD47-ECD，但也使小鼠CD47-ECD发生了类似改变。

在一些实施例中，在所述ECD的所述N端提供可切割延伸，其中所述延伸的所述切割位点紧邻所述成熟CD47-ECD的所述N端谷氨酰胺。在切割所述延伸后，所述谷氨酰胺在所述N端暴露。在一些实施例中，所述暴露的谷氨酰胺通过谷氨酰胺酰环化酶转化为焦谷氨酸酯。在一些实施例中，所述延伸包含肠激酶识别位点(例如，DDDDK)，并被肠激酶切割。在一些实施例中，所述延伸包含因子Xa切割识别位点(例如，IEGR)，并被因子Xa切割。所述延伸任选地包含纯化标签，例如，组氨酸标签等，且可以包含位于所述标签与所述切割位点之间的短连接子。

在使所述CD47-ECD附接于表面合乎需求的位点处引入nnAA。用于引入所述nnAA的所述位点可以是天然存在的双键位点——C15和V116(相对于序列号：1的参考人CD47ECD)。为此目的选择非天然氨基酸，以提供用于点击化学或其他生物正交反应的反应物基团。nnAA可以包含，例如，炔烃或叠氮化物官能团，各自例如高丙炔基甘氨酸(HPG)或叠氮基高丙氨酸(AHA)。为方便起见，这通过整体甲硫氨酸置换来实现，但也可以使用其他nnAA引入方法。在通过甲硫氨酸置换引入所述nnAA的实施例中，所述编码序列中的所述C15和V116密码子都变为ATG。

在利用甲硫氨酸置换的实施例中，所述CD47-ECD也可以经改造，以置换位于不合需求的附接位点(即，M28和M82，相对于人参考蛋白的编号)处天然存在的甲硫氨酸。在一些实施例中，所述M28和M82被除甲硫氨酸以外的氨基酸取代。在一些实施例中，所述氨基酸取代为保守突变，例如，疏水性氨基酸，例如L、I、V、F等。在一些实施例中，所述特定氨基酸取代是M28V和M82L/I。

任选地，所述CD47-ECD经进一步改造，以提高蛋白溶解率。例如，可以用亲水残基置换所述天然蛋白中面向所述细胞膜的所述CD47 ECD表面上的疏水性残基。在一些实施例中，残基F14和V115用不带电的亲水性氨基酸置换。在一些实施例中，所述氨基酸取代是F14N和V115N中的一项或两项。

在实施例中，提供了工程化CD47-ECD，其相对于所述天然蛋白包含以下改变：(i)加入可切割的N端延伸，以产生焦谷氨酸酯N端；(ii)取代残基，以便在所述CD47-ECD与所述表面合乎需求的附接位点处引入非天然氨基酸(nnAA)。在一些实施例中，nnAA作为位置C15和V116引入。在一些实施例中，所述nnAA包含炔烃或叠氮化物官能团。在一些实施例中，所述工程化蛋白进一步包含改变(iii)：置换M28和M82处天然存在的甲硫氨酸。在一些实施例中，所述氨基酸取代为保守突变。在一些实施例中，所述工程化CD47-ECD进一步包含改变(iv)：置换所述面向膜的表面上的疏水性残基。在一些实施例中，残基F14和V115用不带电的亲水性氨基酸置换。

本发明提供了使用本文所述的工程化CD47-ECD来包覆制品表面的方法，所述制品通常是拟在内部使用或施用、将暴露于吞噬细胞的制品，例如，用于内部递送治疗剂的颗粒，例如纳米颗粒；微粒；插入物；可生物降解的缓释植入物；渗透泵；植入器械和假肢；等等。在一些实施例中，用CD47-ECD包覆可降低所述制品的吞噬细胞清除率。

包覆方法利用所述nnAA中的所述反应性基团，以在所述CD47-ECD与所述表面上提供的反应性基团之间提供键，例如共价键。所述表面反应物基团间隔阵列或成对形式的反应物。优选的反应物对间隔约5至约15埃、间隔约7至约13埃，并且可以间隔约10埃。或者，在提供多种反应物的所述表面上提供反应物阵列；或提供显示连接子上的所述反应性基团的阵列，这些连接子以不同间距固定于表面上，但可以自由地使所述反应性基团达到一定间距，以便实现所述两点连接。加入所述CD47-ECD后，未反应基团可能会被封端。

在一此类实施例中，所述CD47-ECD的位置15和116处的nnAA提供炔烃或叠氮化物官能团。所述表面提供适用于所述nnAA的所述反应物，即，叠氮化物-炔烃或炔烃-叠氮化物。连接通过铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(“点击”反应)实现。所述N端延伸切割以及谷氨酰胺向焦谷氨酸酯的转化可以在所述点击反应之前或之后进行。

在一些实施例中，所述制品是纳米颗粒。在一些实施例中，所述制品(包括但不限于纳米颗粒)包含提供用于连接所述CD47-ECD的所述反应物基团的蛋白。在一些实施例中，所述蛋白上的所述反应物基团是nnAA。在一些实施例中，所述纳米颗粒是病毒样颗粒，所述反应蛋白是病毒核心蛋白。在一些实施例中，所述蛋白是乙型肝炎核心蛋白。

在其他实施例中，提供了制品，所述制品包含所述表面上如本文所述的工程化CD47-ECD。制品包括，例如，用于内部递送治疗剂的颗粒，例如纳米颗粒；微粒；插入物；可生物降解的缓释植入物；渗透泵；植入器械和假肢；等等。在一些实施例中，相对于不含所述工程化CD47-ECD的制品，用CD47-ECD包覆可降低所述制品的吞噬细胞清除率。在此类实施例中，所述附接的工程化CD47-ECD的最佳数量和间距将通过本领域技术人员已知的实验确定。在一些实施例中，所述CD47-ECD与所述制品中存在的蛋白共价连接，包括但不限于病毒样颗粒中存在的蛋白。所述包覆制品可以纯化，并用药理学上可接受的溶媒配制以施用于患者。在一些实施例中，所述制品是与工程化CD47-ECD共价连接以用于配制的VLP。在一些实施例中，所述VLP包含用于递送的蛋白或药物。

所述工程化CD47-ECD可通过以下方式制备：生成编码所述工程化蛋白的核酸构建体，并通过无细胞合成形成所述多肽，所述合成可以包括偶联的转录和翻译反应。CFPS提供了在合成过程中引入nnAA的适宜方法，例如使用正交tRNA、整体甲硫氨酸置换等实现。本发明还提供了编码所述工程化蛋白的载体和多核苷酸。

附图说明

结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：

图1.CD47在与吞噬细胞上的SIRPα相互作用时发出“别吃我”生存信号。

图2.人CD47 ECD及其结合配偶体人SIRPα结构域1的结构。CD47 ECD的FG环区(氨基酸位置97-106，以粉色显示)和N端(NT)焦谷氨酸酯(以浅绿色显示)对于结合SIRPα至关重要。ECD通过其C端(CT)多肽和C15位置处的二硫键连接锚定于细胞表面。

图3：将N端延伸引入人CD47 ECD，以在酶促反应后暴露N端的焦谷氨酸。先用肠激酶消化融合蛋白以去除N端标签。然后，使用谷氨酰胺酰环化酶将暴露的N端谷氨酰胺转化为焦谷氨酸酯。

图4A-4C.将突变引入CD47 ECD以与VLP表面结合并提高产量。(图4A)通过整体甲硫氨酸置换将突变引入人CD47 ECD以便掺入nnAA的位点。(图4B)在CD47 ECD与HepBc二聚体之间建立双键以模拟CD47 ECD对细胞膜的自然锚定。(图4C)置换疏水性氨基酸以提高蛋白溶解率。为了避免这些位点发生nnAA掺入而进行置换的原始甲硫氨酸位置以绿色显示，适用于VLP附接的nnAA掺入位点以黄色显示。亲水性突变位点以蓝色显示。

图5：CD47 ECD氨基酸序列保守区。

图6A-6B：人CD47 ECD突变体的总无细胞蛋白累积水平和可溶性物质累积。(图6A)总产物和可溶性产物累积，以及(图6B)用甲硫氨酸、HPG或AHA表达的人CD47 ECD突变体的蛋白溶解率。WT C15G只有C15G突变。nnAA(L/I)突变体具有C15M、M28V、M82LorI和V116M。除nnAA(L/I)突变外，nnAA(L/I)NN突变体还具有F14N和V115N。在此表示法中，C15M和V116M是指将天然密码子改为ATG的编码区改变。

图7A-7B：在N端具有焦谷氨酸酯的人CD47 ECD的纯化和产生。(图7A)每个纯化步骤中人CD47 ECD nnAA(I)NN样本中的SDS-PAGE凝胶。泳道1：蛋白梯(标记12)，泳道2：CFPS和缓冲液交换后，泳道3：去除聚集体后，泳道4：Ni-NTA洗脱，泳道5：肠激酶反应后，泳道6：纯化的(1Q)hCD47 ECD nnAA(I)NN。(图7B)通过QC检测焦谷氨酸酯形成，如NADH消耗情况所示。GLDH＝谷氨酸脱氢酶；QC＝谷氨酰胺酰环化酶。

图8：人CD47 ECD与小鼠CD47 ECD突变体的比较。显示的是掺入甲硫氨酸而非nnAA时的氨基酸序列。

图9A-9B：小鼠CD47 ECD突变体的总无细胞蛋白累积和可溶性蛋白累积。(图9A)无细胞蛋白表达水平和(图9B)小鼠CD47 ECD nnAA(I)的蛋白溶解率。

图10A-10C：小鼠CD47 ECD与HepBc VLP的连接。(图10A)小鼠CD47(mCD47)ECD附接和解组装的VLP的还原SDS-PAGE和放射自显影图。(只有HepBc蛋白具有放射性。)(图10B)附接于VLP表面的mCD47 ECD数量。(图10C)HepBc二聚体上的表面附接位点。(为清楚起见，仅标明其中一种单体中的位点。分子后侧的位点在括号中标出。)79nnAA和80nnAA是指在其表面刺突尖端的这些位点处掺入nnAA的VLP。

图11：负载有BDFL的VLP的RAW 264.7细胞内化的荧光图像。HepBc VLP中的BDFL染料以绿色显示，而细胞核以品红色显示。通过BDFL荧光(中间图像)检测RAW 264.7细胞对负载有BDFL的VLP的吸收量。与此相比，小鼠CD47 ECD官能化BDFL-VLP的吸收量显著减少(右图)。

具体实施方式

本发明提供了有关工程化CD47细胞外结构域(ECD)蛋白的组合物和方法。所述CD47 ECD通过特定的氨基酸改变进行修饰，使其能与表面结合，其中所述CD47-ECD在所述表面上适当定向，且经修饰以与其反受体SIRPα衔接。出于CD47-ECD在降低吞噬细胞清除率方面的生物活性考虑，需要与SIRPα衔接。用于这些目的的修饰包括但不限于：(i)加入可切割的N端延伸，以产生焦谷氨酸酯N端；(ii)取代残基，以便在所述CD47-ECD与所述表面合乎需求的附接位点处引入非天然氨基酸(nnAA)。

在一些实施例中，提供了工程化蛋白或包含本文所揭示的工程化蛋白的制品的用途，例如用于药物生产中。在实施例中，提供了工程化蛋白或包含本文所揭示的工程化蛋白的制品用于将所述制品中的药剂递送至组织的用途。

CD47是一种50kDa跨膜受体，具有细胞外N端IgV结构域、五个跨膜结构域和短的C端胞内尾区。CD47有四种可变剪接同种型，区别仅在于其胞质尾区的长度。它与信号调节蛋白α(SIRPα)结合。CD47/SIRPα相互作用引发双向信号传导，促使发生不同的细胞间反应(包括抑制吞噬作用、刺激细胞间融合和T细胞活化)，并以“别吃我”信号形式表现出对免疫系统吞噬细胞的活性。例如，缺少CD47的红细胞会被巨噬细胞从血流中快速清除，这一过程由CD47和SIRPα的相互作用调节。

人和小鼠CD47的序列是可供大众取阅，例如Genbank的人蛋白参考序列是NP_034711.1，小鼠参考蛋白序列是NP_001768.1。为方便起见，本文中氨基酸残基的编号可参考序列号：1(人CD47-ECD)

QLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS

和序列号：2(小鼠CD47-ECD)

QLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTS

出于生理相关目的，SIRPα和CD47结合通常是SIRPα吞噬细胞及其前体(例如巨噬细胞和单核细胞)上的SIRPα与可以作为吞噬作用靶标的制品(尤其是颗粒制品，例如纳米颗粒、微粒等)上的CD47之间发生的事件。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指由氨基酸残基构成的聚合物。该术语还适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物、天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸、合成的氨基酸以及作用方式与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由基因密码编码的氨基酸以及后续经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的常规化学结构但作用方式与天然存在的氨基酸类似的化合物。

本文所揭示的工程化多肽可以在预定位点包含至少一个非天然氨基酸，并且可以包含或含有1、2、3、4、5或更多个非天然氨基酸。如果存在于多肽的两个或更多个位点，则所述非天然氨基酸可以是相同的，也可以是不同的。在所述非天然氨基酸不同的情况下，每种非天然氨基酸都存在正交tRNA和同源tRNA合成酶。在一些实施例中，单一非天然氨基酸存在于残基80处。

可使用的非天然氨基酸的示例包括：酪氨酸(氨基酸)的非天然类似物；谷氨酰胺(氨基酸)的非天然类似物；苯基丙氨酸(氨基酸)的非天然类似物；甲硫氨酸(氨基酸)的非天然类似物；苏氨酸(氨基酸)的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼酸酯、磷酸基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸或其任何组合；具有可光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；具有新颖官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含有金属的氨基酸；放射性氨基酸；光笼蔽和/或可光异构化氨基酸；含有生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含有酮基的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基酸；具有延长侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如，糖取代的丝氨酸等；碳键联的含有糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含有α-羟基的酸；含有氨基硫代酸的氨基酸；α,α二取代的氨基酸；β-氨基酸；以及除脯氨酸以外的环状氨基酸等。

目的非天然氨基酸包括但不限于为点击化学反应提供反应物基团的氨基酸(参见点击化学：来自几个良好反应的不同化学功能，Hartmuth C.Kolb，M.G.Finn，K.BarrySharpless，应用化学国际版，第40卷，2001，第2004页，其明确以引用方式并入本文中)。例如，受人关注的是氨基酸叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、p-乙酰基-L-苯基丙氨酸和p-叠氮基-L-苯基丙氨酸。

在一些实施例中，所述非天然氨基酸通过蛋白上甲硫氨酸的整体置换引入，例如，甲硫氨酸可从无细胞反应混合物中除去，并被0.25–2.5mM叠氮基高丙氨酸(AHA)取代。在此类实施例中，优选取代具有不同氨基酸的天然甲硫氨酸，而ATG密码子在适合非天然氨基酸引入的合乎需求的位点被引入编码序列中。

或者，所述非天然氨基酸通过正交组分引入。正交组分包括用非天然氨基酸氨酰化的tRNA，其中所述正交tRNA碱基对具有通常与氨基酸无关的密码子，例如，终止密码子；4bp密码子等。反应混合物可以进一步包含能够氨酰化(用非天然氨基酸实现)同源正交tRNA的tRNA合成酶。此类组分是本领域已知的组分，例如，如于2006年5月16日发布的第7,045,337号美国专利所述。所述正交tRNA能识别选择密码子，其可以是无义密码子，例如终止密码子，例如，琥珀、赭石和蛋白石密码子；四碱基或更多碱基密码子；源自天然或非天然碱基对的密码子等。所述正交tRNA反密码子环能识别mRNA上的选择密码子，并在多肽的该位点上插入非天然氨基酸。

正交tRNA合成酶可进行外源性合成、纯化并加入到本发明的反应混合物中，通常以至少约10μg/ml、至少约20μg/ml、至少约30μg/ml且不超过约200μg/ml的限定量添加。所述蛋白可以在细菌或真核细胞中合成，并通过诸如本领域已知的亲和色谱分析、PAGE、凝胶排阻色谱分析、反相色谱分析等纯化。

术语“缀合配偶体”是指与所述工程化CD47-ECD缀合的任何部分，例如，肽或蛋白、核酸、多糖、标记等。所述缀合配偶体可以存在于制品的表面上，也可以形成制品的表面。所述缀合配偶体可以包含用于点击化学缀合的互补活性基团，例如，所述缀合配偶体可以用一种或更多种非天然氨基酸合成，这使其能与存在于所述CD47-ECD蛋白上的非天然氨基酸缀合。本领域技术人员应当理解，用于缀合的化学组成是所熟知的，并且可轻易地应用于多种基团，例如，CpG DNA序列、可检测标记、抗原、多肽等。

在一些实施例中，所述缀合配偶体是结构蛋白，例如，胶原蛋白、角蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、弹性蛋白、原纤蛋白、核纤层蛋白等。在一些实施例中，所述缀合配偶体是病毒样颗粒蛋白，包括但不限于乙型肝炎核心蛋白HBc。在一些实施例中，所述缀合配偶体是已经修饰以提供反应性基团的聚合物，例如，PEG等。

术语“HBc”是指乙型肝炎核心蛋白的氨基酸肽序列，或指其截短形式，或指类似蛋白，例如，用一个或更多个二硫键修饰的蛋白；经修饰以提供用于引入非天然氨基酸的位点的蛋白，包含尖端修饰等，如第9,896,483号美国专利所述，此专利明确以引用方式并入本文中。在一些实施例中，HBc是工程化CD47-ECD的缀合配偶体。

可在合成时或表达时向肽中引入各种基团，使其可以与分子(例如CD47-ECD)或表面连接。此外，此类表面如经修饰可显示反应性物种，则可以通过以下方式进行修饰：先将制品(例如VLP)与所述表面连接，然后将工程化CD47-ECD与所述制品连接。例如，所述表面可以先显示炔烃，以便连接显示叠氮化物的VLP，然后连接显示炔烃的工程化CD47-ECD。所述引入的基团无需包括在HBc结构域本身中，但可以作为标签或融合C端或N端引入所述HBc结构域中。因此，可使用半胱氨酸制备硫醚，通过多聚组氨酸连接金属离子络合物，通过羧基形成酰胺或酯，通过氨基形成酰胺等。可以包括在起始甲酰-甲硫氨酸之后插入3个氨基酸(ASV)，以通过甲硫氨酰氨肽酶去除翻译起始非天然甲硫氨酸类似物，避免在不合乎需求的位置发生表面缀合。

在一些实施例中，在蛋白中的一个或更多个限定位点处包括非天然氨基酸。本发明的HBc多肽可以包括用于控制与缀合配偶体CD47-ECD的直接连接的非天然氨基酸。所述缀合配偶体上的nnAA不同于所述HBc多肽上存在的nnAA，并且两者发生反应。

本领域技术人员应当理解，可以在所述序列中进行微小的氨基酸改变而不改变所述蛋白的功能，例如，改变1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少约10个氨基酸，并且全长蛋白可以取代本文例举的截短形式。HBc在功能上能够自组装以形成二十面体病毒样颗粒。本发明的HBc多肽还可以包含货物负载域。

本文中使用的术语“病毒样颗粒”是指一种或更多种病毒蛋白(通常是病毒外壳蛋白)的稳定大分子组装。VLP中的独立蛋白链数量通常为至少约60个蛋白、约80个蛋白、至少约120个蛋白或更多，这取决于特定病毒几何结构。在本发明的方法中，所述VLP包含与工程化CD47-ECD缀合的HBc。本发明的方法可在不存在病毒多核苷酸基因组的情况下合成外壳蛋白，因此所述衣壳可以是空的，或含有非病毒组分，例如，mRNA片段、药物货物等。

在生理条件下，稳定VLP衣壳结构中的蛋白长时间保持结合状态，例如持续至少约24小时、至少约1周、至少约1个月或更长时间。组装后，所述VLP可具有与天然病毒颗粒相当的稳定性，例如，在暴露于pH值变化、高温、冷冻、离子变化等条件下时。本领域已知的VLP的其他组分可包括在所述VLP内或布置在所述VLP上。VLP不含有完整的病毒核酸，并且它们不具传染性。在一些实施例中，所述VLP表面上有足够的病毒表面包膜糖蛋白和/或佐剂分子，这使得VLP制剂被配制成免疫原性组合物并施用于动物或人时，产生免疫应答(细胞介导或由体液引起)。

本文中使用的术语“纯化的”和“分离的”在多肽背景下使用时，是指基本上不含来自获取它的物质(例如，细胞物质)的污染物质，例如但不限于细胞碎片、细胞壁物质、膜、细胞器、大部分核酸、碳水化合物、蛋白质和/或细胞中存在的脂质。因此，分离的多肽包括细胞物质和/或污染物质少于约30％、20％、10％、5％、2％或1％(按干重计)的多肽的制剂。本文中使用的术语“纯化的”和“分离的”在化学合成的多肽背景下使用时，是指基本上不含参与多肽合成的化学品前体或其他化学品的多肽。

还可根据重组合成的常规方法或无细胞蛋白合成方法对所述多肽进行分离和纯化。目的分离程序包括亲和色谱分析。亲和色谱分析利用通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，分离分子结合特定配体的能力。共价键以明显地将配体呈递给蛋白样本的方式将配体连接到不溶性多孔载体介质上，从而使用一种分子物质的天然生物特异性结合从混合物中分离和纯化第二种物质。抗体通常用于亲和色谱分析。优选地，将微球或基质用作亲和色谱分析的支持物。此类支持物是本领域已知的且可购得的，包括可与连接子分子结合的活化支持物。例如，基于琼脂糖或聚丙烯酰胺的Affi-Gel支持物是适合于用蠕动泵或重力流动洗脱进行的多数实验室规模纯化的低压凝胶。基于压力稳定型大孔径聚合物的Affi-Prep支持物适合制备和工艺规模的应用。

还可以使用本领域已知的方法通过离子交换色谱分析和/或浓缩、过滤、透析等来分离蛋白。本发明的方法提供了含有非天然氨基酸的蛋白，其生物学活性与天然蛋白相当。人们可通过以下方式确定组合物中的蛋白比活：在功能测定中，确定活性水平；在非功能测定(例如，免疫染色、ELISA、在考马斯亮蓝或银染凝胶上进行定量分析等)中量化存在的蛋白的量，同时确定生物学活性蛋白占总蛋白的比例。通常情况下，由此定义的比活是天然蛋白的至少约5％，通常是天然蛋白的至少约10％，并且可以是约25％、约50％、约90％或更高。

本发明提供了示例性编码序列，但本领域技术人员可基于所提供的氨基酸序列轻易地设计合适的编码序列。本领域技术人员所熟知的方法可用于构建含有编码序列和适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。或者，可以化学合成能够编码目的多肽的RNA。本领域技术人员可以轻易地利用所熟知的密码子使用表和合成方法来为本发明的多肽中的任一种提供合适的编码序列。所述核酸可以基本纯度分离和获取。通常，获取的所述核酸，无论是DNA还是RNA形式，基本上不含其他天然存在的核酸序列，其纯度一般至少约为50％，通常至少约为90％，并且通常是“重组的”，例如，侧面具有一个或更多个核苷酸，在自然存在的染色体上通常不具关联性。本发明的核酸可作为线性分子或在环状分子内提供，并且可在自主复制分子(载体)内或在无复制序列的分子内提供。所述核酸的表达可通过它们自己或本领域已知的其他调节序列来调节。可采用本领域可用的多种技术将本发明的核酸引入合适的宿主细胞中。

本文中使用的术语“诊断”是指对分子或病理状态、疾病或病症的鉴定。本文中使用的术语“预后”是指预测癌症归因性死亡或进展的可能性，所述进展包括复发、转移性扩散和耐药性。本文中使用的术语“预测”是指基于观察、经验或科学推理的预言或估计行为。在一示例中，医师可能会在治疗后尝试预测患者存活的可能性。

本文中使用的术语“疗法”、“治疗”等是指为了获得效果而施用药剂或施行手术。预防作用指的是对疾病或其症状的完全或部分预防，治疗作用指的是疾病和/或疾病导致的症状实现部分或完全治愈。

治疗指治疗或改善或预防疾病成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，例如症状的消除；缓解；减轻或使疾病状况对患者更耐受；减缓退化或衰退率；或减少退化晚期的衰弱。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括医生的检查结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或药剂以预防或延迟、缓解、阻止或抑制与癌症或其他疾病相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”是指疾病的减少、消除或预防疾病症状或疾病在受试者中的副作用。

在某些实施例中，“联合”、“联合治疗”和“联合产品”是指在患者中同时施用第一治疗剂和本文所用化合物。当组合施用时，每种组分可以在不同时间点以任何顺序同时施用或按顺序施用。因此，每种组分可以分开施用，但施用时间须足够接近，以达到预期的治疗效果。

物质的“有效量”或“足够量”是指足以引起所需生物学效应的量，例如有益结果，包括临床结果，因此，“有效量”取决于应用其的背景。有效量可以在一次或更多次施用中施与。例如，颗粒中工程化CD47-ECD的有效量或密度可以是相对于缺乏CD47-ECD的颗粒，使吞噬细胞清除率降低至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％或更多的量或密度。

货物。所述VLP可以封装货物，例如，在VLP位于细胞内时被释放的分子。封装货物在所述VLP内受到保护，且通常不会在所述VLP表面展示。稳定负载的货物在洗涤后保留在VLP内。

许多分子都适合作为货物，包括但不限于RNA，例如导向RNA、siRNA、反义RNA等；DNA，例如双链或单链DNA，包括但不限于质粒、编码序列等；蛋白，例如毒素蛋白，包括，例如，白喉毒素A链、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻风树毒蛋白、巴豆素、酚霉素、伊诺霉素、澳瑞他汀-E等；基因修饰蛋白，包括但不限于CRISPR；结合蛋白，例如抗体或其衍生的片段等。细胞毒性药剂多种多样。一类示例性细胞毒性药剂是化疗药剂。示例性化疗药剂包括但不限于阿地白介素、六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、博来霉素、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、克拉屈滨、西沙必利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素、多西他赛、多柔比星、屈大麻酚、杜卡霉素、阿法依泊汀、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、亚叶酸、甲地孕酮、美司钠、甲氨蝶呤、美登素、胃复安、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇、毛果芸香碱、丙氯拉嗪、利妥昔单抗、皂草素、他莫昔芬、他克唑、盐酸托泊替康、曲妥珠单抗、长春碱、长春新碱、酒石酸长春瑞滨等。

在一些实施例中，货物经修饰以增强VLP的包封，例如通过添加游离巯基基团以与HBc蛋白缀合实现。或者，可以选择包含游离巯基基团的货物药剂，例如美登素。极性货物，例如核酸(例如ssDNA、RNA等)，可以与疏水性基团(例如胆固醇)缀合，以增强负载。或者，可将一种或更多种极性或带电荷的氨基酸与货物缀合。

本文中使用的无细胞蛋白合成是指在包含生物学提取物和/或确定试剂的反应混合物中无细胞合成多肽。所述反应混合物包含用于产生大分子的模板，例如，DNA、mRNA等；用于大分子合成的单体，例如，氨基酸、核苷酸等，以及此类辅因子、酶和其他合成所必需的试剂，例如，核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。此类合成反应体系为本领域所熟知且在文献中已有记载。可以分批、连续流或半连续流等本领域所知形式进行无细胞合成。

所述CFPS和其他后续步骤可以在还原条件下进行，例如，在存在1mM DTT或等效物的情况下。在VLP组装之后，所述条件可能会变为氧化环境，例如，任选地在盐(例如，至多约1M盐、至多约1.5M盐、至多约2.5M盐，例如，NaCl等)存在的情况下，通过透析去除还原剂，然后加入5-10mM H₂O₂、5-20mM二酰胺或等效物氧化形成二硫键。

在本发明的一些实施例中，无细胞合成在氧化磷酸化激活的反应中进行，例如，CYTOMIM^TM系统。呼吸链和氧化磷酸化激活的证据是在O₂存在的情况下，多肽合成增加。在氧化磷酸化激活的反应中，与O₂存在时相比，当存在特异性电子传递链抑制剂(例如HQNO)或缺少O₂时，总多肽合成量至少降低约40％。反应化学详情请见国际专利申请WO 2004/016778，此申请以引用方式并入本文中。

用于合成的CYTOMIM^TM环境使用在含有葡萄糖和磷酸盐的培养基中生长的细菌细胞的提取物，其中所述葡萄糖的起始浓度至少约为0.25％(重量/体积)，更常用的是至少约为1％；常用的是不超过约4％，更常用的是不超过约2％。此类培养基的示例是2YTPG培养基，但是本领域技术人员应当理解，许多培养基经改造均可用于此目的，其中许多公开培养基适用于细菌(例如大肠杆菌)的生长，其中使用明确的和未明确的营养物来源(参见Sambrook,J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港大学出版社，纽约冷泉港，例如，含有葡萄糖的培养基)。或者，可以根据实验方案使培养物生长，在所述实验方案中，葡萄糖根据需要连续添加于成分明确或复合的生长培养基中，以保持高生长速率。可以在反应混合物中加入小泡作为补充，例如，加入内膜小泡溶液。所提供的此类小泡可占约0至约0.5的体积，通常占约0.1至约0.4的体积。

在一些实施例中，存在不超过痕量的PEG，例如少于0.1％，并且可以少于0.01％。基本不含PEG的反应含有极少量PEG，例如，PEG不抑制氧化磷酸化。亚精胺和腐胺分子可用于替代PEG。精胺或亚精胺的浓度为至少约0.5mM，通常至少约1mM，优选约1.5mM且不超过约2.5mM。腐胺的浓度为至少约0.5mM，优选至少约1mM，优选约1.5mM且不超过约2.5mM。亚精胺和/或腐胺可存在于初始细胞提取物中或另行加入。

反应混合物中的镁浓度影响总体合成。细胞提取物中通常存在镁，可再加入镁优化浓度。此类方法中所用镁盐的来源为本领域所熟知。在本发明的一实施例中，镁的来源是谷氨酸镁。优选的镁浓度为至少约5mM，通常至少约10mM，优选至少约12mM；并且浓度不超过约25mM，通常不超过约20mM。其他可提高合成或降低成本的变化包括省略反应混合物中的HEPES缓冲液和磷酸烯醇丙酮酸。

所述系统可在好氧和厌氧条件下运行。尤其当反应大于15μl时可提供氧气，以增加合成产量。反应室顶部空间可填充氧气；氧气可注入反应混合物中；等等。氧气可持续供给，或在更长反应时间进行蛋白表达的过程中在反应室顶部空间补充氧气。也可在制备细胞提取物中使用其他电子受体，例如硝酸盐、硫酸盐或延胡索酸盐，以使细胞提取物中所需酶具有活性。

无需加入外源性辅因子来激活氧化磷酸化。可使用化合物(例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、NAD⁺或乙酰辅酶A)增加蛋白合成产量，但这并非必须。加入草酸、磷酸烯醇丙酮酸合成酶(Pps)代谢抑制剂，可有利于增加蛋白产量，但这并非必须。

无细胞蛋白合成的模板可为mRNA或DNA，优选使用连续用具有可识别启动子的DNA模板生成mRNA的联合体系。可在反应混合物中直接加入内源性RNA聚合酶或外源性噬菌体RNA聚合酶，通常为T7或SP6。或者，可通过在QB复制酶(一种RNA依赖性RNA聚合酶)模板中插入消息以持续扩增mRNA。通常在加入反应混合物前利用化学修饰稳定纯化的mRNA。可从提取物中去除核酸酶以稳定mRNA水平。所述模板可编码任何目的特定基因。

可加入其他盐，尤其是生物学相关的盐，例如锰盐。钾的浓度通常为至少约50mM，且不超过约250mM。铵的浓度通常不超过200mM，更通常不超过100mM。通常，所述反应的条件保持在约pH 5-10，温度约20℃-50℃的范围内；更通常，保持在约pH 6-9，温度约25℃-40℃的范围内。这些范围可根据目的具体条件延伸。

可在反应混合物中加入针对不良酶活性的代谢抑制剂。或者，可直接从提取物中移除引起不良活性的酶或因子，或者可使编码不良酶活性的基因失活或从染色体中删除。

本文中使用的术语“受试者”或“患者”可互换使用，是指动物(例如，鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩和人类)。在某些实施例中，受试者是非人动物。在一些实施例中，受试者是家畜或宠物。在另一实施例中，受试者是人类，例如，人类婴儿(包括早产儿)、儿童、成人和/或老人。

本文中的“融合”或“可操作地连接”是指两个或更多个多肽连接在一起形成连续的多肽链。融合多肽(或编码所述融合多肽的融合多核苷酸)也可以进一步包含其他组分，包括多个环上的多个肽、融合配偶体等。进行所述融合的精确位点不是至关重要的；特定位点是众所周知的，并且可以进行选择以优化所述结合配偶体的生物活性、分泌或结合特性。最佳位点将通过例行实验来确定。

本文中使用的术语“关联”或“与之关联”以及类似术语是指两个事件之间的统计关联，事件包括数字、数据集等。例如，当事件涉及数字时，正相关(在本文中也称为“直接相关”)意味着随着一个事件增加，另一个事件也增加。负相关(在本文中也称为“逆相关”)意味着随着一个事件增加，另一个事件减少。

“剂量单位”是指适合特定待治疗个体的单一剂量的物理离散单位。每个单位含有预定量的活性化合物，所述活性化合物经计算以产生与所需药物载体相关的治疗效果。剂量单位形式的规格受(a)活性化合物的特征和待实现的治疗效果，以及(b)本领域这种复合活性化合物的局限性影响。

“药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备安全、无毒、预期的药物组合物的赋形剂，包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。这种赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下为气态。

“药学上可接受的盐和酯”是指药学上可接受并具有所需药理学性质的盐和酯。这些盐包括在化合物中存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应的条件下形成的盐。合适的无机盐包括用碱金属形成的无机盐，例如钠、钾、镁、钙、铝。合适的有机盐包括由有机碱形成的盐，所述有机碱如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。此类盐还包括用无机酸(例如盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃和芳烃磺酸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由化合物中存在的羧基、磺酰氧基和磷酸氧基形成的酯，例如C_1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或二盐或酯；类似地，当存在两个以上酸性基团时，可以盐化或酯化一些或全部的这些基团。本发明中的化合物可以以未盐化或未酯化的形式或以盐化和/或酯化的形式存在，化合物的命名旨在包括原始(未酯化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。此外，本发明中某些化合物可以以多种立体异构形式存在，这些化合物的命名旨在包括所有单一立体异构体和这种立体异构体的所有混合物(包括外消旋或其他形式)。

术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体是指组合物、载体、稀释剂和试剂可互换使用，这些材料可以施用于人，且不产生阻止组合物施用的不良生理效应。

蛋白

工程化CD47细胞外结构域(ECD)蛋白(例如人CD47 ECD蛋白)通过特定的氨基酸改变进行修饰，使其能与表面结合，其中所述CD47-ECD在所述表面上适当定向，且经修饰以与其反受体SIRPα衔接。此类修饰包括但不限于：(i)加入可切割的N端延伸，以产生焦谷氨酸酯N端；(ii)取代残基，以便在所述CD47-ECD与所述表面合乎需求的附接位点处引入非天然氨基酸(nnAA)。在某些实施例中，所述CD47 ECD包含序列号：3、5、7、9、11或13中任一项的序列，或与序列号：3、5、7、9、11或13中任一项基本类似的序列，例如，序列同一性大于99％、序列同一性大于95％、序列同一性大于90％。

在所述ECD的所述N端提供可切割延伸，其中所述延伸中的特定切割识别位点紧邻所述成熟CD47-ECD的所述N端谷氨酰胺。在切割所述延伸后，所述谷氨酰胺在所述N端暴露。所述暴露的谷氨酰胺被转化为焦谷氨酸酯，例如在谷氨酰胺酰环化酶的作用下。所述延伸可以是任意长度，前提是包括特定切割识别位点，通常是至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或更多个残基，并且根据所需功能，其可以明显更长。为方便起见，所述延伸的长度将不超过约50个残基、不超过40个残基、不超过30个残基、不超过20个残基。所述切割识别位点可以是肠激酶识别位点，例如DDDDK，对于因子Xa切割，例如IEGR等，其中所述同源酶用于切割不含CD47-ECD的所述延伸。

延伸任选地包含用于纯化或其他目的的蛋白标签。所述标签可以针对纯化提供。许多此类标签是本领域已知并使用的，包括，例如，组氨酸标签、聚谷氨酸酯标签、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、E标签、FLAG标签、S标签、SBP标签、Strep标签、钙调素标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等。所述标签可以是表位标签，例如V5标签、Myc标签、HA标签、Spot标签、NE标签、Strep标签、TC标签、Ty标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签等。AviTag通过BirA酶实现生物素化。

在使所述CD47-ECD附接于表面合乎需求的位点处引入nnAA。用于引入所述nnAA的所述位点可以是天然存在的双键位点——C15和V116(相对于序列号：1的参考人CD47ECD)。为此目的选择非天然氨基酸，以提供用于点击化学或其他生物正交反应的反应物基团。nnAA可以包含，例如，炔烃或叠氮化物官能团，各自例如高丙炔基甘氨酸(HPG)或叠氮基高丙氨酸(AHA)。为方便起见，这通过整体甲硫氨酸置换来实现，但也可以使用正交nnAA引入方法。在通过甲硫氨酸置换引入所述nnAA的实施例中，所述氨基酸置换可以是C15nnAA和V116nnAA。

在利用甲硫氨酸置换的实施例中，所述CD47-ECD也可以经改造，以置换位于不合需求的附接位点(即，M28和M82，相对于人参考蛋白的编号)处天然存在的甲硫氨酸。在一些实施例中，所述M28和M82被除甲硫氨酸以外的氨基酸取代。在一些实施例中，所述氨基酸取代为保守突变，例如，疏水性氨基酸，例如L、I、V、F等。在一些实施例中，所述特定氨基酸取代是M28V和M82L/I。

任选地，所述CD47-ECD经进一步改造，以提高蛋白溶解率。例如，可以用亲水残基置换所述天然蛋白中面向所述细胞膜的所述CD47 ECD表面上的疏水性残基。在一些实施例中，残基F14和V115用不带电的亲水性氨基酸置换。在一些实施例中，所述氨基酸取代是F14N和V115N中的一项或两项。

本发明还提供了小鼠CD47-ECD，其中，例如，残基M36、M82、M88处的天然存在的甲硫氨酸用保守取代置换。本发明提供了可切割的延伸。nnAA在C15和V116处引入。

所述工程化CD47-ECD可通过以下方式制备：生成编码所述工程化蛋白的核酸构建体，并通过无细胞合成形成所述多肽，所述合成可以包括偶联的转录和翻译反应。CFPS提供了在合成过程中引入nnAA的适宜方法，例如使用正交tRNA、整体甲硫氨酸置换等实现。本发明还提供了编码所述工程化蛋白的载体和多核苷酸。

如有需要，可在合成时或表达时向肽中引入各种基团，使其可以与其他分子或表面连接。因此，可使用半胱氨酸制备硫醚，通过组氨酸连接金属离子络合物，通过羧基形成酰胺或酯，通过氨基形成酰胺等。在一些实施例中，在所述蛋白中的一个或更多个限定位点处(尤其是在所述VLP上突出表面的刺突尖端处)包括非天然氨基酸，使其具有可用空间位。

本发明进一步提供了编码所述多肽的核酸。本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，可以制备出数量极多的核酸，所有这些核酸都编码本发明的融合蛋白。因此，在鉴定特定氨基酸序列后，本领域技术人员可以不改变所述蛋白的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或更多个密码子序列，以制备任意数量的不同核酸。

使用本发明的编码蛋白的核酸，可以制备出多种表达构建体。所述表达构建体既可以是自我复制的染色体外载体，也可以是整合到宿主基因组中的载体。或者，就无细胞表达而言，所述构建体可以包括所需多肽转录和翻译所必需的元素，但可能不包括诸如复制起点、选择性标记等元素。无细胞构建体可以诸如通过PCR在体外复制，并且可以包含针对扩增反应而优化的末端序列。

通常情况下，表达构建体包括与编码融合蛋白的核酸可操作地连接的转录和翻译调节核酸。术语“控制序列”是指在特定表达系统(例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、无细胞合成等)中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物系统的控制序列，例如，包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。真核细胞系统可以利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

当与另一核酸序列处于功能关系时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地与编码序列连接；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译的启动，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。连接是通过连接反应或通过扩增反应完成的。合成的寡核苷酸适配子或连接子可用于根据常规实践连接序列。

通常，所述转录和翻译调节序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。在一优选实施例中，所述调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。

启动子序列编码组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然存在的启动子或杂合启动子。结合由超过一种启动子组成的元素的杂合启动子也为本领域所熟知，并且可用于本发明中。在一优选实施例中，所述启动子是强启动子，允许在体外表达系统中实现高表达，例如T7启动子。

此外，所述表达构建体可以包含附加元素。例如，所述表达载体可以具有一个或两个复制系统，从而使其在生物体中得以维持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中表达以及在原核宿主中克隆和扩增。此外，所述表达构建体可以含有选择性标记基因，以便选择转化的宿主细胞。选择基因为本领域所熟知，并随所用的宿主细胞的不同而变化。

制剂和用途

本发明提供了使用工程化CD47-ECD以与制品表面共价连接的方法，所述制品通常是拟在内部使用或施用、将暴露于吞噬细胞的制品，例如，用于内部递送治疗剂的颗粒，例如纳米颗粒；微粒；插入物；可生物降解的缓释植入物；渗透泵；植入器械和假肢；等等。在一些实施例中，用CD47-ECD包覆可降低所述制品的吞噬细胞清除率。

包覆方法利用所述nnAA中的所述反应性基团，以在所述CD47-ECD与所述表面上提供的反应性基团之间提供键，例如共价键。所述表面反应物基团间隔阵列或成对形式的反应物。优选的反应物对间隔约5至约15埃、间隔约7至约13埃，并且可以间隔约10埃。或者，在提供多种反应物的所述表面上提供反应物阵列；或提供显示连接子上的所述反应性基团的阵列，这些连接子以不同间距固定于表面上，但可以自由地使所述反应性基团达到一定间距，以便实现所述两点连接。加入所述CD47-ECD后，未反应基团可能会被封端。

在一此类实施例中，所述CD47-ECD的位置15和116处的nnAA提供炔烃或叠氮化物官能团。所述表面提供适用于所述nnAA的所述反应物，即，叠氮化物-炔烃或炔烃-叠氮化物。连接通过铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(“点击”反应)实现。所述N端延伸切割以及谷氨酰胺向焦谷氨酸酯的转化可以在所述点击反应之前或之后进行。

在一些实施例中，所述制品是纳米颗粒。在一些实施例中，所述制品(包括但不限于纳米颗粒)包含提供用于连接所述CD47-ECD的所述反应物基团的蛋白。在一些实施例中，所述蛋白上的所述反应物基团是nnAA。在一些实施例中，所述纳米颗粒是病毒样颗粒，所述反应蛋白是病毒核心蛋白。在一些实施例中，所述蛋白是乙型肝炎核心蛋白。

在其他实施例中，提供了制品，所述制品包含所述表面上如本文所述的工程化CD47-ECD。制品包括，例如，用于内部递送治疗剂的颗粒，例如纳米颗粒；微粒；插入物；可生物降解的缓释植入物；渗透泵；植入器械和假肢；等等。在一些实施例中，相对于不含所述工程化CD47-ECD的制品，用CD47-ECD包覆可降低所述制品的吞噬细胞清除率。在一些实施例中，所述CD47-ECD与所述制品中存在的蛋白共价连接，包括但不限于病毒样颗粒中存在的蛋白。所述包覆制品可以纯化，并用药理学上可接受的溶媒配制以施用于患者。在一些实施例中，所述制品是与工程化CD47-ECD共价连接以用于配制的VLP。在一些实施例中，所述VLP包含用于递送的蛋白或药物。

本发明的组合物可以配制成适合缀合的CD47-ECD(例如，试剂盒形式)，以与合乎需求的表面反应。本发明还提供了包含工程化CD47-ECD的制品(例如纳米颗粒等)制剂。此类制剂可以用作治疗剂或预防剂，例如，作为药物递送溶媒。可通过细胞培养或实验动物中诸如用于确定LD₅₀(50％群体致死的剂量)和ED₅₀(50％群体中治疗有效的剂量)的标准制药程序来确定此类化合物的毒性和疗效。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，其可表述为LD₅₀/ED₅₀比率。优选表现出大治疗指数的化合物。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于明确人用剂量范围。此类化合物的剂量优选在循环浓度范围内，所述范围包括毒性很小或无毒性的ED₅₀。所述剂量可以在此范围内根据所用剂型和给药途径而变化。对于用于本发明的方法中的任何化合物，所述治疗有效剂量可以通过细胞培养测定初步估计。

对于上述所有此类治疗，确切的制剂、给药途径和剂量可由个体医师根据患者的病状进行选择。(参见，例如，Fingl等人，1975，“治疗学的药理学基础”)。应当注意的是，主治医师将知晓在毒性或器官功能障碍作用下如何以及何时终止、中断或调整给药。相反，如果临床反应不厉害(排除毒性)，主治医师也将知晓将治疗调整至更高程度。在相关病毒感染治疗中，给药剂量的数量级将根据待治疗病状的严重程度和给药途径而变化。剂量也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。与上面讨论的程序可比的程序可用于兽药中。

可根据药物制剂的常规方法加工药理学活性化合物，以产生适合施用于患者(例如，哺乳动物，包括人类)的药剂。

通常情况下，本发明的组合物还优选地包含药学上可接受的赋形剂，并且可以采用多种剂型。如本领域所熟知，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其稳定且有助于药理学有效物质的施用。例如，赋形剂可促使具有一定形状或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于得到不同渗透压的盐、包封剂、缓冲液和皮肤渗透增强剂。适用于胃肠外和非胃肠外给药的赋形剂和制剂请见《雷氏药学大全》第19版，Mack Publishing(1995年)。

通常情况下，这些组合物被配制用于注射或吸入给药，例如，腹膜内、静脉内、皮下、皮内、肌肉内给药等。因此，这些组合物可以与药学上可接受的溶媒(例如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液等)组合。特定给药方案(即剂量、给药时间和重复数)取决于特定个体以及该个体的病史。

应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属、构建体以及试剂，因为在实际实施中可能会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法、设备和材料可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了首选的方法、设备和材料。

为了描述和公开诸如在出版物中描述的并且可能与本发明结合使用的试剂、细胞、构建体和方法等，本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文。上文以及整个文本中所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中无任何内容可以解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类公开。

提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制本发明的范围。已经努力确保所使用数字(例如数量、温度、浓度等)的准确性，但是应该允许存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力指大气压或接近大气压。

实验

改造用于与乙型肝炎核心病毒样颗粒表面生物缀合以逃避吞噬细胞吞噬的CD47细胞外结构域

CD47 ECD或能广泛用于逃避吞噬细胞吞噬作用，但使用大肠杆菌有效生产和纯化功能性CD47 ECD受到限制。由于ECD结构内的二硫键和天然疏水性，CD47 ECD的大肠杆菌表达需要通过体积较大的融合标签(例如GST)和大量的处理来展开和重新折叠蛋白。(参见Lin等人，蛋白表达与纯化，85，109–116(2012)；以及Han等人，生物化学杂志，275，37984–92(2000))。

此外，N端焦谷氨酸酯形成(对于结合SIRPα至关重要)是一项挑战，因为需要去除N端多肽以暴露N端的谷氨酰胺残留物，而后需要通过谷氨酰胺环化酶将其转化为焦谷氨酸酯(图2，参见Hatherley等人，分子细胞，31，266-77(2008))。尽管有若干示例表明CD47 ECD在多种细胞(包括细菌、哺乳动物(CHO)和昆虫(High Five)细胞)中表达和纯化，但其在N端或C端均具有延伸(参见Ho等人，生物化学杂志，290，12650–63(2015))。

另一项挑战是模仿细胞表面上天然CD47 ECD的定向，完成理想和实际吞噬细胞逃避。如Error！Reference source not found.所示，CD47 ECD通过ECD与细胞表面之间的双键(多肽和二硫键)锚定在细胞膜上。

在本文中，我们采用基于大肠杆菌的无细胞蛋白合成(CFPS)技术，制定了产生附接于HepBc VLP表面的CD47 ECD突变体以逃避免疫清除的方法。首先，引入N端延伸以帮助通过酶促反应产生焦谷氨酸酯N端。其次，引入两个非天然氨基酸(nnAA)掺入位点，以便CD47 ECD附接于VLP表面后能够复制ECD与细胞膜之间的天然双键。利用铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(“点击”反应)，CD47 ECD上的两个nnAA可与暴露于HepBc VLP表面刺突尖端的其他两个nnAA形成两个共价键。然后，进一步改造CD47 ECD，在不影响与SIRPα结合能力的情况下提高其溶解率。在这种工程化CD47 ECD表达和纯化后，使其附接于HepBcVLP表面。而后，CD47 ECD附接成功抑制了吞噬细胞对VLP的吞噬。结合最近在改造靶向递送治疗货物用HepBc VLP方面所做出的努力(第62/785,866号美国专利申请案)，CD47 ECD官能化VLP将大大提高递送效率和疗效。

材料与方法

表达质粒的构建。编码人CD47 ECD的原始序列(UniProt登录号：Q08722，成熟蛋白残基1-117(原始氨基酸位置19-135))针对大肠杆菌表达进行了密码子优化，并通过IDT合成为“gBlocks”。使用Gibson Assembly将基因克隆至具有限制酶位点NdeI和SalI的最小载体pY71中。在此基础上，利用QuikChange诱变和来自IDT的引物引入N端延伸(His8-EKseq)、非天然氨基酸掺入突变(C15M、M28V、M82L/I、V116M)和提高蛋白溶解率的突变(F14N和V115N)。使用MFold对由质粒转录的mRNA的5'非翻译区进行分析和优化，减少RNA发夹结构的形成。

编码具有N端延伸(His₈-EKseq)和非天然氨基酸掺入突变(C15M、M36V、M82I、M88V、V114M)的小鼠CD47 ECD的序列(UniProt登录号：Q61735，成熟蛋白残基1-115(氨基酸位置19-133))针对大肠杆菌表达进行了优化，并直接通过IDT合成为“gBlocks”。采用上述相同方法将基因克隆至pY71载体中。

无细胞蛋白合成(CFPS)CD47 ECD突变体通过PANOx-SP(PEP、氨基酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、草酸、亚精胺和腐胺)CFPS系统表达，产生如前所述具有一些修饰的二硫键蛋白，详见：Lu等人，国家科学院院刊，201510533(2015)。首先，在室温下用0.5mM碘乙酰胺预处理细胞提取物30分钟。然后向CFPS反应混合物中加入4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG，AppliChem)和1mM还原型谷胱甘肽(GSH)，稳定硫醇/二硫化物氧化还原电位。此外，加入二硫键异构酶——大肠杆菌DsbC。最后，为了提高蛋白溶解率，使谷氨酸钾的浓度从原来的175mM降至50mM。最终的反应混合物包括：10mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、50mM谷氨酸钾、4mMGSSG、1mM GSH、100μg/mL DsbC、1.25mM ATP、1mM GTP、UTP、CTP、34μg/mL叶酸、170.6μg/mLtRNA(Roche Molecular Biochemicals)、18种氨基酸各2mM(Met和Glu除外)、33.3mM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP，Roche Molecular Biochemicals)、0.33mM NAD、0.27mM辅酶A(CoA)、2.7mM草酸钾、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、2mM甲硫氨酸、6μM在T7启动子下编码目的蛋白的质粒DNA、约100-300μg/mL纯化T7 RNA聚合酶以及0.25体积的预处理KC6 S30提取物(用A19 met+、ΔtonA、ΔtnaA、ΔspeA、ΔendA、ΔsdaA、ΔsdaB、ΔgshA大肠杆菌细胞制备)。除非另有说明，否则所有试剂均从Sigma-Aldrich处获得。为了量化蛋白产量，还加入了2-10μM L-[U-¹⁴C]-亮氨酸(PerkinElmer)。为了实现整体甲硫氨酸置换以掺入nnAA，CFPS反应混合物中无甲硫氨酸，而是加入2mM叠氮基高丙氨酸(AHA，Medchem Source LLP)或2mM高丙炔基甘氨酸(HPG，Chiralix)。

反应以多种规模进行：在2mL Eppendorf管中以15-50μL的体积进行反应；在密封的6孔培养板中以500μL的体积进行反应；或者在密封的10cm培养皿中以5mL的体积进行反应。将反应物置于30℃或室温下孵育16小时。

分析合成蛋白的浓度和溶解率。采用Beckman LS6000液体闪烁计数器测量结合的放射活性，以确定蛋白浓度。直接测量总表达蛋白浓度，并在以10,000xg离心15分钟去除不溶性组分后测量可溶性蛋白浓度。将两个样本(3-5μL)点样并于Whatman滤纸上沉淀，然后浸入5％三氯乙酸(TCA)中3次，去除未结合的14C-亮氨酸。

蛋白溶解率被定义为在离心后上清液中沉淀出的14C标记蛋白总量中的占比(可溶性蛋白)。

采用固定金属亲和色谱分析法(IMAC)纯化具有N端延伸的CD47 ECD。如上所述，CD47 ECD融合蛋白(His₈-EKseq-CD47 ECD)使用CFPS表达。纯化方法如下：首先使用Sephadex G-25 PD-10脱盐柱(GE Healthcare Life Sciences)将CFPS反应大分子交换至由50mM Tris-HCl pH 7.4、25mM咪唑和0.01％Tween-20组成的溶液中。接着，以10,000xg离心15分钟去除不溶物，然后将可溶组分(上清液)上样至镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱(Qiagen)，用由50mM Tris-HCl pH 7.4、25mM咪唑和0.01％Tween-20组成的溶液平衡。用7倍柱体积(CV)的相同缓冲液洗涤样本，并用5倍CV的由50mM Tris-HCl pH 7.4、250mM咪唑和0.01％Tween-20组成的溶液洗脱，同时收集0.5倍CV的组分。然后，将含有CD47 ECD融合蛋白的组分合并，并使用

超离心过滤器(10kDa分子量截留)(Millipore)浓缩。

在N端具有焦谷氨酸酯的CD47 ECD的产生。先将纯化的CD47 ECD融合蛋白(His₈-EKseq-CD47 ECD)上样至Sephadex G-25PD-10脱盐柱(GE Healthcare Life Sciences)，以将蛋白交换至由50mM Tris-HCl pH 7.4、50mM NaCl、1mM CaCl2和0.01％Tween-20组成的溶液中。接着，用人His标记的肠激酶切割酶(Applied Biological Materials)在4℃下消化蛋白20-23小时。然后，如上所述，通过Ni-NTA IMAC去除未切割的融合蛋白(His₈-EKseq-CD47 ECD)、切割的N端标签(His₈-EKseq)和His标记的肠激酶。收集流穿组分和洗涤组分中未与Ni-NTA树脂(Qiagen)结合的成熟CD47 ECD蛋白，将其上样至Sephadex G-25 PD-10脱盐柱(GE Healthcare Life Sciences)，以交换至由50mM Tris-HCl和0.01％Tween-20组成的溶液中。最后，使用

超离心过滤器(10kDa分子量截留)(Millipore)浓缩蛋白样本，并在室温下用谷氨酰胺酰环化酶(QC，Novus biologicals)处理1-3小时，将N端谷氨酰胺残留物转化为焦谷氨酸酯。

焦谷氨酸酯形成检测。利用Schilling等人建立的连续分光光度测定法检定CD47ECD N端谷氨酰胺残留物向焦谷氨酸酯的转化效率。简而言之，向50mM Tris-HCl pH 7.4缓冲液中加入50μM(1Q)CD47 ECD蛋白、150μM NADH(Sigma)、7mMα-酮戊二酸酯(Sigma)、15U/mL谷氨酸脱氢酶(GLDH，Sigma)和QC酶并混匀。通过使用

iD3多模式酶标仪(Molecular Devices)测量340nm处的吸光度，检测到NADH浓度持续降低，这表明形成了焦谷氨酸酯。

HepBc VLP生成。本研究中使用了先前开发的用于负载小分子的HepBc突变体(HepBc HP 2ASVins SS1 SS8 79M(IG)₂IC-His₆和HepBc HP 2ASVins SS1 SS8 80M(IG)₂IC-His₆)。如前所述(第62/788,558号美国专利申请案)，使用CFPS表达含有AHA而非甲硫氨酸的HepBc蛋白，生成显示叠氮化物官能团的VLP。空VLP用于评估VLP表面上的CD47 ECD附接，负载有Bodipy FL半胱氨酸(BDFL)的VLP用于巨噬细胞逃避测定。

铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(“点击”化学)。对于“点击”反应连接，在CFPS下，CD47 ECD蛋白用HPG(含有炔烃官能团)表达，HepBc突变蛋白用AHA(含有叠氮化物官能团)而非甲硫氨酸表达。CD47 ECD蛋白根据先前制定的方案与HepBc VLP表面缀合(Patel&Swartz，生物缀合化学，22，376-387(2011))。在厌氧手套箱(Coy Laboratories)中进行反应，使四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐催化剂(Sigma Aldrich)保持还原状态。将41.67nMHepBc VLP(单体蛋白浓度为10μM)与1.5-20μM CD47 ECD、0.5mM三(三唑基甲基)胺(TTMA)、0.01％Tween-20和2mM四重催化剂在50mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中混合，并使其在厌氧环境下反应16小时。

利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和放射自显影术分析“点击”化学生物缀合。进行生物缀合分析时，使用非放射性CD47 ECD和放射性标记的HepBcVLP，并通过SDS-PAGE和放射自显影术分析生物缀合产物的大小。NuPAGE Novex预制凝胶和试剂购自Invitrogen。还原SDS-PAGE时，将样本与LDS电泳缓冲液和50mM二硫苏糖醇(DTT)混合，并在75℃下变性10分钟。将样本上样到12％(w/v)Bis-Tris预制凝胶(具有用于Mark12分子量蛋白标准(Thermo Fisher Scientific)的单独泳道)上，并在MES/SDS电泳缓冲液中进行电泳。根据制造商的建议，使用SimplyBlue SafeStain(Thermo FisherScientific)对凝胶进行染色和固定。在暴露于储存磷光质屏(Molecular Dynamics)之前，使用583型凝胶干燥器(Bio-Rad)干燥凝胶，随后针对放射自显影使用Typhoon扫描仪(GEHealthcare)对其进行扫描。在放射自显影片上可以看到解组装和还原的HepBc单体蛋白条带及缀合产物条带(HepBc单体+CD47 ECD和两个HepBc单体+CD47 ECD)。基于对照品条带和缀合物条带的密度，使用ImageJ软件通过密度测定法估计缀合效率。

使用体积排阻色谱法(SEC)纯化CD47 ECD官能化VLP。在“点击”反应后，通过SEC去除铜(I)催化剂和未结合的配体。CD47 ECD官能化HepBc VLP通过将200μL反应溶液加入2.2mL Sepharose 6Fast Flow树脂(GE Healthcare)中进行纯化，洗脱24x 150μL组分。使用含有0.01％Tween-20的PBS平衡SEC柱并洗脱VLP。通过测定负载的荧光染料BDFL的荧光强度来检测VLP峰组分(通常在组分5和8之间)。最后，将VLP组分合并，并使用

超离心过滤器(30kDa分子量截留)(Millipore)浓缩。

巨噬细胞逃避测定。通过将组成型表达H2B的小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞与miRFP670(从Markus Covert实验室获得)融合进行核标记，检定所显示的工程化小鼠CD47ECD突变体逃避VLP吞噬的能力。在成像前两天，将这些RAW 264.7细胞以7,500个细胞/孔的密度接种于玻璃底的96孔组织培养板中，该培养板已预先涂布有10μg/mL人纤连蛋白(FC010，Millipore)。然后，在成像前一天，在100μL DMEM(Life Technologies)(加入了10％FBS(Omega Scientific)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)和1X青霉素/链霉素(P/S,Life Technologies))中加入100ng/mL脂多糖(LPS，来自大肠杆菌，血清型EH100(Ra)，Enzo Life Sciences)和20ng/mL鼠干扰素γ(IFNγ，PeproTech)，刺激细胞20小时，使其分化，以强化吞噬功能。在成像当天，将细胞与0.05nM(最终浓度)负载有BDFL的VLP在37℃下孵育2小时，以便发挥吞噬作用，然后用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤细胞3次，以去除游离VLP。最后，将培养基更换为FluoroBrite DMEM(Life Technologies)，加入1％FBS和2mM L-谷氨酰胺进行成像。配备Andor Neo 5.5sCMOS摄像头的Nikon Eclipse Ti-E倒置显微镜用于荧光成像，以检测RAW 264.7细胞中被吞噬的VLP和BDFL染料分子。远红外泳道(645/30-nm激发滤光片和705/72-nm发射滤光片)和FITC泳道(490/20-nm激发滤光片和525/36-nm发射滤光片)分别用于检测细胞核和BDFL染料。

结果与讨论

具有N端延伸的人CD47细胞外结构域的无细胞表达。我们首先设计了具有N端延伸的人CD47 ECD，其可以生成具有谷氨酰胺N端的CD47 ECD，而该N端可以转化为真正的焦谷氨酸酯端。这对于SIRPα识别至关重要。在N端，我们引入了八组氨酸标签(His x 8)进行纯化，然后引入了短的Gly Ser Ala连接子和肠激酶识别序列(Asp Asp Asp Asp Lys)(FIG.3)。纯化此融合蛋白(His₈-EKseq-hCD47 ECD)后，使用肠激酶在识别序列后立即去除延伸。这使得N端的谷氨酰胺残留物暴露，而后可以使用谷氨酰胺酰环化酶将其转化为焦谷氨酸酯。

接着，我们将若干突变引入人CD47 ECD中，以通过CFPS和整体甲硫氨酸置换实现nnAA掺入。使用内源性甲硫氨酰基-tRNA合成酶掺入甲硫氨酸类似物而非甲硫氨酸，以便与VLP表面“点击”结合。首先，我们置换了两个位于CD47与SIRPα之间的识别边缘区域以外的天然甲硫氨酸残基(M28和M82)(FIG.A)。基于CD47保守序列搜索，用缬氨酸置换M28(FIG.)。另一方面，M82在大多数可用的CD47氨基酸序列中是保守的，因此产生了几种不同的突变体(例如：M82L和M82I)。然后，我们在C15和V116处引入了两个nnAA掺入位点(ATG密码子)，即，将ECD锚定在细胞膜上的双键位点(FIG.A)。我们假定，使用“点击”缀合时，双键可在HepBcVLP表面复制，另外两个nnAA掺入HepBc二聚体亚基突出的刺突尖端，以实现真正的CD47-SIRPα结合(FIG.B)。除这些突变外，CD47 ECD面向细胞膜(或VLP表面)表面上的两个疏水性残基被置换为天冬酰胺残基，即最具亲水性的不带电氨基酸，以提高蛋白溶解率(F14N和V115N)(FIG.C)。

利用这些突变体，我们接着使用CFPS与甲硫氨酸、含有炔烃官能团(高丙炔基甘氨酸，HPG)的nnAA或含有叠氮化物官能团(叠氮基高丙氨酸，AHA)的nnAA检测无细胞蛋白表达水平和溶解率(FIG.)。与仅具有C15G突变(WT G15G)的突变体(引入该突变体以避免因不适当的二硫键形成而导致的蛋白聚集)相比，旨在避免不合需求的nnAA掺入(nnAA(L)和nnAA(I))的突变体可降低可溶性蛋白积累水平。然而，对于具有亲水性天冬酰胺突变(F14N+V115N，突变体被命名为nnAA(L)NN和nnAA(I)NN)的工程化CD47-ECD；可溶性蛋白积累恢复到WT C15G水平，相对溶解率从～70％增加到>90％(图6B)。相应亲水性突变体用于进一步研究中。

人CD47 ECD的纯化。利用如上所述具有N端延伸和突变的工程化人CD47 ECD，接下来，我们纯化并切割初始表达产物，产生具有N端谷氨酰胺的人CD47 ECD。通过SDS-PAGE评估每个纯化步骤中的样本(FIG.A)。使用CFPS表达融合蛋白，然后使用Ni-NTA IMAC纯化，接着进行肠激酶切割。在此蛋白酶反应过程中，我们观察到了一些非特异性切割产物——可能在83D和84K附近被切割，因为相应序列与肠激酶识别序列(DDDDK)相似。这种不合需求的切割的水平根据位置82处的突变而变化。由于nnAA(I)NN突变体相较于nnAA(L)NN突变体非特异性切割更少，因此选择nnAA(I)NN突变体进行进一步研究。再次利用Ni-NTA IMAC，去除所有肠激酶、切割的N端标签(His₈-EKseq)和未切割的融合蛋白(His₈-EKseq-hCD47 ECD)，留下含N端谷氨酰胺的人CD47 ECD nnAA(I)NN((1Q)hCD47 ECD)。然后，我们通过QC检测了谷氨酰胺向焦谷氨酸酯转化的情况。采用Schilling等人建立的连续分光光度测定法进行测定，结果表明焦谷氨酸酯形成率不超过80％(FIG.B)。

小鼠CD47 ECD的产生。基于在人CD47 ECD方面的经验，我们接下来创建了具有相同突变的小鼠CD47 ECD以供未来的小鼠研究使用，因为CD47-SIRPα相互作用受物种限制。如FIG.所示，原来的三个甲硫氨酸残基基于序列保守性(M36V、M82I、M88V)进行了置换(FIG.)。用于人CD47 ECD(F14N和V115N)的亲水性突变未被引入小鼠CD47 ECD中，因为它在这些位置处无疏水性残基(相应的氨基酸为S14和T113)。然后，使用CFPS检测蛋白表达，并且具有N端延伸的小鼠CD47 ECD积累至与人CD47 ECD相同的浓度，对于具有met、HPG和AHA掺入的CD47-ECD，其蛋白溶解率约为80％(FIG.)。采用与上述人CD47 ECD相同的方法纯化和产生具有N端焦谷氨酸酯的小鼠CD47 ECD。

评估小鼠CD47 ECD与HepBc VLP表面的附接情况。我们接着使用“点击”化学检测了纯化的小鼠CD47 ECD与HepBc VLP表面的生物缀合情况。将显示炔烃官能团(HPG)的nnAA和显示叠氮化物官能团(AHA)的nnAA分别引入HepBc VLP和小鼠CD47 ECD。先前，我们检测了如FIG.C中所示位于HepBc刺突区域尖端的若干个nnAA掺入位点。对于小鼠CD47 ECD附接，我们检测了位置79和80；避免使用D78作为封端残基，以稳定HepBc螺旋结构，并且未选择L76，因为每个二聚体中两个L76残基之间的距离相对较大，预计无法实现与CD47 ECD的预期双重连接。在Cu(I)存在的情况下，用不同浓度的小鼠CD47 ECD与放射性标记的HepBcVLP(79nnAA VLP和80nnAA VLP)进行生物缀合，然后通过还原SDS-PAGE和放射自显影术进行分析(FIG.A)。对于这两种类型的VLP，除HepBc单体条带外，还观察到两条指示缀合产物的条带；一条适用于与一个HepBc单体(单键)缀合的CD47 ECD，另一条适用于与两个HepBc单体(一个二聚体)(双键)缀合的CD47 ECD。FIG.B示出了基于凝胶密度测定法的每个VLP附接的CD47 ECD数量。由于未充分还原的HepBc二聚体条带与单键条带部分合并，因此用合并条带密度减去HepBc二聚体条带密度，计算单键条带密度。尽管我们有一些单键缀合物，但这些结果表明，>10个小鼠CD47 ECD通过双键与HepBc VLP表面缀合，如同真正锚定在细胞膜上一般。由于与79nnAA VLP相比，80nnAA VLP的双键比率略高于单键，因此使用80nnAAVLP进行进一步研究。

用CD47 ECD进行表面修饰可减少巨噬细胞样细胞对VLP的摄取。根据生物缀合分析，预计大多数附接的小鼠CD47 ECD在VLP上以真实定向显示SIRPα结合侧。因此，我们使用小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞检测了其逃避吞噬的功能。先用LPS和IFNγ刺激RAW 264.7细胞，使其分化，强化其吞噬功能，然后在37℃下与先前产生的负载有荧光染料BDFL的VLP(表面有或无小鼠CD47 ECD)一起孵育2小时。然后，去除培养基，洗涤细胞三次，随后在荧光显微镜下成像。如FIG.所示，与无CD47 ECD的相同VLP相比，受刺激的RAW 264.7细胞对小鼠CD47 ECD官能化并负载有BDFL的VLP的吸收显著降低。这表明工程化CD47 ECD在附接于VLP后保留了其抑制吞噬作用的功能。

在这项研究中，我们改造了CD47 ECD以便与HepBc VLP进行生物缀合，并成功证明了它在逃避巨噬细胞样细胞吞噬方面的功能。尤其是，我们复制双键的设计，使得CD47 ECD相对于细胞膜表面内源性定向，这可以实现与SIRPα的真实相互作用并逃避免疫原性。CD47ECD还可使在表面显示适当邻近的成对反应性官能团的其他类型的NP受益，实现CD47 ECD的“点击”生物缀合。

CD47 ECD的功能可与特异性靶向功能相结合，以使用NP进行有效的靶向递送。靶向配体的示例是单链可变片段(scFvs)和识别靶细胞的特异性细胞表面标志物的DNA适配子。一步“点击”缀合方法有利于通过改变反应中的相对配体浓度来轻松制备具有不同密度的各配体的NP。

其中一个益处在于，NP表面上附接的CD47-ECD数量相对较少(图10B)，仍留有约100个表面刺突，可用于随后或同时附着细胞靶向剂。因此，虽然吞噬细胞清除率将显著降低，但靶细胞对NP的吸收不会降低。

下表提供了示例中使用的蛋白和核苷酸序列。非天然氨基酸(nnAA)掺入位点在蛋白一级序列中以“Z”表示，且示出了置换原始甲硫氨酸残基的突变位点；以及天冬酰胺亲水性突变位点。对SIRPα结合有较大影响的区域用下划线标记，N端延伸用双下划线标记。

表1

Claims (28)

1.一种工程化CD47细胞外结构域多肽(ECD)，其包含：

(i)包含与残基Q1(参考序列号：1或序列号：2的编号)紧邻的切割识别位点的N端延伸；以及

(ii)位于所述CD47-ECD的两个位点处、用于附接于表面的非天然氨基酸(nnAA)。

2.根据权利要求1所述的工程化CD47-ECD，其中所述nnAA存在于残基15和116处。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化CD47-ECD，其中所述nnAA通过正交平移组分引入。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化CD47-ECD，其中所述nnAA通过甲硫氨酸置换引入。

5.根据权利要求4所述的工程化CD47-ECD，其包含位于残基M28和M82处的氨基酸取代——被除甲硫氨酸以外的氨基酸取代。

6.根据权利要求5所述的工程化CD47-ECD，其中所述除甲硫氨酸以外的氨基酸选自L、I、V和F。

7.根据权利要求6所述的工程化CD47-ECD，其中所述氨基酸取代是M28V和M82L/I。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的工程化CD47-ECD，其中所述nnAA包含炔烃或叠氮化物官能团。

9.根据权利要求8所述的工程化CD47-ECD，其中所述nnAA选自高炔丙基甘氨酸或叠氮基高丙氨酸。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化CD47-ECD，其中所述N端延伸包含肠激酶切割识别序列。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化CD47-ECD，其中所述N端延伸包含因子Xa的切割识别序列。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的工程化CD47-ECD，其中所述N端延伸包含用于纯化的多肽标签。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的工程化CD47-ECD，其中切割所述N端延伸，从而暴露转化为焦谷氨酸酯的N端谷氨酰胺。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的工程化CD47-ECD，其包含至少一个氨基酸取代，以用亲水性残基置换所述天然蛋白中面向所述细胞膜的所述CD47 ECD表面上的疏水性残基。

15.根据权利要求14所述的工程化CD47-ECD，其中残基F14和V115用不带电的亲水性氨基酸置换。

16.根据权利要求15所述的工程化CD47-ECD，其包含一个或两个氨基酸取代——F14N和V115N。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的工程化CD47-ECD，其通过无细胞蛋白合成产生。

18.一种通过与所述nnAA反应在其表面与根据权利要求1-17中任一项所述的工程化CD47-ECD缀合的制品。

19.根据权利要求18所述的制品，其中所述反应是铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应。

20.根据权利要求18或19所述的制品，其中所述制品是纳米颗粒。

21.根据权利要求20所述的制品，其中所述纳米颗粒是病毒样颗粒。

22.根据权利要求21所述的制品，其中所述病毒样颗粒包含与所述CD47-ECD缀合的乙型肝炎核心蛋白。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的制品，其包含治疗剂。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的制品，其中相对于不含所述CD47-ECD的制品，所述制品的吞噬细胞清除率降低至少10％。

25.一种用根据权利要求1-17中任一项所述的工程化CD47-ECD包覆制品的方法，所述方法包含使所述制品表面上的反应性炔烃或叠氮化物基团与存在于所述CD47-ECD中的nnAA反应。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述反应性炔烃或叠氮化物基团间隔约5至约15埃。

27.根据权利要求25所述的方法，其中在所述表面上提供由反应性炔烃或叠氮化物基团组成的阵列，从而提供多种反应物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中在所述表面上提供由反应性炔烃或叠氮化物基团组成的阵列，先连接显示所述缀合炔烃或叠氮化物基团的纳米颗粒，然后将工程化CD47-ECD与所述纳米颗粒连接。

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