JP6840914B2 - 細胞膜透過性を有するペプチド、構築物、及び、カーゴ分子を細胞内に輸送する方法 - Google Patents
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Description
F-(L-Arg-L-Arg-Xaa)m-(Gly)n-NH2・・・式X
〔式中、
mは2〜4のいずれかの整数であり、
nは0〜3のいずれかの整数であり、
Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのN末端に結合した蛍光標識であり、
Xaaは、下記の式A、式B(nは1〜5)、式C(nは1〜5)、又は、式D(nは1〜5)の何れかである
F-(L-Arg-L-Arg-Xaa)m-(Gly)n-NH2・・・式X
〔式中、
mは2〜4のいずれかの整数であり、
nは0〜3のいずれかの整数であり、
Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのN末端に結合した蛍光標識であり、
Xaaは、下記の式A、式B(nは1〜5)、式C(nは1〜5)、又は、式D(nは1〜5)の何れかである。
ここで、ProGuは下記である。
細胞内に導入するプロリン誘導体は全て、有機化学的に合成した。ペプチドはマイクロウェーブを用いたFmoc固相法により簡便に行い、下記3つのペプチドを合成した。
式1は比較例にかかるペプチドであり、Proは下記である。
式2は別の比較例にかかるペプチドであり、ProNH2は下記である。
式3は本実施例にかかるペプチドであり、ProGuは下記である。
得られた粗ペプチドは逆相HPLCにより精製し、MALDI-MSによって同定した。ペプチドの溶液状態における二次構造は20 mM PBS buffer solution (pH = 7.4)及び1% SDS in PBS buffer solution (pH = 7.4)を用い、CDスペクトル測定によって解析を行なった。
(3)ペプチドの細胞膜透過性
ペプチドの細胞膜透過性に関しては、フローサイトメーターを用い、細胞内の蛍光強度から測定した。結果を図3(A)及び(B)に示す。図3(A)は接着細胞における各ペプチドの細胞膜透過性の結果(R9を1とした時の相対的透過性)である(ペプチド濃度:1μM、37℃、2時間培養)。図3(B)は浮遊細胞における各ペプチドの細胞膜透過性の結果(R9を1とした時の相対的透過性)である(ペプチド濃度:1μM、37℃、2時間培養)である。図3(A)及び(B)に示されるように、本実施にかかるペプチド3は、接着細胞(HeLa, A549, CHO-K1)及び浮遊細胞(Jurkat)に対し、低濃度において高い透過性を示した。
(4)ペプチドのカーゴ分子輸送効率
ルシフェラーゼをコードしたpDNA(Plasmid pCAcc+Luc, coding for firefly luciferase under the control of the CAG promoter, was provided by the RIKEN Gene Bank (Tsukuba, Japan))を利用したルシフェラーゼアッセイにより、ペプチドのカーゴ分子輸送効率を評価した。結果を図4に示す。図4は、各ペプチドによるプラスミドDNAのデリバリー(37℃、24時間培養)を示す。図4に示されるように、本実施例にかかるペプチドは、HeLa細胞において、オリゴアルギニンと比較して高いpDNA輸送効率を達成した。
Claims (5)
- 細胞膜透過性を有する下記の式X
F-(L-Arg-L-Arg-Xaa)m-(Gly)n-NH2・・・式X
〔式中、
mは3であり、
nは3であり、
Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのN末端に結合した蛍光標識であり、
Xaaは、下記の式Aである
- Fはフルオレセイン化合物である請求項1記載のペプチド。
- 請求項1又は2に記載のペプチドと、細胞内に輸送すべきカーゴ分子とを含む構築物。
- 前記カーゴ分子は、核酸、タンパク質、薬剤、又は、ナノ粒子の何れかである請求項3記載の構築物。
- 細胞内に輸送すべきカーゴ分子と、請求項1又は2に記載のペプチドとを結合させて構築物を得る工程と、
前記構築物を細胞に導入する工程と、を有する、
カーゴ分子を細胞内に輸送する方法。
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