CN114113632A - 一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析方法与应用，采用免疫层析试纸结合抗原生物素探针的方法对动物疫病抗体进行检测；所述免疫层析试纸包括支撑层、从测试端依次固定在支撑层上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及手柄端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫采用吸附有胶体金标记的SPA或二抗IgG的玻璃纤维棉制成；所述检测线喷涂有链霉亲和素；所述质控线喷涂有非检测对象种属的IgG抗体；所述抗原生物素探针为动物疫病靶标物抗原与生物素偶联获得抗原生物素探针。可用于一种/几种动物种属的绝大多数疫病抗体的检测。

Description

一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析方法与应用
技术领域
本发明涉及一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析方法与应用，属于免疫学检测领域。
背景技术
我国是养殖生产、消费和贸易大国，在猪、牛、羊、禽及水产养殖等方面均在世界占据领先地位。养殖大国要成为养殖强国，实现“产出高效、产品安全、资源节约、环境友好”的产业发展目标任务巨大。疫病防控是制约我国养殖业转型升级和提质增效的瓶颈问题，当前疫病流行错综复杂，免疫抑制、混合感染、继发感染、协同感染日趋严重，对感染与免疫动物难以鉴别，动物疫病的防控与净化面临挑战，疫病的快速诊断和监测预警是疫病防控的关键环节。
免疫层析法是一种快速诊断技术。该技术综合了单克隆抗体技术、免疫层析技术、新材料及标记技术，不需要专业技能和昂贵的设备即可实现抗原、抗体的定性及半定量检测，已经广泛应用于兽医诊断领域。其原理是将特异的抗体/抗原先固定于硝酸纤维素膜上，示踪物标记抗原/抗体，当样品端浸入样品后，与样品中的抗原/抗体反应，由于毛细管的作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至硝酸纤维素膜上时，被固定的抗体/抗原拦截从而实现特异性的免疫诊断。
由于PCR检测方法在疫病抗原检测中灵敏度非常高，是可以代替病毒分离鉴定的一种灵敏、特异、快速的检测技术，在抗原检测方面它比ELISA、免疫层析试纸等免疫分析法具有更高的敏感性，因此免疫层析技术在动物疫病抗体检测中应用更为广泛，抗体监测技术的应用能更加有效地诊断出动物疫病感染状况，评价动物免疫效果，为制定针对性的治疗方案及免疫程序提供科学依据，进而提高动物疫病防控工作的质量。然而由于动物种类繁杂，感染的病原及免疫的疫苗也多种多样，则需要购买多种检测产品，大大增加了检测成本，因此对通用型疫病抗体检测试纸的需求非常迫切。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析方法与应用，可用于一种/几种动物种属的绝大多数疫病抗体的检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析试纸条，采用免疫层析试纸结合抗原生物素探针的方法对动物疫病抗体进行检测；
所述免疫层析试纸包括支撑层、从测试端依次固定在支撑层上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及手柄端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫采用吸附有胶体金标记的SPA或二抗IgG的玻璃纤维棉制成(胶体金标记SPA构建的试纸可以通用于检测狗、兔、牛、羊、猪等能与SPA反应的多种种属疫病的抗体；胶体金标记羊/兔抗猪IgG制备的试纸仅检测猪疫病的抗体；胶体金标记羊/兔抗鸡IgG制备的试纸仅检测鸡疫病的抗体)；所述检测线喷涂有链霉亲和素；所述质控线喷涂有非检测对象种属的IgG抗体；所述抗原生物素探针为动物疫病靶标物抗原与生物素偶联获得抗原生物素探针；
所述抗原生物素探针的制备方法为：
(1)向0.1-0.5mL二甲基亚砜中加入3-6mg生物素充分溶解，得混合物A；
(2)向0.5mL双蒸水中加入3-6mg EDC充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物A的溶液中，反应30min，得混合物B；
(3)将0.5-10mg动物疫病靶标物抗原在搅拌状态下加入到混合物B的溶液中，室温反应2h后，磷酸缓冲盐溶液透析3d，获得抗原生物素探针。
所述的免疫层析试纸条的检测方法，所述检测方法为：
先在样品孔中加入10-800倍稀释后的待测样品90μL；然后在样品孔中加入10μL/孔、每孔含0.1-10μg的抗原生物素探针，混合均匀；最后，插入所述的免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
结果判定的方法为：在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；仅在质控线处出现一条紫红色线，而检测线处不出现紫红色线，说明待检测样品为阴性；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明待检测样品为阳性。
所述的免疫层析试纸条在动物疫病抗体检测中的应用。
本发明有益效果：
本发明通过胶体金标记SPA或二抗，硝酸纤维素膜检测线上固定亲和素，制备成免疫层析试纸，该试纸搭配抗原生物素探针，可以检测靶标物抗体。检测时将样品与制备的抗原生物素探针混合后，加入检测试纸进行检测，其中检测线显色强度与样品中抗体浓度呈正比，可以对抗体水平进行评价。
本发明免疫层析试纸产品，搭配不同的抗原探针，即可进行不同疫病的抗体检测，可以大大降低产品研发成本及养殖户检测成本。
附图说明
图1为口蹄疫O型VP1多肽抗原探针用量优化结果图。
图2为通用型试纸检测口蹄疫O型抗体灵敏度结果图。
图3为通用型试纸检测口蹄疫O型抗体特异性结果图。
其中，A：猪瘟阳性血清，B：口蹄疫A型阳性血清，C：口蹄疫O型攻毒血清，D：口蹄疫O型免疫血清，E：非洲猪瘟阳性血清。
说明：试纸条得到的检测线为彩色线条较清楚，换成黑白图显示效果受影响，见图1、图2、图3。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1一种通用型免疫层析试纸的制备
1、胶体金溶液的制备
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液：将99mL超纯水加入到洁净的带刻度的200mL锥形瓶中，将锥形瓶置于加热磁力搅拌器上加热并搅拌，加入1mL 1％(w/v)氯金酸溶液，加热至沸腾，然后迅速加入3mL 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热溶液，颜色经过透明-黑色-深红色-酒红色变化，待颜色不再变化时再加热5min，室温冷却后，用超纯水将胶体金定容至100mL，4℃保存，得到胶体金溶液，备用。
将SPA(金黄色葡萄球菌蛋白A)用超纯水稀释到1mg/mL浓度，按10μL SPA溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的抗体溶液逐滴加入到胶体金溶液中，室温反应30min，加入10％(v/v)的BSA(牛血清白蛋白)至终浓度为1％，室温反应10min，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用10mL金标蛋白重悬液(20mmol/L硼酸缓冲液含1％(w/v)的BSA、3％海藻糖和0.03％叠氮钠)重悬为10×浓缩液，4℃保存，得到胶体金标记的SPA，备用。
2、通用型免疫层析试纸条的组装
用喷涂仪按7μL/cm的用量，将5×金标SPA浓缩液喷涂于玻璃纤维棉上，于4℃低温真空干燥，制备得到金标SPA结合垫，42℃干燥1h，加干燥剂密封，备用。
将2mg/mL的兔IgG抗体喷涂在硝酸纤维素膜的质控线位置，将2mg/mL的链霉亲和素喷涂在硝酸纤维素膜的检测线位置，于42℃干燥4h，加干燥剂密封，备用。
样品垫由玻璃纤维棉经样品垫处理液浸泡干燥后制成。
试纸制备时将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫及吸水垫依次粘贴于支撑层上，各组份间重叠1-2mm，用切割机切成试纸条。
实施例2口蹄疫O型、非洲猪瘟及猪瘟抗原探针的制备
1、口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针的制备
(1)口蹄疫病毒结构蛋白表位多肽的合成：
合成口蹄疫病毒VP1上第142～158位氨基酸序列(氨基酸序列根据所检口蹄疫毒株不同而不同)，在其-NH4端加入一个半胱氨酸，多肽序列均由商业公司合成和纯化。
(2)口蹄疫病毒结构蛋白表位多肽人工抗原的制备：
用异型双功能试剂Sulfo-SMCC(MW：436.37，Spacer Arm Length：
Figure BDA0003391961570000041
Pierce)活化载体蛋白BSA(或OVA)上的-NH2，具体操作步骤如下：
1)偶联缓冲液(50mL)：0.15M NaCl，0.1M PB缓冲液(pH 7.2)，1μM EDTA(乙二胺四乙酸)；
2)BSA(牛血清白蛋白)溶液：称取8mg的载体蛋白BSA溶于1.0mL偶联缓冲液中；
3)Sulfo-SMCC溶液：称取2mg Sulfo-SMCC加入100μL的DMSO(二甲基亚砜)中，反复吹打，使其充分溶解；
4)将BSA溶液和Sulfo-SMCC溶液混合，充分混匀后，室温下，反应1h或37℃，30min，并不时的混匀；
5)用偶联缓冲液在4℃条件下对步骤(4)的溶液进行透析48h，每6h换液一次，去除多余的偶联剂(Sulfo-SMCC)和DMSO；
6)用偶联缓冲液调整载体蛋白BSA浓度至5mg/mL，该溶液即为SMCC活化载体蛋白(SMCC-BSA)，-20℃冻存备用。
载体蛋白上的-NH2经活化后和多肽(Pep)N末端半胱氨酸(Cys)的-SH相连，形成口蹄疫O型VP1多肽人工抗原(BSA-Pep)。偶联步骤为：称取4mg多肽，以0.01M的PBS缓冲液充分溶解后(对于溶解性比较低的多肽要用DMF或DMSO溶解)；加入300μL 0.01M PB缓冲液(pH7.2，含5mM EDTA)，制备多肽储存液，浓度为10mg/mL。偶联时，取20μL多肽储存液，加入等体积含5mM EDTA的0.01M PB缓冲液(pH 7.2)中，再加入40μL SMCC-BSA溶液充分混合，室温反应4h后，4℃孵育过夜。用生理盐水在4℃条件下对上述溶液进行透析48h，每6h换液一次，去除多余的偶联剂；以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。
(3)口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针的制备
第一步，向0.5mL DMSO中加入3.46mg生物素充分溶解，得混合物A。
第二步，向0.5mL双蒸水中加入4.05mg EDC充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物A的溶液中，反应30min，得混合物B。
第三步，取5mg口蹄疫O型VP1多肽人工抗原，搅拌状态下加入到混合物B的溶液中,室温反应2h后，PBS透析3d，获得口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针。
2、非洲猪瘟p72抗原生物素探针的制备
第一步，向0.5mL DMSO中加入3.46mg生物素充分溶解，得混合物A。
第二步，向0.5mL双蒸水中加入4.0mg EDC充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物A的溶液中，反应30min，得混合物B。
第三步，取2mgp72抗原，搅拌状态下加入到混合物B的溶液中，室温反应2h后，PBS透析3d，获得非洲猪瘟p72抗原生物素探针。
3、猪瘟E2抗原生物素探针的制备
第一步，向0.5mL DMSO中加入3.46mg生物素充分溶解，得混合物A。
第二步，向0.5mL双蒸水中加入4.0mg EDC充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物A的溶液中，反应30min，得混合物B。
第三步，取2mg E2抗原，搅拌状态下加入到混合物B的溶液中，室温反应2h后，PBS透析3d，获得猪瘟E2抗原生物素探针。
实施例3口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针用量优化
第一步，取6个样品孔，分别加入PBS稀释1000倍的口蹄疫O型抗体阳性标准血清90μL。
第二步，向上述6孔血清中分别加入10μL/孔、每孔分别含1μg、0.5μg、0.25μg、0.13μg、0.06μg、0.03μg的口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针，混合均匀。
第三步，插入通用型胶体金抗体检测免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
结果见图1，当探针加入量为0.25μg/孔时，检测线显色明显均匀，因此选择探针加入量为0.25μg/孔。
采用同样的方法，实验得到非洲猪瘟p72抗原生物素探针的最佳用量为4μg/孔、猪瘟E2抗原生物素探针的最佳用量为1μg/孔。
实施例4通用型试纸检测口蹄疫O型抗体试纸性能鉴定
1、通用型试纸检测口蹄疫O型抗体的灵敏度
第一步，取7个样品孔，分别加入90μL PBS。
第二步，在第一孔加入1:1000稀释的猪血清90μL，倍比稀释至最后一孔。
第三步，在样品孔中分别加入10μL/孔、每孔含0.25μg的口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针，混合均匀。
第四步，插入通用型胶体金抗体检测免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
结果见图2，由图2可知，当猪血清稀释倍数为1:64000时，试纸检测线显色消失，结果显示试纸的效价为1:64000。
2、通用型试纸检测口蹄疫O型抗体的特异性
第一步，取5个样品孔，分别加入1:100倍稀释的猪瘟阳性血清、口蹄疫A型阳性血清、口蹄疫O型攻毒血清、口蹄疫O型免疫血清、非洲猪瘟阳性血清90μL/孔。
第三步，在样品孔血清中分别加入10μL/孔、每孔含0.25μg的口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针，混合均匀。
第四步，插入通用型胶体金抗体检测免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
结果见图3，结果显示试纸与猪瘟阳性血清(图3A)、口蹄疫A型阳性血清(图3B)、非洲猪瘟阳性血清(图3E)无交叉反应，特异性良好。
实施例5通用型试纸检测口蹄疫O型、非洲猪瘟及猪瘟抗体的方法
1、口蹄疫O型抗体检测
第一步，在样品孔中加入1:100倍稀释的猪血清90μL，
第二步，在样品孔中加入10μL/孔、每孔含0.25μg的口蹄疫O型VP1多肽抗原生物素探针，混合均匀。
第三步，插入通用型免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
2、非洲猪瘟抗体检测
第一步，在样品孔中加入1:100倍稀释的猪血清90μL，
第二步，在样品孔中加入10μL/孔、每孔含4μg的非洲猪瘟p72抗原生物素探针，混合均匀。
第三步，插入通用型免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
3、猪瘟抗体检测
第一步，在样品孔中加入1:100倍稀释的猪血清90μL，
第二步，在样品孔中加入10μL/孔、每孔含1μg的猪瘟E2抗原生物素探针，混合均匀。
第三步，插入通用型免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
结果判定：在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；仅在质控线处出现一条紫红色线，而检测线处不出现紫红色线，说明待检测猪血清样品为阴性；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明待检测猪血清样品为阳性，而且检测线显色强度与抗体滴度高低在一定范围内成正比，检测线显色越强抗体滴度越高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不仅局限于实施例的限制，其他的标记材料、靶标物、探针及样品等的置换，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析试纸条，其特征在于，采用免疫层析试纸结合抗原生物素探针的方法对动物疫病抗体进行检测；
所述免疫层析试纸包括支撑层、从测试端依次固定在支撑层上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及手柄端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫采用吸附有胶体金标记的SPA或二抗IgG的玻璃纤维棉制成；所述检测线喷涂有链霉亲和素；所述质控线喷涂有非检测对象种属的IgG抗体；所述抗原生物素探针为动物疫病靶标物抗原与生物素偶联获得抗原生物素探针；
所述抗原生物素探针的制备方法为：
(1)向0.1-0.5mL二甲基亚砜中加入3-6mg生物素充分溶解，得混合物A；
(2)向0.5mL双蒸水中加入3-6mg EDC充分溶解，然后在室温搅拌下加入到混合物A的溶液中，反应30min，得混合物B；
(3)将0.5-10mg动物疫病靶标物抗原在搅拌状态下加入到混合物B的溶液中，室温反应2h后，磷酸缓冲盐溶液透析3d，获得抗原生物素探针。
2.如权利要求1所述的免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于，所述检测方法为：
先在样品孔中加入10-800倍稀释后的待测样品90μL；然后在样品孔中加入10μL/孔、每孔含0.1-10μg的抗原生物素探针，混合均匀；最后，插入所述的免疫层析试纸，10min后观察读取结果。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，结果判定的方法为：在质控线处出现紫红色线，说明本试纸有效；仅在质控线处出现一条紫红色线，而检测线处不出现紫红色线，说明待检测样品为阴性；在质控线和检测线处出现两条紫红色线，说明待检测样品为阳性。
4.如权利要求1所述的免疫层析试纸条在动物疫病抗体检测中的应用。
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