CN114107553A - 一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法 - Google Patents

一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，属于农业技术领域。包括：S1.从油菜种子或者叶片中提取基因组DNA；S2.基于现有油菜品种基因的DNA序列，共获得若干SNP位点，开发出KASP引物；S3.将提取的DNA配制PCR反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型，包括TT型油菜、TS型油菜和TS/TT的杂合型；S4.TT型油菜和TS/TT的杂合型判断为耐受型油菜。可用于种子和叶片材料的检测，利用自动化仪器检测通量高，一天内可完成上万份材料的检测，成本低于现有的分子检测方法。

Description

一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别 方法
技术领域
本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法。
背景技术
油菜是重要的食用油料作物之一,种植面积广泛,但油菜田的草害严重影响油菜的产量和品质。杂草危害可使我国油菜籽产量下降15.8%,严重的田块减产幅度可达50%以上[Song et al. 2005]。使用化学除草剂是目前最为主要的除草方法，而三嗪类除草剂津是在世界范围内广泛应用的一种除草剂之一。但除草剂施用不当会造成油菜不同程度的药害,从而影响油菜的生长发育与产量,因此选育三嗪类除草剂耐受（TT）型油菜，是油菜生产实现除草化学化的有效途径之一。
三嗪类除草剂的作用机理是取代质体醌与叶绿体类囊体膜上的32KD蛋白结合，从而阻断了PSⅡ的光电子传递而使光合作用受阻[John et al. 1982]。32KD蛋白由叶绿体psbA基因编码的，psbA基因第790位上A碱基突变为G碱基，会导致第264氨基酸由丝氨酸（AGT）突变为甘氨酸（GGT），从而丧失与三嗪类化合物的结合能力，形成了三嗪类除草剂耐受性[M.Reith et al. 1987]。因此通过检测psbA基因第790位上碱基类型，就能鉴定出三嗪类除草剂耐受（TT）型油菜。
传统鉴定三嗪类抗除草剂耐受型（TT）型油菜的方法是田间小区种植鉴定法。田间种植油菜，在幼苗期施用三嗪类抗除草剂，看幼苗存活情况鉴定除草剂耐受性，此方法易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。
三嗪类抗除草剂耐受型（TT）型油菜的分子检测方法不受环境和材料生长周期限制，可以在种子期完成检测鉴定，目前的TT型油菜的分子检测方法有：Southern杂交法[Wing et al. 1993] 、测序法[Michaela et al. 1993] 、PCR与MaeⅠ酶相结合的方法[Wing et al. 1993]、直接PCR法[翟文学等，1993 & Xin et al. 2006]、荧光PCR法[Peeret al. 2009]。Southern杂交法检测周期长、通量低；测序法准确率高，但检测周期长，检测效率和检测通量低，且费用也高；PCR与MaeⅠ酶相结合的方法检测过程较长通量低，MaeⅠ酶价格较高，检测性费用高；直接PCR技术快速便宜，但需要进行凝胶电泳检测，检测过程使用的核酸染料等试剂对环境及人体有危害，且自动化程度低检测通量小；荧光PCR通量略高于直接PCR法，但检测成本较高的问题。
因此，针对播种前就要完成成千上万份的大量油菜除草剂耐受性的鉴定，目前没有一种快速、高效、低成本、精准的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，可应用于种子材料的检测，能在播种前完成检测鉴定，利用自动化仪器检测通量高，一天内可完成上万份材料的检测，反应体系小成本低于现有的分子检测方法，实现快速、高效、低成本、精准检测鉴定三嗪类除草剂耐受型（TT）型油菜。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，包括以下步骤：
S1.DNA提取：从油菜种子或者叶片中提取基因组DNA；
S2.KASP引物合成：基于现有油菜品种基因的DNA序列，共获得SNP位点，开发出KASP引物；所述SNP位点是psbA基因第790位；
S3.KASP反应：将提取的DNA配制PCR反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型，包括TT型油菜、TS型油菜和TS/TT的杂合型；
S4.耐受型油菜的鉴别：其中TT型油菜和TS/TT的杂合型判断为耐受型油菜。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述KASP引物包括BN-TT.1和BN-TT.2；所述BN-TT.1和BN-TT.2均包括两条特异性引物和一条通用引物。
作为本发明的进一步改进，所述BN-TT.1的Primer_Allele X特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述BN-TT.1的Primer_Allele Y特异性引物的核苷酸序列如SEQID NO：2所示；所述BN-TT.1的通用引物Primer_C的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
作为本发明的进一步改进，所述BN-TT.2的Primer_Allele X特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述BN-TT.2的Primer_Allele Y特异性引物的核苷酸序列如SEQID NO：5所示；所述BN-TT.2的通用引物Primer_C的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述PCR反应体系如下：
100 μM Primer_Allele X：0.003μl；
100 μM Primer_Allele Y：0.0013μl；
100 μM Primer_C：0.0013μl；
2x KASP Master Mix：0.3945μl；
超纯水：补足至0.8μl。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述PCR扩增条件如下：94℃15min；94℃20s，65℃-57℃退火60s，10个循环，每个循环退火温度降低0.8℃；94℃20s，57℃60s，30个循环。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述不同的荧光信号检测中，如果样品PCR产物只检测到引物Primer_Allele X对应荧光信号，则检测位点为碱基A，判定待测材料为纯合不耐受型油菜；若只检测到引物Primer_Allele Y对应荧光信号，则检测位点为碱基G，判定待测材料为TT型油菜；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为A：G，判断待测材料为TS/TT的杂合型油菜。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述不同的荧光信号检测结果中，位于右下角的为TT型油菜，位于左上角的为TS型油菜，位于中间的为TS/TT的杂合型油菜。
作为本发明的进一步改进，KASP反应和验证用Array Tape系统进行，包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增反应的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
本发明具有如下有益效果：本发明针对目前检测通量低、成本高、污染环境的问题，利用KASP标记检测技术，开发检测psbA基因第790位（第264氨基酸）上碱基突变的分子标记，可应用于种子材料的检测，能在播种前完成检测鉴定，利用自动化仪器检测通量高，一天内可完成上万份材料的检测，反应体系小成本低于现有的分子检测方法，实现快速、高效、低成本、精准检测鉴定三嗪类除草剂耐受型（TT）型油菜。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别流程图；
图2为本发明实施例1中KASP引物检测结果示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
利用90份材料对油菜分子标记进行自然群体验证，证明本发明检测的标记可以用于耐受型油菜筛选和检测。
如图1所示。
1、DNA提取
采用CTAB法从油菜种子或者叶片中提取基因组DNA。
2、KASP引物设计
psbA基因的三嗪类除草剂耐受性位点位于该基因的第790位上，在耐受性材料中为G，在不耐受的材料中为A，并提供psbA基因的测序序列。根据序列信息进行引物设计，根据序列的正反义链各设计一组标记，得到2组标记，包括BN-TT.1和BN-TT.2，每组标记有三条引物，包括两条特异性引物Primer_Allele X和Primer_Allele Y和一条通用引物Primer_C，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物的核苷酸序列以及油菜标记信息见表1。
表1
Figure 235908DEST_PATH_IMAGE001
3、KASP反应
KASP引物的验证和检测用Douglas Scientific 的Array Tape系统进行。ArrayTape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
PCR扩增体系：用NEXAR进行PCR扩增体系的自动组装，PCR扩增体系如下表2所示。
表2： KASP检测的反应体系
Figure 359853DEST_PATH_IMAGE002
PCR扩增： PCR用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃ 15 分钟；94℃ 20秒，65℃-57℃ (每个循环退火温度降低0.8℃) 60秒，10个循环；94℃ 20秒，57℃ 60秒，30个循环。
信号扫描和基因型分型：PCR 反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。在KASP检测中，左下角为空白对照，样品的基因型分成3簇，分别为阳性簇、阴性簇、杂合簇（见图2）。其中阳性簇表示样品为TT型油菜（位于图形右下角），阴性簇表示样品为TS型油菜（位于图形左上角），杂合簇表示样品为TS/TT的杂合型（位于图形中间）
4、耐受型油菜的鉴别
结果见表3。在测试的90份油菜材料中，6份油菜材料在三嗪类除草剂耐受性关键位点检测结果为碱基G，为TT型油菜，54份材料为A是TS型油菜，30份材料为A：G是TT/TS杂合型油菜。利用BN-TT.1和BN-TT.2标记可以实现TT型油菜的快速检测和筛选，另外可用于三嗪类除草剂耐受性油菜育种应用中的分子辅助选择。
表3
序号 材料名称 三嗪类除草剂耐受性 BN-TT.1基因型 BN-TT.2基因型
1 Triton 耐 GG GG
2 83117 感 AA AA
3 A84 耐 GG GG
4 A85 耐 GG GG
5 A86 耐 GG GG
6 A87 耐 AG AG
7 A89 耐 AG AG
8 A90 耐 AG AG
9 A91 耐 GG GG
10 A92 耐 GG GG
11 A93 耐 AG AG
12 A97 耐 AG AG
13 A98 耐 AG AG
14 A100 耐 AG AG
15 A103 耐 AG AG
16 A104 耐 AG AG
17 A105 耐 AG AG
18 A106 耐 AG AG
19 A107 耐 AG AG
20 A108 耐 AG AG
21 SP3 耐 AG AG
22 SP4 耐 AG AG
23 SP5 耐 AG AG
24 SP6 耐 AG AG
25 SP7 耐 AG AG
26 SP8 耐 AG AG
27 SP9 耐 AG AG
28 SP10 耐 AG AG
29 SP11 耐 AG AG
30 SP12 耐 AG AG
31 SP13 耐 AG AG
32 SP14 耐 AG AG
33 SP15 耐 AG AG
34 SP16 耐 AG AG
35 SP17 耐 AG AG
36 SP18 耐 AG AG
37 SP19 耐 AG AG
38 RR37 感 AA AA
39 RR38 感 AA AA
40 RR39 感 AA AA
41 RR40 感 AA AA
42 RR41 感 AA AA
43 RR42 感 AA AA
44 RR43 感 AA AA
45 RR44 感 AA AA
46 RR45 感 AA AA
47 RR46 感 AA AA
48 RR47 感 AA AA
49 RR48 感 AA AA
50 RR49 感 AA AA
51 RR50 感 AA AA
52 RR51 感 AA AA
53 RR52 感 AA AA
54 RR53 感 AA AA
55 RR54 感 AA AA
56 RR55 感 AA AA
57 RR56 感 AA AA
58 RR57 感 AA AA
59 RR58 感 AA AA
60 RR59 感 AA AA
61 RR60 感 AA AA
62 RR61 感 AA AA
63 RR62 感 AA AA
64 RR63 感 AA AA
65 RR64 感 AA AA
66 RR65 感 AA AA
67 RR66 感 AA AA
68 RP5 感 AA AA
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73 RP10 感 AA AA
74 RP11 感 AA AA
75 RP12 感 AA AA
76 RP13 感 AA AA
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78 RP15 感 AA AA
79 RP16 感 AA AA
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81 RP18 感 AA AA
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84 RP21 感 AA AA
85 RP22 感 AA AA
86 RP23 感 AA AA
87 RP24 感 AA AA
88 RP25 感 AA AA
89 RP26 感 AA AA
90 RP27 感 AA AA
本发明利用KASP标记检测技术，开发检测psbA基因第790位（第264氨基酸）上碱基突变的分子标记，可应用于种子材料的检测，能在播种前完成检测鉴定，利用自动化仪器检测通量高，一天内可完成上万份材料的检测，反应体系小成本低于现有的分子检测方法，实现快速、高效、低成本、精准检测鉴定三嗪类除草剂耐受型（TT）型油菜。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华智生物技术有限公司
<120> 一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgccgattga tcttccaata tgcta 45
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tccgattgat cttccaatat gctg 44
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 3
ggccaagccg ctaagaagaa atgta 25
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tagaaatgta aagaacgaga attgttgaaa ct 52
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tgaaatgtaa agaacgagaa ttgttgaaac c 51
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 6
tggccgattg atcttccaat atgc 24

Claims (9)

1.一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.DNA提取：从油菜种子或者叶片中提取基因组DNA；
S2.KASP引物合成：基于现有油菜品种基因的DNA序列，共获得SNP位点，开发出KASP引物；所述SNP位点是psbA基因第790位；
S3.KASP反应：将提取的DNA配制PCR反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型，包括TT型油菜、TS型油菜和TS/TT的杂合型；
S4.耐受型油菜的鉴别：其中TT型油菜和TS/TT的杂合型判断为耐受型油菜。
2.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，其特征在于，步骤S2中所述KASP引物包括BN-TT.1和BN-TT.2；所述BN-TT.1和BN-TT.2均包括两条特异性引物和一条通用引物。
3.根据权利要求2所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，所述BN-TT.1的Primer_Allele X特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述BN-TT.1的Primer_Allele Y特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述BN-TT.1的通用引物Primer_C的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求2所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，所述BN-TT.2的Primer_Allele X特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述BN-TT.2的Primer_Allele Y特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述BN-TT.2的通用引物Primer_C的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
5.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述PCR反应体系如下：
100 μM Primer_Allele X：0.003μl；
100 μM Primer_Allele Y：0.0013μl；
100 μM Primer_C：0.0013μl；
2x KASP Master Mix：0.3945μl；
超纯水：补足至0.8μl。
6.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述PCR扩增条件如下：94℃15min；94℃ 20s，65℃-57℃退火60s，10个循环，每个循环退火温度降低0.8℃；94℃20s，57℃60s，30个循环。
7.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述不同的荧光信号检测中，如果样品PCR产物只检测到引物Primer_Allele X对应荧光信号，则检测位点为碱基A，判定待测材料为纯合不耐受型油菜；若只检测到引物Primer_Allele Y对应荧光信号，则检测位点为碱基G，判定待测材料为TT型油菜；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为A：G，判断待测材料为TS/TT的杂合型油菜。
8.根据权利要求7所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述不同的荧光信号检测结果中，位于右下角的为TT型油菜，位于左上角的为TS型油菜，位于中间的为TS/TT的杂合型油菜。
9.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，KASP反应和验证用Array Tape系统进行，包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增反应的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106119369A (zh) * 2016-07-04 2016-11-16 山东省农业科学院植物保护研究所 抗光系统ⅱ抑制剂类除草剂马唐的pcr检测方法
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CN112458199A (zh) * 2020-12-24 2021-03-09 华智生物技术有限公司 一种水稻耐盐基因skc1的snp分子标记及其应用

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Title
刘忠松等: "抗除草剂油菜研究及其进展", 《作物研究》 *

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