CN117265167A - 与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点s08_40145372及其kasp标记、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子遗传育种技术领域,具体为与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372及其KASP标记、应用,以对在大田条件下抗倒伏特性实现辅助选择作用,能够加快大豆耐密植抗倒伏育种的遗传改良进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传育种技术领域,具体涉及与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372及其KASP标记、应用。
背景技术
植株倒伏在大豆生产过程中普遍发生,不仅对大豆高产、稳产和优质产生不良影响,同时也给机械化收割带来困难。大豆植株倒伏后,破坏群体空间结构、影响植株通风透气与光合作用,导致营养物质、光合产物的分配模式发生改变,荚数、粒数和粒重显著减少,造成产量下降。植株倒伏后与地面接触,更易受病菌、害虫侵害,加之营养物质和光合产物分配失调,造成籽粒皱缩、蛋白质和脂肪含量下降,部分豆荚直接接触地面或浸在水中而引致发芽或霉变,严重影响大豆籽粒的外观和内在品质。
选育和应用抗倒伏大豆新品种是增加种植密度、防止植株倒伏发生、提升大豆产量的根本措施之一。传统耐密抗倒伏大豆育种是根据育种后代抗倒伏指数进行的单株选择,这种方式不仅费时耗力而且易受环境干扰准确性不高。利用目标基因存在的碱基差异,开发特异性分子标记进行辅助选择是提高抗倒伏大豆后代选择效率的最佳方法。分子标记在作物育种中具有早期选择、不受环境影响以及准确、快速、高效的优势,已成为一种准确、高效的工具。其中,竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)是建立在等位基因特异性扩增(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)和高灵敏度的荧光检测基础之上的一种新型单核苷酸突变位点分型方法。其原理是针对等位基因单核苷酸突变位点位点设计两个正向引物和一个通用反向引物,每条正向引物都有特异性序列,可与不同荧光标记结合。带有与不同荧光结合序列的正向引物与通用反向引物PCR扩增样品的DNA,其等位变异就可以通过不同的荧光信号得以反映。
大豆倒伏是受气候、生态、栽培措施和遗传等因素共同调控的复杂性状,遗传特性较为复杂。大豆倒伏受环境影响严重,性状遗传不稳定且描述和统计难度大,目前对大豆抗倒伏性状的基因位点定位研究较少。由于与株高、结荚习性、茎秆强度和粗细等性状有关的基因均与大豆抗倒伏性紧密关联,这也导致现已定位的大豆抗倒伏基因区间较大,未能准确定位。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372及其KASP标记、应用。
与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372位于大豆基因组v4.0的8号染色体40,145,372bp位置,发生了碱基G至A的转换。
KASP标记,KASP标记包含所述的单核苷酸突变位点S08_40145372,所述KASP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的,所述KASP分子标记的引物序列为:
上游引物F1:5’-gaaggtgaccaagttcatgctgttgtcggcaaattccacatttttcta-3’;
上游引物F2:5’-gaaggtcggagtcaacggattgttgtcggcaaattccacatttttctg-3’;
下游引物R:5’-tacaatctcaaatgtgtgattgtggtga-3’。
所述的与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372在大豆耐密抗倒伏性状的辅助选择育种中的应用。
所述的KASP分子标记在大豆耐密抗倒伏性状的辅助选择育种中的应用。
优选的,大豆耐密抗倒伏性状辅助选择育种的步骤,包括以下步骤:
(6.1)提取大豆植株基因组DNA;
(6.2)以(6.1)提取的DNA为模板,采用所述KASP分子标记的引物进行PCR扩增,得到PCR产物;
(6.3)根据PCR产物判断单核苷酸突变位点基因型;
(6.4)根据基因型在不同分离世代选择得到大豆抗倒伏单株或株系。
优选的,(6.2)中PCR反应体系:20ng/μL的大豆样品DNA模板,2μL;2×KASPMastermix,5μL;KASPAssayMix为,F1:F2:R=2:2:5,0.14μL;水2.9μL。PCR循环反应程序设置如下:94℃预变性15min;94℃变性20sec,61~55℃复性/延伸1min,每一个循环降低0.6℃,10个循环;94℃变性20sec,55℃复性/延伸1min,26个循环;30℃荧光读取1min。
优选的,(6.4)中基因型为AA的大豆为耐密抗倒伏大豆株。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明开发出与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点及KASP标记,并证明KASP标记在具有代表性的139份微核心种质资源中与两年三地点鉴定的抗倒伏特性显著相关。
本发明中开发的KASP可以对在大田条件下抗倒伏特性实现辅助选择作用,能够加快大豆耐密植抗倒伏育种的遗传改良进程,这对提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
鉴于抗倒伏指数能将多个与倒伏相关的性状的通过表型值计算得到累加和放大,以此定位到的基因位点对大豆抗倒伏性状变异的解释率高、年份间地点间重演性好。全基因组关联分析是基于控制性状的遗传位点与单核苷酸突变位点为分子标记间的连锁不平衡来进行基因定位的方法,能够快速鉴定与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点。因此,基于鉴定的与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点,开发与大豆抗倒伏指数紧密连锁的KASP标记,实现大豆植株抗倒伏性状基因型的低世代分子辅助选择,这对于减少表型鉴定工作量、提高抗倒伏后代株系的选择效率、缩短育种年限、加速世代进程均具有显著的作用。
附图说明
图1为不同环境下大豆种质资源抗倒伏指数表型性状分布结果;
图2为大豆抗倒伏指数性状全基因组关联分析曼哈顿图;
图3为KASP标记对不同大豆种质资源的基因分型结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
所用大豆的来源如下:东农42E、公2029-30、公P06-9、公P07-22-1-3、公野03-7239、哈1号、合农114、合农76、合农85、合农93、合农97、黑科57、黑农61、黑农62、黑农69、黑农85、黑农98、华力1号、吉密豆2号、吉育109、吉育39、垦农4号、龙豆4号、龙黑大豆2号、绥农22、绥农26、长农21、吉育97、吉育203、欧科豆25、公2002-339-2、AsgrowA1939、L73-105、Saikai 20、SB8842、Tokachi nagaha、东农63-1、公93155-13、公P06-31-1-3、黑龙芽豆1号、黑农39、黑农43、黑农52、黑农71、黑农88、九农21、龙黄1号、绥农52、烟黄3号、吉育441、吉育76、雁育1号、1130-2、OACAvatar、OACWallace、Suzuhime、东农42A、东农42C、东农57、公交0817-17、公野04L-141、合05648、黑科58、黑科59、黑农205、黑农51、黑农54、黑农64、黑农66、黑农81、黑农86、黑农87、吉大豆1号、吉林32、吉林35、吉林小粒1号、吉密豆3号、吉农81、吉育101、吉育256、吉育302、吉育309、吉育310、吉育341、吉育406、吉育75、吉育77、吉育83、龙豆1号、龙黄5号、龙品10-217、绥农36、绥农43、绥农77、长农16、浙春3号、中龙606、中龙608、吉育266、H242STSRR、Harosoy、MN1900、OAC Talbot、POLUKULTURNAYA-2、S14-130-2、Titan、东泽11、公95165-3、公P04-1-28、黑龙芽豆2号、黑农58、黑农83、黑农89、黑农93、吉黑6号、吉林3号、吉育105、吉育308、吉育331、吉育332、吉育404、吉育71、冀豆15、龙品12-328、绥黑大豆1号、沃豆1号、公P06-13、吉育100、9234、Century-lx1.3、CHESTNUT、Corsoy、Harwood、Maple arrow、OACstrive、Ohio、P06-16-1-1、Provar、T316共139份大豆品种(系),保存在吉林省农业科学院大豆研究所公主岭试验基地的低温种质储藏库。
实施例1
获得大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点
(1)抗倒伏指数的测定:将139份有代表性的大豆品种(系)种植在六个环境条件下,分别为2021年蛟河、2021年敦化、2021年汪清、2022年蛟河、2022年敦化、2022年汪清,成熟期时每个田间试验小区随时取10株,测定茎秆强度、株高、茎秆干重,然后计算抗倒伏指数。
139份大豆品种(系)的抗倒伏指数在6个环境下频数分布情况见图1,各抗倒伏指数均呈连续性变异且正态分布,表明抗倒伏指数这一表型性状为多基因控制数量性状,适合进行全基因组关联分析。
(2)DNA提取及高通量测序:采用苯酚抽提法,从139份大豆品种(系)的叶片中提取基因组DNA,进行30×全基因组重测序。
(3)全基因组关联分析:在Linux系统中利用GAPIT进行全基因组关联分析,计算模型为改进版压缩式混合线性模型(ECMLM),全基因组关联分析检测到与抗倒伏指数关联的单核苷酸位点S08_40145372位于8号染色体,如图2所示,该单核苷酸突变位点所处的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,具体为:gttgtcggcaaattccacatttttctactttctcgttcattttcgtcttcgttcatctcagtatgaatgtgagttaaaatc ggacaacccttctctttctccttgcatcaggatcccactaatctccttcatattcttgttacattaattcatgtgacagtaaacca aatgagttgtcatagacgtgcaaaatgtgttataaggcgaatagcggcggacacatagttcatgtggtcaacattgacag atttacaagcagccatgatgtgagaacagaagaagtgtttagcctaatattcaccacaatcacacatttgagattgta,对139份大豆种质的抗倒伏表型变异解释率变幅高达15.83%。
实施例2
开发KASP标记引物
利用Primer3 Plus在线引物设计网站(http://www.primer3 plus.com/),依据SEQ ID NO.1序列设计三个引物构成KASP标记的引物,KASP标记的引物为上游引物F1、上游引物F2和下游引物R,其中F1和F2分别包含FAM和HEX荧光接头序列,引物3’末端为等位变异碱基,5’端连接英国LGC(Laboratory of the Government Chemist)公司KASP反应试剂特定的羧基荧光素和六氯荧光素氨基磷酸酯荧光接头序列,具体为正向引物F1的5’端加上羧基荧光素的荧光信号标签,为引物下划线部分;正向引物F2的5’端加上六氯荧光素氨基磷酸酯的荧光信号标签,为引物下划线部分,核苷酸序列如下:
上游引物F1:5’-gaaggtgaccaagttcatgctgttgtcggcaaattccacatttttcta-3’,记为SEQ ID NO.2;
上游引物F2:5’-gaaggtcggagtcaacggattgttgtcggcaaattccacatttttctg-3’,记为SEQ ID NO.3;
下游引物R:5’-tacaatctcaaatgtgtgattgtggtga-3’,记为SEQ ID NO.4。
实施例3
检测不同大豆品种(系)的基因型
(1)提取139份大豆植株基因组DNA
(2)PCR扩增
以基因组DNA为模板,并设置1个以超纯水代替样品模版DNA的空白对照,均采用KASP标记的引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
PCR反应体系:20ng/μL的大豆样品DNA模板,2μL;2×KASP Master mix,5μL;KASPAssay Mix为,F1:F2:R=2:2:5,0.14μL;水2.9μL。
PCR循环反应程序设置如下:94℃预变性15min;94℃变性20sec,61~55℃复性/延伸1min,每一个循环降低0.6℃,10个循环;94℃变性20sec,55℃复性/延伸1min,26个循环;30℃荧光读取1min。若数据对应的荧光信号较低,分群较散,则增加循环后进行荧光读取,程序设置如下:94℃变性20sec,57℃复性/延伸1min,3个循环;30℃荧光读取1min。
(3)对PCR反应产物进行荧光数据读取判断单核苷酸突变位点基因型
反应完成后,使用Light Cycler实时荧光定量PCR仪直接对PCR反应产物进行荧光数据读取,荧光扫描的结果会自动转化成图形,如图3所示。S08_40145372的KASP分子标记引物可以清楚的将两种基因型分开,其中靠近Y轴的圆点为携带G等位变异位点,基因型为GG;靠近X轴的圆点为携带A等位变异位点,基因型为AA。
实施例4
根据实施例3的方法判断大豆材料的基因型,根据抗倒伏大豆的基因型在不同分离世代选择得到大豆抗倒伏单株或株系,即选择基因型为AA的大豆抗倒伏单株或株系。
利用KASP标记,对139份大豆材料进行基因型检测,检测结果见表1。共有26份材料在S08_40145372基因位点有G等位变异,平均抗倒指数是2.41。
表1S08_40145372基因位点的等位变异特性
需要说明的是,本发明权利要求书中涉及数值范围时,应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用,为了防止赘述,本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372,其特征在于,与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372位于大豆基因组v4.0的8号染色体40,145,372bp位置,发生了碱基G至A的转换。
2.KASP分子标记,其特征在于,KASP分子标记包含所述的单核苷酸突变位点S08_40145372,所述KASP分子标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的KASP分子标记,其特征在于,所述KASP分子标记的引物序列为:
上游引物F1:5’-gaaggtgaccaagttcatgctgttgtcggcaaattccacatttttcta-3’;
上游引物F2:5’-gaaggtcggagtcaacggattgttgtcggcaaattccacatttttctg-3’;
下游引物R:5’-tacaatctcaaatgtgtgattgtggtga-3’。
4.权利要求1所述的与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372在大豆耐密抗倒伏性状的辅助选择育种中的应用。
5.权利要求2所述的KASP分子标记在大豆耐密抗倒伏性状的辅助选择育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的KASP分子标记在大豆耐密抗倒伏性状的辅助选择育种中的应用,其特征在于,大豆耐密抗倒伏性状辅助选择育种的步骤,包括以下步骤:
提取大豆植株基因组DNA;
以提取的DNA为模板,采用所述KASP分子标记的引物进行PCR扩增,得到PCR产物;
根据PCR产物判断单核苷酸突变位点基因型;
根据基因型在不同分离世代选择得到大豆抗倒伏单株或株系。
7.根据权利要求6所述的与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372的KASP分子标记在大豆耐密抗倒伏性状的辅助选择育种中的应用,其特征在于,PCR反应体系:20ng/μL的大豆样品DNA模板,2μL;2×KASP Mastermix,5μL;KASPAssayMix为,F1:F2:R=2:2:5,0.14μL;水2.9μL。PCR循环反应程序设置如下:94℃预变性15min;94℃变性20sec,61~55℃复性/延伸1min,每一个循环降低0.6℃,10个循环;94℃变性20sec,55℃复性/延伸1min,26个循环;30℃荧光读取1min。
8.根据权利要求6所述的与大豆抗倒伏指数关联的单核苷酸突变位点S08_40145372的KASP分子标记在大豆耐密抗倒伏性状的辅助选择育种中的应用,其特征在于,基因型为AA的大豆为耐密抗倒伏大豆株。
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王志新;郭泰;吴秀红;郑伟;李灿东;张振宇;刘忠堂;张茂明;: "早熟高产抗病耐密大豆合丰51号选育", 中国种业, no. 02, 15 February 2012 (2012-02-15), pages 42 - 43 * |
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