CN114106111B - 一种高黏附力多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高黏附力多肽及其用途。其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明高黏附力多肽黏附力均值大致在4000‑4500pN范围内，剥离强度约2.2‑2.5MPa，已经达到了常规化学粘合剂的粘接强度，且其在水中黏附力并不降低，这相比于传统化学粘合剂来说，其优势非常显著。本发明的高黏附力多肽可用水溶剂溶解后制备常规粘合剂，也可利用有机溶剂溶解多肽后，制备水下使用的粘合剂，可用界面包括但不限于玻璃、钢、塑料等。

Description

一种高黏附力多肽及其用途
技术领域
本发明属于生物黏合材料领域，具体涉及一种高黏附力多肽及其用途。
背景技术
自然界存在很多种基于蛋白质的粘合剂，其水下黏附性能有许多相关研究。黏附蛋白通常富含儿茶酚，具有亲合性和离子性。这种特征组合构成超分子工具箱，以提供对粘合剂的刺激-响应处理，以确保对各种表面的强黏附性，并控制材料的粘结性能。研究人员通过对多功能相互作用中所使用的胶粘剂分泌的沙堡蠕虫和贻贝进行了探索。然后将这些生物学原理放在更广阔的视野中，总结了基于不同类型超分子相互作用的合成粘合剂体系。可用于设计新的粘合剂。
海洋生物开发的胶粘剂是近二十年来大量研究的热点。这些生物能够利用蛋白质基粘合剂在水下粘接材料：藤壶使用分泌物将钙质底板粘到岩石上，贻贝使用一个螺纹网将软无脊椎动物的身体附着在坚硬的表面上，沙棘蠕虫和石竹幼虫都聚集在一起。一种保护性的管状壳，通过将沙粒或石子粘合在一起。从自然界生物中提取相关蛋白存在产量低、分离纯化困难等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于仿生生物学原理设计的黏附性多肽及其用途。
本发明基于贻贝、沙堡蠕虫等海洋生物的天然粘附机理，通过生物信息学分析进行设计、多肽固相合成法进行合成及运用原子力显微镜对肽段的测试分析筛选，获得一种具有高黏附力的多肽。
一种高黏附力多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1所示的序列中包含Gly Tyr Gly Tyr Gly和Gly Ala Lys Lys的重复序列，且其中Tyr需进行羟基化修饰为L-DOPA。
使用该多肽时，用PBS或DMSO溶解。
所述的多肽在制备粘接剂中的应用。
利用溶剂溶解所述多肽后，直接在空气中或水下进行粘合剂的涂抹，并进行两个界面的粘接操作。
所述多肽可利用固相合成方法进行合成，多肽纯度应大于90％。
利用化学方法将多肽共价修饰到原子力显微镜探针尖端，通过与氮化硅片进行接触敲击，结果显示相对于未修饰探针或对照蛋白修饰探针，本发明的多肽修饰探针具有高数倍的黏附力。
所述多肽用水溶剂溶解后用于制备常规粘合剂，也可利用有机溶剂溶解后，制备水下使用的粘合剂，可用界面包括但不限于玻璃、钢、塑料等。
本发明的有益效果：本发明高黏附力多肽的探针黏附力均值大致在4000-4500pN范围内，探针尖端为约40nm直径的球面，可通过压强公式P＝F/S计算得出，剥离强度约2.2-2.5MPa，已经达到了常规化学粘合剂的粘接强度，且其在水中黏附力并不降低，这相比于传统化学粘合剂来说，其优势非常显著。
附图说明
图1为用NanoScope软件分析对照组最大黏附力。
图2为用NanoScope软件分析修饰多肽组最大黏附力。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1：多肽的固相合成
1、溶剂的处理
DMF、甲醇在使用前用G3孔的分子筛浸泡过夜除杂质和水。
2、树脂的充分溶胀
称取2.0g空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入15mL DMF，室温活化30min左右。
3、接第一个氨基酸
室温下，通过沙芯抽滤掉上步溶剂，加入1mmol 5倍摩尔过量的C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的DIC，DMF做溶剂室温反应3h。反应完毕用DMF洗5次，每次5mL。再加入体积比为1:1的适量吡啶和乙酸酐，反应30min。反应完毕用DMF洗5次，每次5mL。(作用：封闭掉没有反应的空载树脂上的活性微点。)
4、Fmoc保护基的离去
抽滤去掉上步溶剂，将10mL20％的哌啶DMF溶液加入到树脂中，N2搅拌10min后滤出溶液，再加入10mL 20％的哌啶DMF溶液，N2吹动搅拌5min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5mL。
5、茚三酮检测脱除效果
取出少量树脂，用甲醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，108℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，说明脱除完全，即可进行下步反应；若呈无色，说明保护基没有脱除完全，则需要重复以上脱保护操作。
6、接第二个氨基酸及Fmoc保护基脱除
称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的HOBT于反应管中，加入适量DMF溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的(纯的)DIEA，室温反应40min，用DMF洗5次，每次5mL。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10mL 20％的哌啶DMF溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5mL。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
7、以此类推，重复6的步骤，直到合成到N端最后一个氨基酸，去掉Fmoc保护基，然后抽干，最终得到流沙状的树脂肽，H2N-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Gly-Ala-Lys-Lys-Gly-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Gly-Ala-Lys-Lys-Gly-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Gly-Ala-Lys-Lys-Gly—CTC Resin。
8、树脂的脱落及纯品分离检测
最后用三氟乙酸切割液(95％TFA：2％TIS：2％EDT：1％H2O)切割2h，抽滤反应液，得多肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气尽量吹干，再用乙醚沉淀，离心，然后用乙醚洗4次，得白色固体，用纯水溶解后，经HPLC脱盐提纯，冻干后析出晶体，取少量MS分析。
实施例2：多肽黏附力测试
1、原子力显微镜探针标记
将MLCT探针置于1mL食人鱼溶液中(H2O2:H2SO4体积比1:1)浸泡30min，随后用去离子水充分清洗后，氮气吹干；
将探针置于0.5％MPTMS的甲苯溶液中进行巯基化反应2h，再用甲苯充分清洗未反应的MPTMS，然后置于120℃烘箱中15min；
将探针置于1mL AB液中反应3h后，用DMSO充分清洗。(AB液配方为maleimide-PEG-NHS(500Da)和maleimide-PEG-methoxy(2000Da)以1：10混合后用DMSO溶解并稀释至1mg/mL的溶液)；
将探针置于含有0.2％三甲胺及0.5mg/mL的DBCO-胺的DMSO溶液中反应2h吗，用DMSO充分清洗后置于pH＝9的10mmol/L PBS溶液中4h；
将探针置于1mg/mL的上述多肽溶液中反应1h，最后用DMSO充分清洗探针并保存于pH＝6的PBS溶液中。
2、上机测定粘附力
检测使用的是布鲁克FastScan原子力显微镜，将仪器主机及控制电脑开机后，依次打开XY样品台控制器、白光光源、控制软件；将探针装入探针夹，再将探针夹装入探头后，调整XY光学镜，调节光学焦距，找到探头。在X-Y Stage显示器上显示出探针；
打开激光光源，调整激光束的XY方向，使之垂直照射在悬梁的探针前端；
调整反射镜，使控制软件Monitor Box窗口中的红点落在PSPD中心，并且使A+B＞2V，A-B＜500mV；
将云母片水平移动至探针下方，尽量在光斑最下方；
放好云母片后，先调光学焦点通过focus stage先找到探针，在向下调焦距，看清样品就停止，记录探针和工件的大体位置。再调整光学焦距，使焦点上移。通过细调按钮移动探针，使探针逼近工件，但不要移至光学焦点。
设置探针为力学测量模式，频率为1Hz，在5μm×5μm范围内多点测量，共测量600次，待测量完成后，用NanoScope软件分析最大黏附力(见附图1-2)，结果中明显可以看出，未修饰探针作为本底扣除后，修饰多肽的探针其黏附力均值大致在4000-4500pN范围内，探针尖端为约40nm直径的球面，可通过压强公式P＝F/S计算得出，剥离强度约2.2-2.5MPa，已经达到了常规化学粘合剂的粘接强度，且其在水中黏附力并不降低，这相比于传统化学粘合剂来说，其优势非常显著。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种高黏附力多肽及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Gly Tyr Gly Gly Ala Lys Lys Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Lys Lys Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Gly Ala Lys Lys Gly
            20                  25                  30

Claims (4)

1.一种高黏附力多肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述高黏附力多肽，其特征在于，使用该多肽时，用PBS或DMSO溶解。
3.权利要求1-2任一所述的多肽在制备粘接剂中的应用。
4.根据权利要求3所述多肽在制备粘接剂中的应用，其特征在于，利用溶剂溶解所述多肽后，直接在空气中或水下进行粘合剂的涂抹，并进行两个界面的粘接操作。
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