CN114099721A - 一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人免疫球蛋白灭活技术领域，具体涉及一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，以血浆为原料制备富集有免疫球蛋白的蛋白溶液，对所述蛋白溶液进行巴氏灭活，所述蛋白溶液中含有300～400g/l的山梨醇和终浓度为80～120g/l的甘氨酸，所述蛋白溶液的pH值为6.0～7.5，蛋白浓度为10～30g/L。本方案可以解决现有的巴氏灭活人免疫球蛋白工艺难以同时保证蛋白收率和质量的技术问题。本方案可以应用于人免疫球蛋白的生产和制备的实践操作中，简单易行，成本低廉，蛋白收率可达95％以上，具有极大的推广应用价值。

Description

一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺

技术领域

本发明涉及人免疫球蛋白灭活技术领域，具体涉及一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺。

背景技术

巴氏灭活是一种在国际上被认可的、安全性高的对病毒和其他生物体的灭活有效的方法，巴氏灭活通常是在高温条件下对蛋白质溶液进行连续加热10小时以上，灭活病毒。巴氏灭活方法只需控制温度和时间两个参数，操作容易、设备简单、利于放大和节约成本等优势。在病毒灭活的过程中温度很容易被监测，巴氏灭活对脂包膜病毒和非包膜病毒均有灭活作用，灭毒范围广，且易于实现。作为一种传统成熟的病毒灭活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的灭活。除了杀菌和灭活病毒外，巴氏灭活方法还能使制品中杂蛋白聚集沉淀，降低凝血激活物如活性的凝血因子Ⅺa、PKA水平，提高产品安全性。

在行业法规方面，国家一直强调生物制品/制剂的安全性，要求在整个生产过程至少包含两步及以上的病毒灭活/去除步骤。生物制品/制剂在制备过程中由于巴氏灭活稳定性差的问题，多采用S/D灭活、巴氏灭活、低pH孵放和纳米膜过滤等技术灭活/去除病毒。而S/D灭活法会残留S/D剂、低pH孵放法会造成球蛋白分子裂解、纳米膜过滤成本高昂，目前巴氏灭活已成为国际上通用的灭活病毒的方法，其安全性和有效性已经过多种产品的临床验证，也已经被国际上各类权威机构共同的认可。2010年，血液制品厂家OctapharmaPharmaceutika(奥地利维也纳)改变了静注人免疫球蛋白即

5％的制造工艺，改变后的生产工艺中不包含巴氏灭活工艺步骤，在临床上造成严重的血栓栓塞事件，并在同期召回了所有该批次在售产品。Dr.Marta Jose等在“Pasteurization inactivatesclotting enzymes during Flebogamma and Flebogamma DIF production”中指出，在静注人免疫球蛋白(pH4)生产工艺中巴氏灭活是去除促凝污染蛋白的关键步骤，能降低凝血因子至检测限以下。

虽然巴氏消毒法目前已成为一种广泛的血液制品病毒灭活方法，但仍然存在着一些局限性，球蛋白分子在溶液中加热时会聚集，形成多聚体，降低产品纯度，提高后续工艺纯化难度。在加热条件过程中还会导致蛋白质结构变化的，使蛋白质的活性降低、构想改变，从而影响巴氏灭活后的蛋白的收率。现有的球蛋白巴氏灭活生产工艺中，由于保护剂及制品参数的差异，球蛋白纯度不同，蛋白收率也不一样，收率约为40～70％。张南等在专利CN 103550780B(一种巴氏灭活静注人免疫球蛋白的蛋白质保护剂及其灭活方法)中也对球蛋白巴氏灭活方法进行了优化，但只考察了多聚体含量，没有综合考虑蛋白收率问题，多聚体可以在后期制品精纯时去除，但蛋白收率只能在这一步提高。在血液制品方面，原料是多人份的健康人血浆，通过低温乙醇法、离子交换色谱法或其他已知的方法，提纯和分离球蛋白。其原料来源的稀缺性，决定了在每一步的生产过程中都需尽力回收球蛋白，减少球蛋白损失，提高产品的质量。而且其巴氏灭活保护剂种类采用了四种物料，物料种类多，在后期产品纯化时难度大，如终产品不采用这几种物料作为保护剂还要考察其残留问题，影响产品安全性。专利中采用巴氏灭活pH为4.7～5.3，接近低pH条件，低pH条件是造成免疫球蛋白降解的主要原因，免疫球蛋白在低pH条件下，Ig分子二硫键会断裂为Fab和Fc段失去活性，影响产品的有效性。为了克服现有技术中的缺陷，亟需研发出一种能够同时保证人免疫球蛋白的收率和质量以及产品安全性的灭活工艺，以满足实际应用的需求。

发明内容

本发明意在提供一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，以解决现有的巴氏灭活人免疫球蛋白工艺难以同时保证蛋白收率和质量的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，以血浆为原料制备富集有免疫球蛋白的蛋白溶液，对所述蛋白溶液进行巴氏灭活，所述蛋白溶液中含有300～400g/l的山梨醇和80～120g/l的甘氨酸。

本方案的原理及优点是：

本发明提供了以醇类、氨基酸类组合物为保护剂的巴氏灭活条件，提高蛋白的收率和单体以及二聚体含量。其优点一是在于蛋白收率可以达到80％以上，如控制好保护剂的加量和灭活过程中的pH，收率可以达到95％以上，可提高至少三分之一的收率。二是制品灭活后外观澄清，减少后续工艺处理麻烦，节约资源和降低生产成本。三是巴氏灭活安全性和有效性不容置疑，因此提高产品的安全性。四是巴氏灭活工艺只需要简单的温度控制装置，设备成本低，验证简单有效。五是醇类和氨基酸类价格低廉，易于获得，不需从国外进口。

300～400g/l的山梨醇和80～120g/l的甘氨酸为保护剂的较为理想的组成条件，实验显示，在pH为7.4的条件下，在蛋白溶液中加入上述终浓度的两种物质，可以保证灭活后的蛋白溶液的收率为100％，且单体与二聚体含量在95％以上，详见实验例4的实验结果。发明人在研发之初，尝试了山梨醇、甘氨酸、麦芽糖和脯氨酸等物质，最终发现这些物质的单用效果不佳，又尝试了两两联用的技术方案，最终发现山梨醇和甘氨酸的组合效果最佳。探索过程详见实验例1-2，最终发现山梨醇和甘氨酸组成的保护剂组合在特定的浓度条件下能够取得较为理想的效果。

进一步，所述蛋白溶液的pH值为6.0～7.4。

在本技术方案中将蛋白溶液的pH值调整至6.0～7.4，可避免低pH条件造成免疫球蛋白降解。免疫球蛋白在低pH条件下，Ig分子二硫键会断裂为Fab和Fc段失去活性，影响产品的有效性。但是，由于pH值的升高，使得原来的保护剂组合物的效果变差，单体和二聚体含量以及收率都受到负面影响。但是，在pH值为6.0～7.4的条件下，将蛋白溶液中的保护剂组合调整至300～400g/l的山梨醇和80～120g/l的甘氨酸，可以避免由于pH提升带来的保护效果变差的现象。

进一步，所述蛋白溶液的蛋白浓度为10～30g/L。

发明人研究发现蛋白浓度对于本技术方案的保护在巴氏灭活中的功效具有显著影响。如果蛋白浓度过大，在中性pH值条件下，巴氏灭活后，蛋白溶液中人免疫球蛋白的收率以及单体和二聚体含量会受到负面影响，导致目的蛋白的总收率减少，实验结果详见实验例6。

进一步，所述巴氏灭活的条件为：温度60.0±0.5℃，时间10h。

上述巴氏灭活条件是现有技术中常规设置，可以有效杀灭病毒。

进一步，所述蛋白溶液中含有350g/l的山梨醇和终浓度为100g/l的甘氨酸。

上述保护剂的浓度为最佳选择，可以获得理想的蛋白收率和较高的单体和二聚体含量。

进一步，所述蛋白溶液的电导率为0.3～3.05mS/cm。

本方案的保护剂的使用，除了可以对人免疫球蛋白产生较为理想的保护效果，还可以克服电导率对于巴氏灭活的限制。特别是电导率在高达3.05mS/cm的情况下，经巴氏灭活之后单体和二聚体含量仍然可以高达96.63％。这样，待灭活的蛋白制品的电导率可以在较为宽泛的情况下进行巴氏灭活，克服了现有技术偏见的影响，不必将待灭活的蛋白制品的电导率特意调整至0.3ms/cm以下，使得操作步骤更为简单，提高了生产效率。

进一步，所述蛋白溶液由血浆的组分II经超滤后制得。

血液制品包括由健康的人血浆经分离和提纯制得的血浆蛋白的组分。按照结构和功能方面的不同,血液制品分为三大类,分别为白蛋白、免疫球蛋白和人凝血因子。从人血浆中分离纯化的血液制品具有纯度相对高、安全性好、生物活性强和稳定性较高的优点。其中，血浆组分II是目前国内外获取免疫球蛋白主要来源之一。血浆组分II经过超滤之后，杂质被除去，有利于后续生产流程的进行。

进一步，对血浆的组分II进行超滤的方法为：将组分II分散于水中，并调节pH值为4.3～4.7,获得待超滤溶液；然后使用50KD超滤机膜包浓缩待超滤溶液，获得浓缩溶液；最后对浓缩溶液进行等体积超滤处理，获得所述蛋白溶液。

采用上述超滤条件，可以高效地去除杂质，获得人免疫球蛋白纯度相对较高的蛋白溶液。

进一步，组分II与水的质量比为1：8～10；浓缩溶液中的蛋白含量为30～80g/L；等体积超滤处理使用水的体积为所述浓缩溶液的6～8倍。

采用上述的超滤技术参数，可以获得理想的除杂质效果。

进一步，血浆的组分II的制备方法为：将血浆离心后收集上清液A；调整上清液A的温度为-3.0～-1.0℃、蛋白浓度为40～65g/L、pH为6.80～7.30、电导率为12～14mS/cm、乙醇浓度为7～10vol.％，反应1～3h，压滤收集上清液B；调整上清液B的温度为-6.0～-4.0℃、蛋白浓度为30～45g/L、pH为5.70～6.30、电导率为5.0～8.0mS/cm、乙醇浓度为18～22vol.％，反应1～3h，压滤收集沉淀，获得组分II+III；在组分II+III中加入水溶解2～4h，水的质量为组分II+III的质量的8～10倍；控温0～5℃，加入磷酸缓冲液调整pH为4.6～5.0，反应1～2h；再加入磷酸缓冲液调整pH为5.0～5.4，反应1～2h；调整乙醇浓度为13～15vol.％，反应1～3h，压滤收集上清液C；调整上清液C温度为-12.0～-1.0℃，pH为7.0～7.4，加入终浓度为3～5g/L的氯化钠，终浓度为24～26vol.％的乙醇，反应1～3h，压滤收集沉淀，获得组分II。

上述方法为从血浆中分离制备血浆组分II的常规方法之一，可以获得富含有人免疫球蛋白的血浆组分II。

附图说明

图1为实验例1的各处理条件下巴氏灭活后制品的外观照片。

图2为实验例1的各处理条件下巴氏灭活后制品的单体与二聚体含量以及蛋白收率曲线图(pH＝5.0)。

图3为实验例1的各处理条件下巴氏灭活后制品的单体与二聚体含量以及蛋白收率曲线图(pH＝7.4)。

图4为实验例2的各处理条件下巴氏灭活后制品的外观照片。

图5为实验例2的各处理条件下巴氏灭活后制品的单体与二聚体含量以及蛋白收率曲线图(pH＝5.0)。

图6为实验例2的各处理条件下巴氏灭活后制品的单体与二聚体含量以及蛋白收率曲线图(pH＝7.4)。

图7为实验例3的pH值对巴氏灭活的影响曲线。

图8为实验例4的采用不同保护剂浓度时，巴氏灭活后制品的单体与二聚体含量以及蛋白收率曲线图(pH＝7.4)。

图9为实验例6的灭活病毒的动力学曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例

人免疫球蛋白的制备工艺流程包括：合并血浆，组分I沉淀分离、组分II+III沉淀分离、组分III沉淀分离、组分II沉淀分离、组分II沉淀溶解和超滤、巴氏灭活、精纯和配制分装。本方案主要在巴氏灭活步骤加入保护剂，以保证目的蛋白收率和含量。

1、原料血浆处理：原料血浆出库后，使用70～75vol.％乙醇溶液对血浆袋表面消毒，然后将血浆袋破袋，控制温度在0～4℃融化，融化后将血浆合并，使用离心机离心血浆(离心力为10000RCF)，收集上清液A。其中，原料血浆是血液离心去除细胞后的上清，含有蛋白质、无机盐和水等，不含血细胞。更具体地，原料血浆即《中国药典》中所指的人血浆：血液制品生产用人血浆系以单采血浆术采集的供生产血浆蛋白制品用的健康人血浆。

2、组分I沉淀分离：调整上清液A的温度为-3.0～-1.0℃、蛋白浓度为40～65g/L、pH为6.80～7.30、电导率为12～14mS/cm、乙醇(纯乙醇)体积百分浓度为7～10vol.％(终浓度)，反应1～3h，压滤收集上清液B。

3、组分II+III沉淀分离：调整上清液B的温度为-6.0～-4.0℃、蛋白浓度为30～45g/L、pH为5.70～6.30、电导率为5.0～8.0mS/cm、乙醇体积百分浓度为18～22vol.％，反应1～3h，压滤收集沉淀，即为组分II+III沉淀。

4、组分III沉淀分离：组分II+III沉淀中加入注射水溶解2～4h，注射水的质量为沉淀质量的8～10倍。控温0～5℃，加入磷酸缓冲液调整pH为4.6～5.0，反应1～2h；再加入磷酸缓冲液调整pH为5.0～5.4，反应1～2h；调整乙醇浓度为13～15vol.％，反应1～3h，压滤收集上清液C。

5、组分II沉淀分离：调整上清液C温度为-12.0～-1.0℃，pH为7.0～7.4，加入氯化钠，并使其终浓度为3～5g/L，加入乙醇，使其终浓度为24～26vol.％，反应1～3h，压滤收集沉淀，即为组分II沉淀。

6、超滤透析：在组分II沉淀中加入注射水溶解2～4h，注射水的质量为沉淀质量的8～10倍，然后使用滤芯过滤，使用1M醋酸或枸橼酸调节pH为4.3～4.7,获得待超滤溶液。使用50KD超滤机膜包浓缩待超滤溶液，使其蛋白质含量达到30～80g/L。然后使用6～8倍的水，进行等体积超滤处理(即加水的同时滤除水，使体积保持不变)，获得等体积超滤后滤液。

步骤1-6均为现有技术中收集人免疫球蛋白的常规方法，可以根据实际操作条件和要求，选择使用上述步骤中的技术参数，均可收集获得可供后续加工的物料，即等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)。

7、使用等体积超滤后滤液配制待灭活制品，待灭活制品中含有质量分数为30～40wt.％(1wt.％可换算为10g/L，下同)的山梨醇和质量分数为8～12wt.％的甘氨酸，并使用0.5M氢氧化钠调节待灭活制品的pH值为6.0～7.5。待灭活制品中的蛋白浓度为10～30g/L。完成上述配制之后，将待灭活制品打入灭活罐中，控制制品温度60.0±0.5℃，恒温10h。完成巴氏灭活之后，对灭活后的制品进行检测，具体过程如下：蛋白浓度采用双波长检测，分子大小分布采用2020版《中华人民共和国药典》通则3122方法检测，其结果为单体含量+二聚体含量。蛋白收率(％)＝灭活过滤后蛋白浓度/灭活前蛋白浓度×100％。

在巴氏灭活之后，再进行精纯步骤，以除去灭活后的制品中的多聚体等杂质。

实验例1：单一保护剂研究

通过上述1-6的步骤获得等体积超滤后滤液，具体的操作步骤为：

1、原料血浆处理：原料血浆出库后，使用75Vol.％乙醇溶液对血浆袋表面消毒，然后将血浆袋破袋，控制温度在0℃融化，融化后将血浆合并，使用离心机离心血浆(离心力为10000RCF)，收集上清液A。

2、组分I沉淀分离：调整上清液A的温度为-3.0℃、蛋白浓度为65g/L、pH为7.30、电导率为14mS/cm、乙醇(纯乙醇)体积百分浓度为10vol.％(终浓度)，反应3h，压滤收集上清液B。

3、组分II+III沉淀分离：调整上清液B的温度为-6.0℃、蛋白浓度为30g/L、pH为6.30、电导率为8.0mS/cm、乙醇体积百分浓度为18vol.％，反应3h，压滤收集沉淀，即为组分II+III沉淀。

4、组分III沉淀分离：组分II+III沉淀中加入注射水溶解4h，注射水的质量为沉淀质量的8倍。控温5℃，加入磷酸缓冲液调整pH为4.6，反应2h；再加入磷酸缓冲液调整pH为5.0，反应2h；调整乙醇浓度为13vol.％，反应2h，压滤收集上清液C。

5、组分II沉淀分离：调整上清液C温度为-1.0℃，pH为7.0，加入氯化钠，并使其终浓度为5g/l，加入乙醇，使其终浓度为24vol.％，反应3h，压滤收集沉淀，即为组分II沉淀。

6、超滤透析：在组分II沉淀中加入注射水溶解2h，注射水的质量为沉淀质量的10倍，然后使用滤芯过滤，使用1M醋酸或枸橼酸调节pH为4.3,获得待超滤溶液。使用50KD超滤机膜包浓缩待超滤溶液，使其蛋白质含量达到80g/L。然后使用8倍的水，进行等体积超滤处理(即加水的同时滤除水，使体积保持不变)，获得等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)。

对获得的等体积超滤后滤液进行巴氏灭活，将其等分为8份，分别加入33wt.％山梨醇(即山梨醇的浓度为330g/L，1wt.％换算为10g/L，下同)、10wt.％甘氨酸、10wt.％麦芽糖、3wt.％脯氨酸，再分别调节用1.0mol/l枸橼酸或者0.5mol/l NaOH调节pH至5.0和7.4,补加注射用水至蛋白含量20g/l，获得6份待灭活制品。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温，获得灭活后的制品，对其进行检测，结果参见表1、图1、图2和图3。在图1中1的处理条件为山梨醇33wt.％+pH5.0；2的处理条件为山梨醇33wt.％+pH 7.4；3的处理条件为甘氨酸10wt.％+pH 5.0；4的处理条件为甘氨酸10wt.％+pH 7.4；5的处理条件为麦芽糖10wt.％+pH 5.0；6的处理条件为麦芽糖10wt.％+pH 7.4。由图像可知，pH值过高会导致巴氏灭活之后的制品澄清度较差。

表1：单一保护剂巴氏灭活后检测结果

在pH5.0时进行灭活，制品外观较澄清，不同保护剂条件下蛋白收率都接近100％，但是分子大小分布较差，只有山梨醇的单体与二聚体含量能达到80％以上；在pH7.40时进行灭活，制品能看到明显的沉淀和析出，山梨醇收率和分子大小分布都能达到80％以上，其它保护剂灭活时虽然分子大小分布较好，但蛋白收率都比较低。

实验例2：保护剂组合研究

按照实验例1的方法制备等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)，将蛋白溶液平均分为6份，分别采用山梨醇、甘氨酸、麦芽糖进行两两组合，再分别调节用1.0mol/l枸橼酸或者0.5mol/l NaOH调节pH至5.0±0.05和7.4±0.05,补加注射用水至蛋白含量为20g/l。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温。对灭活后的产品进行检测，检测结果参见表2、图4、图5和图6。在图1中1的处理条件为山梨醇33wt.％+甘氨酸10wt.％+pH 5.0；2的处理条件为山梨醇33wt.％+甘氨酸10wt.％+pH 7.4；3的处理条件为麦芽糖10wt.％+甘氨酸10wt.％+pH 5.0；4的处理条件为麦芽糖10wt.％+甘氨酸10wt.％+pH 7.4；5的处理条件为山梨醇33wt.％+麦芽糖10wt.％+pH 5.0；6的处理条件为山梨醇33wt.％+麦芽糖10wt.％+pH 7.4。由实验结果可知，有山梨醇存在时，蛋白收率与分子大小分布都比较高。而麦芽糖与甘氨酸的组合保护剂在巴氏灭活时效果最差，山梨醇+甘氨酸优于山梨醇+麦芽糖巴氏灭活时效果，最终选用山梨醇+甘氨酸作为最优组合保护剂。

表2：不同保护剂以及不同pH巴氏灭活后检测结果

实验例3：pH值对使用保护剂时巴氏灭活的影响

按照实验例1的方法制备等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)，将蛋白溶液平均分为5份，按配制体积加入山梨醇33wt.％+甘氨酸10wt.％，再分别用1.0mol/l枸橼酸或者0.5mol/l NaOH调节pH至4.6～7.4,补加注射用水至蛋白含量20g/l。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温，获得灭活后的制品，对其进行检测，结果参见表3和图7。由实验结果可知，在选用33wt.％山梨醇+10wt.％甘氨酸作为保护剂，通过考察pH4.60～7.40条件下巴氏灭活后制品蛋白收率及分子大小分布。随着pH的升高，pH在4.60～6.0之间，分子大小分布都在90％，进一步提高pH至6.0～7.40时，分子大小分布能提高到95％以上，而蛋白收率都能达到100％。因此巴氏灭活时pH6.0～7.50，选用33wt.％山梨醇+10wt.％甘氨酸保护剂能使蛋白收率达到100％，而分子大小分布达到95％。

表3：不同pH巴氏灭活后检测结果

实验例4：保护剂含量对巴氏灭活效果的影响

按照实验例1的方法制备等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)，将蛋白溶液平均分配，加入不同浓度山梨醇+甘氨酸，再分别调节用1.0mol/l枸橼酸或者0.5mol/lNaOH调节pH至7.4,补加注射用水至蛋白含量20g/l。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温，获得灭活后的制品，对其进行检测，结果参见表4和图8。由实验结果可知，山梨醇含量30wt.％～40wt.％(即300～400g/L)、甘氨酸含量8wt.％～12wt.％(即80～120g/L)，单体与二聚体含量稳定，收率都达到100％。

表4：pH7.4以及不同保护剂浓度条件下巴氏灭活后检测结果

实验例5：电导率对使用保护剂时巴氏灭活的效果的影响

按照实验例1的方法制备等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)，将蛋白溶液平均分配，加入不同浓度山梨醇+甘氨酸，再分别调节用1.0mol/l枸橼酸或者0.5mol/lNaOH调节pH至7.4,补加注射用水至蛋白含量20g/l，并使用2mol/L氯化钠溶液调节电导率至表5中的水平。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温，获得灭活后的制品，对其进行检测，实验结果如表5所示。

王焰等在《IVIG巴氏灭活的最佳条件》中指出，在无保护剂条件下，电导值低于0.3ms/cm时巴氏灭活效果最佳。但是，在本技术方案中，我们考察了蛋白溶液的电导率较高的情况下，巴氏灭活的效果。由表5可知，在有100g/L甘氨酸和350g/L或400g/L山梨醇保护剂存在、pH7.4条件下进行巴氏灭活时，高电导率不影响制品的单体与二聚体的含量。也就是说，本方案的保护剂的使用，除了可以对人免疫球蛋白产生较为理想的保护效果，还可以克服电导率对于巴氏灭活的限制。特别是电导率在高达3.05mS/cm的情况下，单体和二聚体含量仍然可以高达96.63％。这样，待灭活的蛋白制品的电导率可以在较为宽泛的情况下进行巴氏灭活，克服了现有技术偏见的影响，不必将待灭活的蛋白制品的电导率特意调整至0.3ms/cm以下，使得操作步骤更为简单，提高了生产效率。

表5：不同电导率下巴氏灭活检测结果

实验例6：蛋白浓度对使用保护剂时巴氏灭活效果的影响

按照实验例1的方法制备等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)，将蛋白溶液平均分配，加入不同浓度山梨醇+甘氨酸(参见表6中数值)，再分别调节用1.0mol/l枸橼酸或者0.5mol/l NaOH调节pH至表6中对应数值,补加注射用水至蛋白含量至表6中对应数值。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温，获得灭活后的制品，对其进行检测，结果参见表6。编号1采用了本技术方案的保护剂(300～400g/l的山梨醇和80～120g/l的甘氨酸)，并将pH值和蛋白含量控制在6.0～7.5和10～30g/L，蛋白收率达到了100％，单体和二聚体含量达到了97％。而在编号2的实验中，蛋白含量较高(35g/L)，山梨醇含量过低(200g/l)，在pH值为7.4的情况下，蛋白收率很低，单体和二聚体含量也不理想，获得的人免疫球蛋白的总量少。在编号3的实验中，蛋白含量较高(50g/L)，山梨醇含量非常低(100g/l)，在pH值为7.4的情况下，蛋白收率较低，单体和二聚体含量也不理想，获得的人免疫球蛋白的总量少。这说明，过高的蛋白含量和过低的山梨醇水平，在pH值为7.4的条件下，不利于提升人免疫球蛋白的总量。低pH条件是造成免疫球蛋白降解的主要原因，为了避免使用巴氏灭活的低pH值条件(例如：4.7～5.3)，在上调pH值的时候，需要注意控制蛋白含量以及山梨醇水平，才能收获总量较高的人免疫球蛋白。

表6：不同处理条件下巴氏灭活后检测结果

实验例7：病毒灭活效率研究

按照实验例1的方法制备等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)，按蛋白含量19～50g/l计算配制体，按配制体积加入终浓度为300～400g/l的山梨醇(即30-40wt.％)、终浓度为80～120g/l的甘氨酸(即8-12wt.％)，再分别调节用1.0mol/l醋酸或者0.5mol/lNaOH调节pH至6.0～7.5,补加注射用水至蛋白含量配制体积。在本实验例中具体采用如下条件：按蛋白含量20g/l计算配制体，按配制体积加入终浓度为350g/l的山梨醇、终浓度为100g/l的甘氨酸，再调节pH至7.0。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温。取灭活前样品，按照样品与病毒比例为9:1加入Sindbis病毒混匀，置于60±0.5℃恒温水浴锅内水浴加热10h，分别在0、1、2、3、5、8、10h各取样2ml用于病毒滴度检测，取样后立即检测或放置-70℃保存。采用96孔细胞培养板检测病毒，并通过Karber法计算病毒检测结果，实验结果参见表7和图9。《血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则》规定经过病毒挑战性试验后，病毒降低量≥4LgTCID₅₀/0.1ml可认定灭活病毒方法有效。本次病毒灭活可使病毒降低量≥4LgTCID₅₀/0.1ml，因此山梨醇+甘氨酸工艺不影响巴氏灭活病毒灭活效果，灭活方法有效。

表7：球蛋白巴氏灭活法灭活Sindbis病毒效果

实验例8：杂蛋白清除效果研究

按照实验例1的方法制备等体积超滤后滤液(此处可称为蛋白溶液)，按蛋白含量19～50g/l计算配制体，按配制体积加入终浓度为300～400g/l的山梨醇(即30-40wt.％)、终浓度为80～120g/l的甘氨酸(即8-12wt.％)，再分别调节用1.0mol/l醋酸或者0.5mol/lNaOH调节pH至6.0～7.5,补加注射用水至蛋白含量配制体积。在本实验例中具体采用如下条件：按蛋白含量20g/l计算配制体，按配制体积加入终浓度为350g/l的山梨醇、终浓度为100g/l的甘氨酸，再调节pH至7.0。用终端为0.22μm滤芯过滤后进行巴氏灭活，灭活条件60±0.5℃，恒温10h，恒温结束后降温至室温。同时设置不加保护剂的对比实验组，与加保护剂的实验组的区别仅为不添加山梨醇和甘氨酸，其他条件一致。取样巴氏灭活前、巴氏灭活后检测对比巴氏灭活去除白蛋白、凝血因子、纤维蛋白原的效果。重复三个批次实验取平均值，实验结果如表8所示。

如果不添加保护剂，巴氏灭活时这些杂蛋白与球蛋白大部分会变性、聚集，形成沉淀和析出，同时杂蛋白还会与球蛋白形成共沉淀，沉淀经过过滤被去除，上清检测分子大小分布，单体与二聚体为100％，但是球蛋白收率非常低，形成的多聚体被完全沉淀过滤去除。由表8可知，添加保护剂选择性保护了球蛋白，巴氏灭活时同样能去除杂蛋白，虽然单体与二聚体含量有所降低，但是蛋白收率高，沉淀量少，少量的多聚体可通过后续简单的精纯工艺去除。

表8：白蛋白、凝血因子、纤维蛋白原的检测结果

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，以血浆为原料制备富集有免疫球蛋白的蛋白溶液，其特征在于：对所述蛋白溶液进行巴氏灭活，所述蛋白溶液中含有300～400g/l的山梨醇和80～120g/l的甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：所述蛋白溶液的pH值为6.0～7.4。

3.根据权利要求2所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：所述蛋白溶液的蛋白浓度为10～30g/L。

4.根据权利要求3所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：所述巴氏灭活的条件为：温度60.0±0.5℃，时间10h。

5.根据权利要求3所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：所述蛋白溶液中含有350g/l的山梨醇和终浓度为100g/l的甘氨酸。

6.根据权利要求3所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：所述蛋白溶液的电导率为0.3～3.05mS/cm。

7.根据权利要求6所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：所述蛋白溶液由血浆的组分II经超滤后制得。

8.根据权利要求7所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：对血浆的组分II进行超滤的方法为：将组分II分散于水中，并调节pH值为4.3～4.7,获得待超滤溶液；然后使用50KD超滤机膜包浓缩待超滤溶液，获得浓缩溶液；最后对浓缩溶液进行等体积超滤处理，获得所述蛋白溶液。

9.根据权利要求8所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：组分II与水的质量比为1：8～10；浓缩溶液中的蛋白含量为30～80g/L；等体积超滤处理使用水的体积为所述浓缩溶液的6～8倍。

10.根据权利要求9所述的一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，其特征在于：血浆的组分II的制备方法为：将血浆离心后收集上清液A；调整上清液A的温度为-3.0～-1.0℃、蛋白浓度为40～65g/L、pH为6.80～7.30、电导率为12～14mS/cm、乙醇浓度为7～10vol.％，反应1～3h，压滤收集上清液B；调整上清液B的温度为-6.0～-4.0℃、蛋白浓度为30～45g/L、pH为5.70～6.30、电导率为5.0～8.0mS/cm、乙醇浓度为18～22vol.％，反应1～3h，压滤收集沉淀，获得组分II+III；在组分II+III中加入水溶解2～4h，水的质量为组分II+III的质量的8～10倍；控温0～5℃，加入磷酸缓冲液调整pH为4.6～5.0，反应1～2h；再加入磷酸缓冲液调整pH为5.0～5.4，反应1～2h；调整乙醇浓度为13～15vol.％，反应1～3h，压滤收集上清液C；调整上清液C温度为-12.0～-1.0℃，pH为7.0～7.4，加入终浓度为3～5g/L的氯化钠，终浓度为24～26vol.％的乙醇，反应1～3h，压滤收集沉淀，获得组分II。

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