CN104829709A - 人体血清免疫球蛋白中的病毒灭活方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种人体血清免疫球蛋白在生产过程中高温灭活病毒的方法，将免疫球蛋白沉淀物或溶液在2-4℃条件下，用缓冲溶液稀释至浓度为0.01-0.25mmol/L，调整pH值至3-4.5，添加巯基保护剂、糖稳定剂和氨基酸稳定剂，升温至55-65℃保温6-12小时，再降温至0-2℃保温0.5-3小时以上，然后升温至10-20℃，保温72小时以上，可将脂包膜和非脂包膜病毒灭活，免疫球蛋白多聚体的含量可降到了1%以下。
Description
技术领域
本发明涉及药物生产过程中的病毒灭活方法，具体是静脉注射用的人体血清免疫球蛋白生产过程中的病毒灭活方法。
背景技术
人免疫球蛋白（IgG）是从人血浆中纯化得到，其由B细胞和浆细胞接触抗原后产生，其分子量大约为150KDa，由四条肽链组成，两条完全相同的轻链（L）和重链（H）通过两个二硫键共价相连，除此之外，以非共价交联形成一个均匀对称的Y型二聚物。轻链由两个同源结构域组成，重链由四个同源结构域组成，这些结构域的特征是包含2个β-折叠结构，包括3到5个反相平行β-链，通过一个二硫键来维持结构稳定。这些结构域对热敏感，在加热条件下其二级结构可发生改变，当温度超过50℃时，可使这些β折叠转变为无规卷曲，这将导致形成多聚体。这可以通过对人免疫球蛋白溶液的分子大小分布进行检测确认。
IgG制剂主要用于原发性和继发性免疫球蛋白缺乏症，以及其他的自身免疫性疾病，如原发性血小板减少性紫癜、川崎病等。
尽管已经采取了诸如献血人员的病毒筛查，但人们仍然认为血浆蛋白制品具有感染经血传播病毒的危险。世界卫生组织（WHO）不断关注血浆制品的安全性，出台了一系列有关支持和建议要求。人血浆制品生产过程中应有特定的去除或者灭活病毒方法，目前关于病毒灭活的方法提出了巴氏灭活、有机溶剂/去污剂（S/D）病毒灭活法、干热病毒灭活法、低pH病毒灭活法、膜过滤等，人免疫球蛋白制品采用以上病毒灭活方法，均存在缺陷，或者难以保持免疫球蛋白天然结构，或者无法完全灭活脂包膜和非脂包膜病毒，例如：S/D和低pH方法无法灭活非脂包膜病毒，干热病毒灭活法仅适用于冻干制品，而且可破坏人免疫球蛋白的天然结构，巴氏病毒灭活使人免疫球蛋白天然结构发生了改变，产生聚合物，膜过滤由于蛋白质溶液分子量大，过滤困难，难以实现规模化操作，而且该步骤必须和其它灭活方法联合运用。
CN1448407A公开一种静脉注射用人免疫球蛋白的生产工艺，包括以下步骤，以FⅡ+Ⅲ的沉淀物为原料进行溶解、在溶液中加乙醇调pH值到5.15离心分离，取其上清液，在上清液中加乙醇调pH值到7.25并降温到-6.5℃作离心分离，取沉淀物、将上步沉淀物溶解后加入甘氨酸保护剂后在60℃下保持10小时进行病毒灭活，对灭活后溶液进行-8℃的低温分离后取沉淀物进行溶解并调pH值到4.1±0.3，用0.2um孔径的膜进行过滤除菌，然后分装和密封，将分装的制品置于24℃的环境中放置21天，作低pH病毒灭活处理。该工艺十分复杂，免疫球蛋白变性和形成多聚体严重。
CN103550780A公开一种巴氏灭活静注人免疫球蛋白的蛋白质保护剂及其灭活方法，将灭活前的静注人免疫球蛋白溶液加入蛋白质保护剂，然后调整样品蛋白质含量40g/L～60g/L，pH值4.7～5.3，搅拌30分钟后，放入60℃±1℃水浴中，待溶液温度到60℃计时，保持溶液温度60℃±0.5℃10小时，即完成静注人免疫球蛋白的灭活，所述的蛋白质保护剂为蔗糖、精氨酸、甘氨酸、山梨醇，其最终含量分别为：50g/L～70g/L、20g/L～40g/L、30g/L～60g/L及240g/L～260g/L；免疫球蛋白多聚体的含量可降到了1.96%。但多聚体含量仍然较高，并且将免疫球蛋白长期储存后，免疫球蛋白多聚体会迅速提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人体血清免疫球蛋白在生产过程中高温灭活病毒的方法，该方法可使病毒灭活过程免疫球蛋白的损耗大大降低。
本发明将免疫球蛋白沉淀物或溶液在2—4℃条件下，用缓冲溶液稀释至浓度为0.01—0.25mmol/L，调整pH值至3—4.5，添加巯基保护剂、糖稳定剂和氨基酸稳定剂，升温至55—65℃保温6—12小时，再降温至0—2℃保温0.5—3小时以上，然后升温至10—20℃，保温72小时以上。
所述巯基保护剂为L-半胱氨酸或其盐酸盐、谷胱甘肽的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的20—100倍；所述糖稳定剂为麦芽糖或海藻糖的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的60—1000倍；所述氨基酸稳定剂为脯氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、丝氨酸或其盐的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的100—1200倍。
优选的是，巯基保护剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的40—70倍，糖稳定剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的150—700倍，氨基酸稳定剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的400—1000倍。
所述缓冲液为磷酸-磷酸钠或者醋酸-醋酸钠缓冲液，其pH值优选是3.50—5.00，更优选是3.8—4.2。
所述免疫球蛋白溶液中，免疫球蛋白浓度优选为0.10—0.20mmol/L，免疫球蛋白水溶液pH值优选为3.5—4.5。
在所述降温步骤中，优选的是当温度降至25℃时保温0.5—1个小时，再降温所述至0—2℃。
本发明所使用巯基保护剂可保护免疫球蛋分子内二硫键，维持其三级和四级结构，将pH值降低到3.0—4.5时，能使可逆的IgG多聚体解聚，这也揭示在溶液状态下，pH在3.0—4.5增加了IgG的耐受性。糖稳定剂用于保护人免疫球蛋白分子中β折叠的二级结构稳定，氨基酸稳定剂可促进人免疫球蛋白分子间的均匀分离，稳定其天然构象。
本发明能使溶液pH=3—4.5的免疫球蛋白溶液于55—62℃保温10个小时以上，可将脂包膜和非脂包膜病毒灭活，随后将免疫球蛋白溶液降温至0—2℃，改变免疫球蛋白溶液的熵值，再升温至10—20℃，保温72小时以上，使免疫球蛋白分子间的交联解离，恢复其天然构象，免疫球蛋白多聚体的含量可降到了1%以下。
具体实施方式
实施例1
经层析提取的人免疫球蛋白溶液（纯度98%，浓度0.33mmol/L），用pH=3.9的磷酸-磷酸钠缓冲溶液稀释至0.10mmol/L，搅拌状态下用0.1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至4.1，取样100ml作为空白样品进行下述的加热和降温步骤，剩余部分添加谷胱甘肽至4mmol/L，海藻糖至63mmol/L，脯氨酸至80mmol/L，用0.1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至4.1，置于水浴加热系统中，将温度升高至57℃保温8小时，过程中分别于2小时、4小时和8小时取样监测分子大小分布，随后将蛋白质溶液降温至25℃，恒温30min，再降温至0.5℃恒温1小时，随后升温至18℃，保温72小时，分别于0、12、24、48和72小时取样测分子大小分布。
分子大小分布采用高效液相色谱法：用亲水硅胶高效体积排阻色谱柱（SEC，排阻极限300kD，粒度10μm），柱直径7.5mm，长60cm；以含1%异丙醇，pH值7.0，0.2mol/L磷酸盐缓冲液（取0.5mol/L磷酸二氢钠200ml、0.5mol/L磷酸氢二钠420ml、异丙醇15.5ml及水914.5ml均匀混合）为流动相；检测波长为280nm；流速为每分钟0.6ml；分别取每1ml含蛋白质为12mg的人免疫球蛋白、人血白蛋白溶液各20μl，分别注入色谱柱，记录色谱图，人免疫球蛋白对照单体峰与裂解体峰的分离应大于1.5，人血白蛋白对照品单体峰与二聚体峰的分离度应大于1.5，拖尾因子按人血白蛋白单体峰计算应为0.95~1.40。按面积归一法计算，色谱图中单体加二聚体峰的含量，即为免疫球蛋白单体加二聚体含量。
空白样品和对照样品中免疫球蛋白单体加二聚体总量与初始溶液中人免疫球蛋白的比例如下表所示，说明加入谷胱甘肽，海藻糖和脯氨酸后，可降低免疫球蛋白的聚合度，减少因聚合造成免疫球蛋白的损失。
实施例2
经层析提取的人免疫球蛋白溶液（纯度99.4%，浓度0.33mmol/L），用pH=7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至0.11mmol/L，添加麦芽糖至64mmol/L，丝氨酸至86mmol/L后，将溶液分成A、B、C、D、E、F六份样品，A样品调节pH至6.0；B样品调节pH至5.0；C样品调节pH至4.0；D样品调节pH至3.5；E样品调节pH至4.0后添加谷胱甘肽至6.3mmol/L；F样品调节pH至3.5后添加谷胱甘肽至6.3mmol/L，置于水浴加热系统中，将温度升高至60℃保温8小时，于8小时末取样监测分子大小分布，随后将蛋白质溶液降温至25℃，恒温30min，再降温至0.5℃恒温1小时，随后升温至15℃，保温72小时，分别于0、48和72小时取样测分子大小分布，免疫球蛋白单体加二聚体总量与初始溶液中人免疫球蛋白的比例件下表。
实施例3
层析提取的人免疫球蛋白溶液（纯度99.2%，浓度0.37mmol/L），用pH3.9的磷酸-磷酸钠缓冲溶液稀释至0.10mmol/L，搅拌状态下用0.1M的盐酸调节pH至3.9，添加L-半胱氨酸至4mmol/L，海藻糖至19mmol/L，脯氨酸至50mmol/L，用0.1M的盐酸或氢氧化钠调节pH至3.9，将样品分成4份A、B、C、D，A样品加入脂包膜病毒BVDV，浓度约为108.5/ml，B样品加入脂包膜病毒VSV，浓度约为107.3/ml，C样品加入非脂包膜病毒EMCV，浓度约为105.1/ml，D样品加入非脂包膜病毒BPV，浓度约为104.2/ml，置于水浴加热系统中，将温度升高至62℃保温10小时，随后将蛋白质溶液降温至25℃，恒温30min，再降温至0.0℃恒温1小时，随后升温至18℃，恒温72小时，于72小时终点取样测定BVDV、VSV、EMCV、BPV含量，结果均未检出病毒，免疫球蛋白单体加二聚体总量与初始溶液中人免疫球蛋白的比例量如下表。
Claims (8)
1.人体血清免疫球蛋白中的病毒灭活方法，其特征在于，将免疫球蛋白沉淀物或溶液在2—4℃条件下，用缓冲溶液稀释至浓度为0.01—0.25mmol/L，调整pH值至3—4.5，添加巯基保护剂、糖稳定剂和氨基酸稳定剂，升温至55—65℃保温6—12小时，再降温至0—2℃保温0.5—3小时以上，然后升温至10—20℃，保温72小时以上；
所述巯基保护剂为L-半胱氨酸或其盐酸盐、谷胱甘肽的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的20—100倍；所述糖稳定剂为麦芽糖或海藻糖的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的60—1000倍；所述氨基酸稳定剂为脯氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、丝氨酸或其盐的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的100—1200倍。
2.根据权利要求1所述病毒灭活方法，其特征在于，所述巯基保护剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的40—70倍。
3.根据权利要求1所述病毒灭活方法，其特征在于，所述糖稳定剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的150—700倍。
4.根据权利要求1所述病毒灭活方法，其特征在于，所述氨基酸稳定剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的400—1000倍。
5.根据权利要求1所述病毒灭活方法，其特征在于，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠，或者磷酸-磷酸钠缓冲液，pH值为3.50—5.00。
6.根据权利要求1所述病毒灭活方法，其特征在于，所述免疫球蛋白浓度为0.10—0.20mmol/L。
7.根据权利要求1所述病毒灭活方法，其特征在于，所述免疫球蛋白水溶液pH值为3.5—4.5。
8.根据权利要求1所述病毒灭活方法，其特征在于，在所述降温步骤中，温度降至25℃时保温0.5—1小时，再降温至所述0—2℃。
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