CN114085258A - 一种逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法。将油橄榄叶提取后浓缩，得到油橄榄叶粗浸膏；以正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水混合成的溶剂系统作为逆流色谱分离的两相溶剂，以其上相为固定相，下相为原始流动相；将油橄榄叶粗浸膏溶解于一部分原始流动相中制成样品溶液，则另一部分原始流动相为流动相，采用洗脱‑挤出模式进行油橄榄叶中橄榄苦苷的连续进样分离得到橄榄苦苷单体，获得的化合物能达到较高纯度。本发明分离方法通过持续进样提高了进样量，可以降低溶剂消耗、提高制备量，有助于实现油橄榄叶中橄榄苦苷的宏量制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离油橄榄叶中橄榄苦苷的方法，尤其涉及一种采用洗脱-挤出模式的逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷单体的方法，属于天然产物分离方法技术领域。
背景技术
油橄榄(Olea europaea L.)是木犀科木犀榄属常绿乔木，其叶子中含有丰富的橄榄苦苷（Oleuropein）。现代药理学研究表明，橄榄苦苷具有良好的抗炎、抗真菌、抗病毒，抗氧化，以及抗癌和降血糖等多种作用。同时，橄榄苦苷还能够减轻低密度脂蛋白的氧化程度，预防冠心病、动脉粥样硬化，舒缓血管平滑肌，降低血压。此外，橄榄苦苷还被用于多种护肤品中，降低紫外线对皮肤细胞的伤害，促进皮肤细胞中胶原蛋白的生成，减少由于氧化导致的皮肤细胞损伤。
由于橄榄苦苷的多种药理活性，吸引国内外学者对橄榄苦苷的分离制备方法进行了多种探索。专利申请《一种橄榄苦苷的制备方法》（申请号201510270831.5）公开了一种制备橄榄苦苷的方法，将油橄榄叶以乙醇为夹带剂，通入CO2进行萃取，将所得萃取物用大孔树脂吸附；然后以氯仿-甲醇-水（10:5:7，v:v）为两相溶剂，应用高速逆流色谱分离洗脱得到橄榄苦苷。该制备方法使用超临界CO2进行提取，设备和工艺成本较高，制约了它的进一步发展。专利申请《一种纯化橄榄苦苷的方法》（申请号201010549802.X）公开了一种从油橄榄叶中提取橄榄苦苷的方法。用乙醇提取油橄榄叶，提取液中加入活性炭脱色；然后回收乙醇后用正丁醇萃取，回收正丁醇得到提取物；用高速逆流色谱仪分离正丁醇提取物，得到纯度90%以上的橄榄苦苷纯品。但是该纯化方法中使用活性炭脱色并正丁醇萃取，溶剂耗费较多，回收正丁醇能耗大，并且回收率较低，橄榄苦苷得率仅达到1%左右。现有技术公开的方法在分离橄榄苦苷时都应用了逆流色谱仪，但是均为传统的单次进样，其制备量受到仪器进样体积的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于逆流色谱中洗脱-挤出模式的连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法，提高橄榄苦苷制备量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷单体的方法，主要包括以下步骤：
1）油橄榄叶提取物粗浸膏的制备：将干燥的油橄榄叶加入质量为油橄榄叶质量5～12倍的液体中，加热回流提取30min～120 min，过滤，得提取液，将提取液在温度55～75℃、压力-0.08MPa的条件下减压浓缩至无溶剂状态，得油橄榄叶粗浸膏；
液体采用水或混合溶液，该混合溶液按体积比1︰4由水和乙醇配制而成。
2）高速逆流色谱分离溶剂系统：将正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比1︰19︰1︰19混合，振摇，静置分层，得用于逆流色谱分离的两相溶剂系统，将该两相溶剂系统的上相作为逆流色谱分离的固定相，将该两相溶剂系统的下相作为逆流色谱分离的原始流动相；然后将原始流动相分为两部分；
3）样品溶液配制：将步骤1）获得的油橄榄叶提取物粗浸膏溶解于步骤2）中的一部分原始流动相配制成质量体积浓度5～60 mg/mL的溶液，过滤，得样品溶液；步骤2）中的另一部分原始流动相为流动相；
用0.45 μm Millipore 过滤器过滤溶液，以去除溶液中的不溶性固体。
4）连续进样逆流色谱分离：采用逆流色谱洗脱-挤出洗脱模式（Elution-Extrusion elution mode）。首先以流速1～100 mL/min将固定相泵入逆流色谱分离柱中，当固定相充满逆流色谱分离柱后，运行逆流色谱仪，设定转速为200～1600 rpm；当逆流色谱仪实际转速达到预设转速且稳定后，以流速0.5～10 mL/min将流动相泵入逆流色谱分离柱中，设定检测波长为232 nm；待逆流色谱柱内达到两相平衡后，通过恒流泵将样品溶液持续泵入逆流色谱分离柱，持续泵样时间T进样时间根据下式计算：
T 进样时间=[(K D2－K D1)V S /F]－(0.5W b1+0.5W b2)（1）
（1）式中，K D2 和K D1 分别是化合物2和化合物1的分配系数（K D2 >K D1 ），V S 是逆流色谱柱内固定相体积，F是流动相流速，W b1 和W b2 可分别为为化合物1和化合物2的洗脱色谱峰宽度。为了避免分离时化合物之间交叉，通常实际进样时间根据分离情况要略短于计算得到的T 进样时间数值。
待进样时间达到确定的连续进样时间后，将样品溶液换为流动相，继续洗脱橄榄苦苷，根据检测结果切换固定相进行挤出过程，并收集目标化合物馏分；
5）将收集得到的目标化合物馏分在温度40～55℃，压力-0.1～0.03MPa条件下减压回收溶剂，干燥，得到橄榄苦苷。
本发明分离方法具有以下优点：
1、实现了逆流色谱的连续进样分离，利用逆流色谱洗脱-挤出模式，将提取物中其他成分统一在洗脱阶段冲洗出来，将目标化合物单体橄榄苦苷在挤出阶段中洗脱出来，获得了较高纯度的橄榄苦苷。
2、简单高效，实现了连续进样，与传统逆流色谱分离方法相比，极大提高了逆流色谱在相同分离时间内的进样量和产率。
附图说明
图1是连续进样分离橄榄苦苷的洗脱-挤出高速逆流色谱图。
图2是HPLC检测油橄榄叶粗提物和高速逆流色谱分离所得橄榄苦苷的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明基于洗脱-挤出模式的逆流色谱连续进样分离油橄榄叶中橄榄苦苷的方法做进一步说明。
本发明实施例中所使用的分离设备逆流色谱仪，根据所需目标分离量的不同，可以选择分析型、半制备型和制备型逆流色谱仪。
实施例1
取干燥的油橄榄叶100g，加入1000 mL乙醇水溶液，该乙醇水溶液由800mL乙醇和200 mL水组成；加热回流提取90 min，过滤，得提取液，将提取液在温度55℃、压力-0.08MPa的条件下减压浓缩至无溶剂状态，得油橄榄叶粗浸膏。将正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水、二氯甲烷按体积比1︰19︰1︰19混合，振摇，静置分层，得两相溶剂系统，将该两相溶剂系统的下相作为逆流色谱分离的原始流动相；然后将原始流动相分为两部分；将50 mg油橄榄叶粗浸膏溶解于一部分原始流动相（100 mL）中，配成质量体积浓度5 mg/mL的样品溶液，则另一部分原始流动相为流动相，样品溶液在分离前用 0.45 μm Millipore 过滤器过滤，以去除任何不溶性固体。以流速20mL/min将固定相泵入逆流色谱分离柱中，当固定相充满逆流色谱分离柱后，运行逆流色谱仪，设定转速为1600 rpm；当逆流色谱仪实际转速达到预设转速且稳定后，以流速3 mL/min将流动相泵入逆流色谱分离柱中；待逆流色谱柱内达到两相平衡后，通过恒流泵持续泵入过滤后的样品溶液进行分离。根据前述公式（1）计算出持续进样时间为23.9分钟，选择持续进样时间为24min，共泵入72 mL过滤后的样品溶液。然后将过滤后的样品溶液换为流动相，继续洗脱橄榄苦苷。每2 min收集一份含有橄榄苦苷的馏分，继续进行洗脱过程，在50分钟时进行挤出过程，并收集得到橄榄苦苷并通过HPLC检测，合并所有馏分，在温度50℃、压力0.01MPa的条件下减压回收溶剂，干燥，得到橄榄苦苷。经HPLC检测，产品纯度为77 %。
为了模拟计算，本实施例中在前面出峰的大部分杂质看作化合物1，化合物2是橄榄苦苷。
图1为连续进样分离橄榄苦苷的洗脱-挤出高速逆流色谱图。分离条件：柱体积为136mL，流动相流速为3 mL/min，转速为1600 rpm，检测波长为232 nm，分离温度25℃。
图2为HPLC检测油橄榄叶粗提物和HSCCC分离所得橄榄苦苷的色谱图；其中，图2的（a）图为油橄榄叶粗提物的色谱图，图2的（b）图为分离得到的橄榄苦苷的色谱图。色谱条件：流动相为乙腈和水；等度洗脱程序：0～25 分钟，25%乙腈；流速：1.0 mL/min；检测波长232 nm；柱温：25 ℃；进样量为 20 μL。
为了模拟计算，本实施例中的大部分杂质看作化合物1，化合物2是橄榄苦苷。
实施例2
取干燥的油橄榄叶50g，加入500g水中，加热回流120 min，过滤，得提取液，将提取液在温度75 ℃、压力-0.08 MPa的条件下减压干燥，得油橄榄叶粗浸膏。将正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比1︰19︰1︰19混合，振摇，静置分层，得两相溶剂系统；将该两相溶剂系统的上相作为逆流色谱分离的固定相，该两相溶剂系统的下相作为逆流色谱分离的原始流动相；然后将原始流动相分为两部分；将700 mg油橄榄叶粗浸膏溶解于一部分原始流动相（70mL）中，配成质量体积浓度10 mg/mL的样品溶液；则另一部分原始流动相为流动相；样品溶液在分离前用 0.45 μm Millipore 过滤器过滤，以去除任何不溶性固体。以流速20 mL/min将固定相泵入逆流色谱分离柱，当固定相充满逆流色谱分离柱后运行逆流色谱仪，设定转速为1600 rpm；当逆流色谱仪实际转速达到预设转速且稳定后，将流动相以流速3mL/min泵入逆流色谱分离柱中，待逆流色谱柱内达到两相平衡后，通过恒流泵持续泵入过滤后的样品溶液进行分离。同时，根据前述公式（1）计算出样品溶液持续进样时间为23.9 min，为得到更高纯度橄榄苦苷，我们取较长的间隔空白时间，最后选择持续进样时间16min，共泵入48 mL过滤后的样品溶液；之后将过滤后的样品溶液换为流动相，继续进行洗脱过程，在50分钟时进行挤出过程，并收集得到橄榄苦苷。每2 min收集一份含有橄榄苦苷的馏分，并通过HPLC检测，合并所有馏分，在温度55℃、压力0.01MPa的条件下减压回收溶剂，干燥，得到橄榄苦苷。经HPLC检测，产品纯度为86.4%。
同样地，为了模拟计算，本实施例中在前面出峰的大部分杂质看作化合物1，化合物2是橄榄苦苷。
Claims (5)
1.一种逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法，其特征在于，该分离方法包含以下步骤：
1）将油橄榄叶加入质量为油橄榄叶质量5～12倍的液体中，加热回流提取，过滤，得提取液；减压浓缩，得到油橄榄叶粗浸膏；
2）按体积比1︰19︰1︰19混合正丁醇、乙酸乙酯、甲醇和水，振摇，静置分层，得用于逆流色谱分离的两相溶剂系统，将该两相溶剂系统的上相作为逆流色谱分离的固定相，将该两相溶剂系统的下相作为逆流色谱分离的原始流动相；然后将原始流动相分为两部分；
3）将步骤1）获得的油橄榄叶粗浸膏溶解于步骤2）中的一部分原始流动相中，配成质量体积浓度5~60 mg/mL的溶液，过滤，得样品溶液；则步骤2）中的另一部分原始流动相为流动相；
4）以流速1~100 mL/min将固定相泵入逆流色谱分离柱中，当固定相充满逆流色谱分离柱后，运行逆流色谱仪，设定转速为200~1600 rpm；当逆流色谱仪实际转速达到预设转速且稳定后，以流速0.5~10 mL/min将流动相泵入逆流色谱分离柱中；待逆流色谱柱内达到两相平衡后，通过恒流泵持续泵入样品溶液，设定检测波长为232 nm，持续进样一段时间后，将样品溶液换为流动相，继续洗脱橄榄苦苷，根据检测结果收集目标化合物馏分；
5）真空干燥步骤4）分离得到的目标化合物馏分，得到橄榄苦苷。
2.如权利要求1所述的逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法，其特征在于：步骤1）中的液体为水或混合溶液，该混合溶液按体积比1︰4由水和乙醇混合而成。
3.如权利要求1所述的逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法，其特征在于：步骤1）中，提取液在温度55～75℃、压力-0.08MPa的条件下减压浓缩至无溶剂状态，得油橄榄叶粗浸膏。
4.如权利要求1所述的逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法，其特征在于：所述步骤3）中，持续泵入过滤后的样品溶液的时间按下式计算：
T 进样时间=[(K D2－K D1)V S /F]－(0.5W b1+0.5W b2) （1）
（1）式中，K D2 和K D1 分别是化合物2和化合物1的分配系数（K D2 >K D1 ），V S 是逆流色谱柱内固定相体积，F是流动相流速，W b1 和W b2 可分别为为化合物1和化合物2的洗脱色谱峰宽度；
为了避免分离时化合物之间交叉，通常实际进样时间根据分离情况要略短于计算得到的T 进样时间数值。
5.如权利要求1所述的逆流色谱连续进样从油橄榄叶中分离橄榄苦苷的方法，其特征在于：所述步骤5）中，目标化合物馏分在温度40～55℃，压力-0.1～0.03MPa条件下减压回收溶剂，干燥，得到橄榄苦苷。
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