CN114075533A - 一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，将氨基葡萄糖通过可酶解的连接键交联到干细胞3D培养微载体上，利用氨基葡萄糖的带正电荷特征吸附干细胞，强化接种过程中干细胞种子向载体上的富集；在干细胞增殖后，利用特定的裂解酶将干细胞3D培养微载体裂解，氨基葡萄糖也随同载体解离并通过清洗消除。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法 。
背景技术
干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2D培养与3D培养两大类。2D培养主要通过增大皿进行，批量换液、扩散法供气。3D培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3D培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
干细胞3D培养载体是影响干细胞3D培养产业链的关键要素，有众多厂家进行干细胞3D培养载体研究开发，但多数干细胞3D培养载体都存在有干细胞接种活性低的问题，通过干细胞3D培养载体的表面改性在一定程度上增强了干细胞向干细胞3D培养载体的富集，但干细胞收获时出现了干细胞难于同3D培养载体分离的新难题。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，其实质是在干细胞3D培养微载体表面及内部孔道上交联氨基葡萄糖，这些氨基葡萄糖能够通过正电荷吸引作用将表面带负电荷干细胞吸附到干细胞3D培养微载体上，有效强化接种效果；当干细胞在3D培养微载体中生长增殖过程时，氨基葡萄糖通过电荷吸附作用促进干细胞在3D培养微载体中生长；干细胞培养结束时，通过酶解法裂解干细胞3D培养微载体，氨基葡萄糖也同时释放，通过清洗即可有效除去，解除干细胞收获时出现的干细胞难于同3D培养载体分离的难题。
本发明克服现有干细胞培养载体在接种时不易于吸附干细胞种子的不足，发明的一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，具体步骤如下：
S1 将氨基葡萄糖溶解于碱性溶液中，加入干细胞3D培养用胶原微载体充分搅拌，使氨基葡萄糖吸附于干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S2将充分吸附氨基葡萄糖的干细胞3D培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，通过形成磷酸酯键将氨基葡萄糖交联固定在干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S3 充分清洗去除交联剂及未交联氨基葡萄糖，并使交联后的干细胞3D培养用胶原微载体达到pH7.2-7.4；
S4 交联后的干细胞3D培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3D培养，或保存备用。
优选地，S2中氨基葡萄糖与干细胞3D培养用胶原微载体是通过磷酸酯链交联在一起，
优选地，S2中利用碱性溶液中的三偏磷酸钠完成氨基葡萄糖与干细胞3D培养用胶原微载体的交联。
优选地，优先使用碳酸钠溶液与碳酸钾溶液，也可以使用其他碱性溶液。
优选地，可以胶原蛋白酶与磷酸酯酶裂解氨基葡萄糖修饰的干细胞3D培养用胶原微载体，无损释放其中培养的干细胞。
有益效果：
本发明提供一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，其实质在干细胞3D培养用载体上交联氨基葡萄糖，氨基葡萄糖可以在干细胞接种阶段通过正电荷的吸引作用将带负电荷的干细胞种子吸附到带正电荷的干细胞3D培养用载体上，强化接种性能；当干细胞在载体上生长与增殖时，氨基葡萄糖促进干细胞在干细胞3D培养用载体中的扩增。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中涉及到研发团队已经申报专利的相关技术、方法与设备，在实施例中仅重点说明相关专利技术或方法或设备在干细胞3D培养制备过程中的主要用途，不再具体描述已申报专利的具体细节。
实施例1
（1）干细胞3D培养用载体的修饰（相应操作均在无菌条件下完成）
S1 将氨基葡萄糖溶解于碱性的碳酸钠溶液中，加入干细胞3D培养用胶原微载体充分搅拌，使氨基葡萄糖吸附于干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S2将充分吸附氨基葡萄糖的干细胞3D培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，氨基葡萄糖交联固定在干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S3 充分清洗去除交联剂及未交联氨基葡萄糖，并使交联后的干细胞3D培养用胶原微载体达到pH7.2-7.4；
S4 交联后的干细胞3D培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3D培养，或保存备用。
（2）以交联后的干细胞3D培养微载体进行MSC干细胞3D培养
S5利用干细胞3D培养仪进行干细胞3D培养增殖；干细胞3D培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.X 一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.X 一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8 一种3D干细胞仿真培养设备。具体的MSC干细胞3D培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基的制作方法）：
S6将以干细胞3D培养用多孔微载体与MSC干细胞种子混合，按每百万个MSC用100mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行MSC干细胞3D培养增殖。
S7 利用胶原蛋白酶与磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放MSC细胞，对获得的MSC干细胞进行相应的检测并保存。获得MSC细胞按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：CD29(98.67%)、CD 44(97.56%)、CD73 (97.76%)、CD90 (98.86%)、CD 105(99.56%); CD14 (0.17%)、CD19 (0.09%)、CD31 (0.12%)、CD34 (0.14%)、CD45 (0.04%)、HLA-DR (0%)； MSC干细胞的功能指标超过国内与国际MSC表面抗原的要求。
实施例2
（1）干细胞3D培养用载体的修饰（相应操作均在无菌条件下完成）
S1 将氨基葡萄糖溶解于碱性的碳酸钾溶液中，加入干细胞3D培养用胶原微载体充分搅拌，使氨基葡萄糖吸附于干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S2将充分吸附氨基葡萄糖的干细胞3D培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，氨基葡萄糖交联固定在干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S3 充分清洗去除交联剂及未交联氨基葡萄糖，并使交联后的干细胞3D培养用胶原微载体达到pH7.2-7.4；
S4 交联后的干细胞3D培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3D培养，或保存备用。
（2）以交联后的干细胞3D培养微载体进行MSC干细胞3D培养
S5利用干细胞3D培养仪进行干细胞3D培养增殖；干细胞3D培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.X 一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.X 一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8 一种3D干细胞仿真培养设备。具体的MSC干细胞3D培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基的制作方法）：
S6将以干细胞3D培养用多孔微载体与MSC干细胞种子混合，按每百万个MSC用100mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行MSC干细胞3D培养增殖。
S7 利用胶原蛋白酶与磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放MSC细胞，对获得的MSC干细胞进行相应的检测并保存。获得MSC细胞按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：CD29(99.69%)、CD 44(98.96%)、CD73 (98.86%)、CD90 (98.96%)、CD 105(98.96%); CD14 (0.19%)、CD19 (0.21%)、CD31 (0.13%)、CD34 (0.15%)、CD45 (0.27%)、HLA-DR (0%)； MSC干细胞的功能指标超过国内与国际MSC表面抗原的要求。
实施例3
（1）干细胞3D培养用载体的修饰（相应操作均在无菌条件下完成）
S1 将氨基葡萄糖溶解于碱性的碳酸钠溶液中，加入干细胞3D培养用胶原微载体充分搅拌，使氨基葡萄糖吸附于干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S2将充分吸附氨基葡萄糖的干细胞3D培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，氨基葡萄糖交联固定在干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S3 充分清洗去除交联剂及未交联氨基葡萄糖，并使交联后的干细胞3D培养用胶原微载体达到pH7.2-7.4；
S4 交联后的干细胞3D培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3D培养，或保存备用。
（2）以交联后的干细胞3D培养微载体进行HSC干细胞3D培养
S5利用干细胞3D培养仪进行干细胞3D培养增殖；干细胞3D培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.X 一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.X 一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8 一种3D干细胞仿真培养设备。具体的MSC干细胞3D培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基的制作方法）：
S6将以干细胞3D培养用多孔微载体与HSC干细胞种子混合，按每百万个HSC用500mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行HSC干细胞3D培养增殖。
S7 利用胶原蛋白酶与磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放HSC细胞，按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果:CD3+CD8+、CD3-CD（56+16）+、CD3+CD56+超过95%，抗原表征达到国内与国际标准要求。
本发明的一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案全部进行描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1 将氨基葡萄糖溶解于碱性溶液中，加入干细胞3D培养用胶原微载体充分搅拌，使小肽吸附于干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S2将充分吸附氨基葡萄糖的干细胞3D培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，通过形成磷酸酯键将氨基葡萄糖交联固定在干细胞3D培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；
S3 充分清洗去除交联剂及未交联氨基葡萄糖，并使交联后的干细胞3D培养用胶原微载体达到pH7.2-7.4；
S4 交联后的干细胞3D培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3D培养，或保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，其特征在于，S2中氨基葡萄糖与干细胞3D培养用胶原微载体是通过磷酸酯链交联在一起。
3.根据权利要求1所述的一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，其特征在于，S2中利用碱性溶液中的三偏磷酸钠完成氨基葡萄糖与干细胞3D培养用胶原微载体交联。
4.根据权利要求3所述的碱性溶液，其特征在于，优先使用碳酸钠溶液与碳酸钾溶液，也可以使用其他碱性溶液。
5.根据权利要求1所述的一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3D培养微载体及其制备方法，其特征在于，可以胶原蛋白酶与磷酸酯酶裂解氨基葡萄糖修饰的干细胞3D培养用胶原微载体，无损释放其中培养的干细胞。
6.保护该方法制备的一种强化接种活性的干细胞3D培养微载体在干细胞3D培养产业链中的应用。
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| CN202010802197.6A CN114075533A (zh) | 2020-08-11 | 2020-08-11 | 一种氨基葡萄糖强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法 |
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| CN114075533A true CN114075533A (zh) | 2022-02-22 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102895699A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-01-30 | 江南大学 | 一种用于皮肤创伤修复的复合水凝胶敷料的制备方法 |
| CN103614333A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-03-05 | 乔自林 | 一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法 |
| CN107250163A (zh) * | 2015-02-06 | 2017-10-13 | 嘉吉公司 | 修饰的葡糖淀粉酶和具有增强的生物产物产生的酵母菌株 |
-
2020
- 2020-08-11 CN CN202010802197.6A patent/CN114075533A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102895699A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-01-30 | 江南大学 | 一种用于皮肤创伤修复的复合水凝胶敷料的制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 季佳佳: "三偏磷酸钠交联玉米淀粉的理化性质研究", 中国硕士学位论文全文数据库, 15 January 2013 (2013-01-15), pages 1 - 3 * |
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