CN114075164B - 一类检测亚铁血红素的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
一类检测亚铁血红素的荧光探针及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，涉及一类检测亚铁血红素的荧光探针及其制备方法与应用，具体涉及一类亚铁血红素和疟原虫检测荧光探针及其制备方法与应用。此类荧光探针是一种基于鹰爪甲素点亮型荧光探针，其设计基于宿主红细胞中疟原虫水解血红蛋白产生的亚铁血红素(Heme)催化荧光探针的分解，引起荧光共振能量转移效应基团的离去为机理，实现对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)等疟原虫的检测，具有分析灵敏度高、选择性强等优点。并且可以利用流式细胞仪来进行疟原虫的检测，省去了传统姬姆萨染色法(Giemsa staining)繁琐的染色过程，避免了在显微镜下数疟原虫个数带来的主观因素造成的偏差，因此在疟原虫检测与评估中具有潜在的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一类检测亚铁血红素的荧光探针及其制备方法与应用，属于分析化学技术领域。
背景技术
疟疾是由带有疟原虫的雌性按蚊叮咬人体感染引起的一种虫媒传染病，是全球三大公共卫生问题之一，在热带、亚热带尤为严重。我国大部分地区虽已无本地疟疾病例，但是随着经济贸易全球化带来的人口流动及劳务输出增加，输入性疟疾呈增多趋势，我国疟疾形势依然充满挑战。
目前，临床疟疾诊断最常规的方法是临床症状观察、镜检疟原虫和抗原检测，但其准确性和灵敏性均有待提高。除此之外，报道研究的方法还有DNA探针技术、聚合酶链式反应(PCR)技术等等，这些方法对实验条件和技术水平要求较高，成本较高，操作繁琐，限制了其现场应用，尤其是在欠发达地区的应用。因此，寻找一种简便、准确、灵敏的疟原虫检测方法，是一项非常重要和有实际意义的工作。
荧光分析法具有分析灵敏度高、选择性强、实时在线监测和对生物样品非侵入检测等其他传统检测方法不具备的优点。荧光探针是通过荧光探针与特定目标分析物作用，检测其荧光信号变化的一种检测方法。目前，尚未有报道特异性点亮型荧光探针用于疟原虫的检测。
疟原虫的一个显著特性是它的生长需要水解大量血红蛋白，以获得其生长所需要的氨基酸。在这个水解的过程中会释放出亚铁血红素(heme)，高浓度的heme是疟原虫的一个显著特性。因此靶向heme的荧光探针就可以实现对疟原虫的检测。但heme是一个黑色物质，它对荧光染料就有很强的荧光猝灭作用。目前靶向heme的荧光探针就是利用了这一特性，即将能与heme结合的蛋白或多肽连接到荧光染料上，通过这种识别结合可设计得到荧光猝灭型或比率型荧光探针。但是这种探针明显的缺陷是其不能区分亚铁血红素和血红素(hemin)，其应用受到了极大的限制。
鹰爪甲素具有抗疟活性，其结构与青蒿素具有相似之处，即均含有过氧桥键(O—O)，这是其抗疟作用的药效团。宿主红细胞中疟原虫水解血红蛋白产生的亚铁血红素(Heme)能催化鹰爪甲素的分解，分解过程中形成的中间产物(自由基)能结合疟原虫蛋白质或破坏其DNA结构，从而发挥抗疟作用。我们发现，在亚铁血红素还原鹰爪甲素中O—O键的过程中，形成活性氧自由基并发生重排反应，鹰爪甲素结构中的支链会断裂以小分子的形式离去，这是鹰爪甲素与青蒿素的不同之处。这一特性可以用来设计检测亚铁血红素和疟原虫的点亮型荧光探针。
发明内容
针对目前疟原虫检测所面临问题，本发明的结构设计是基于鹰爪甲素与亚铁血红素独特的相互作用，即鹰爪甲素在亚铁血红素的作用下形成氧自由基，自由基的重排引起结构中的支链断裂而离去。基于鹰爪甲素和亚铁血红素的独特作用，我们在鹰爪甲素的结构骨架的两侧分别引入一个荧光基团和荧光猝灭基团，设计并合成了一种能够特异性检测亚铁血红素和疟原虫的点亮型荧光探针，该探针能够高灵敏地检测亚铁血红素，并且能够检测红细胞中被感染的疟原虫，因此探针能够区分正常红细胞和感染疟原虫的红细胞。此外，本发明还进一步提供了探针的制备方法和应用的操作流程。
本发明的目标在于开发一类具有分析灵敏度高、选择性强的检测亚铁血红素和疟原虫的荧光探针。
本发明涉及的荧光探针被宿主红细胞中疟原虫水解血红蛋白产生的亚铁血红素(Heme)催化分解，引起荧光猝灭基团的离去，荧光猝灭基团从而失去猝灭作用，因此探针分子从较弱的荧光到荧光信号急剧增加。该探针可用于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)等疟原虫的检测与评估，具有简单可行、准确性高、检测限低、检测浓度广、抗干扰能力强的特点。
技术方案
本发明包括如下化合物或其药学上可接受的盐:
本发明中亚铁血红素和疟原虫检测用化合物具有下列结构通式XIII
其中：
化合物XIII为一组异构体，包括以下8个异构体：
本发明的亚铁血红素和检测疟原虫的荧光探针，是一种基于鹰爪甲素结构的荧光点亮型荧光探针。
另一方面，本发明还提供合成上述式XIII化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将式Ⅰ化合物氧化，得到中间体式Ⅱ化合物：将式Ⅰ化合物加入光反应器中，加入乙腈、亚甲基蓝，通氧气，打开光反应器，0℃搅拌至反应完成，得到中间体式Ⅱ化合物，不经处理继续下一步反应。
所述反应优选于密闭条件于光照下0℃搅拌，以防止溶剂中氧的逃离，利于反应进行。
反应中溶剂优选乙腈，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选0℃下反应1-2小时。
反应结束后，优选不经处理继续下一步反应。
(2)向步骤(1)中得到的中间体式Ⅱ化合物中加入对甲基苯磺酸，室温搅拌使其均匀分散后，室温下反应12个小时，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式III化合物。
所述反应优选于常温下搅拌进行。
加料完毕后，优选反应10-12小时。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用石油醚/乙酸乙酯为流动相柱色谱法梯度洗脱分离提纯产物。
(3)将步骤(2)中得到的中间体式III化合物溶于二氯甲烷，置于-78℃低温反应器中，通入O3反应至溶液呈浅蓝色，反应结束，转移至常温，滴加二甲硫醚，搅拌至反应完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式IV化合物。
所述反应优选于-78℃搅拌反应。
反应中溶剂优选二氯甲烷，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选-78℃下通入O3 40分钟至反应溶液呈浅蓝色后，停止通入O3，继续反应20分钟，反应结束。优选滴加二甲硫醚(2mL)继续搅拌反应15分钟，至溶液变成无色。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用石油醚/乙酸乙酯为流动相柱色谱法梯度洗脱分离提纯产物。
(4)将步骤(3)中得到的中间体式IV化合物溶于二氯甲烷，在冰浴下滴加1-三苯基膦烯基-2-丙酮的二氯甲烷溶液，搅拌5分钟后移至室温反应。反应结束后，柱层析纯化得到中间体式V化合物。
所述反应优选于冰浴下滴加1-三苯基膦烯基-2-丙酮的二氯甲烷溶液。
反应中溶剂优选二氯甲烷，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选常温下反应33-35小时。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用石油醚/乙酸乙酯为流动相柱色谱法分离提纯产物。
(5)向步骤(4)中得到的中间体式V化合物中加入硼氢化锂，加入无水乙醚，于-15℃低温反应器中搅拌至反应结束，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，将合并的有机部分用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩除去有机相，得到中间体式VI化合物。
所述反应优选于-15℃搅拌反应。
反应中溶剂优选无水乙醚，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选-15℃下反应1小时。
反应结束后，优选加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取产物。
(6)将步骤(5)中得到的中间体式VI化合物溶于二氯甲烷，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯、无水吡啶，移至室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式VII化合物。
所述反应优选于冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯、无水吡啶，室温下搅拌进行。
反应中溶剂优选无水二氯甲烷，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选室温下搅拌反应3-5小时。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用石油醚/乙酸乙酯为流动相柱色谱法分离提纯产物。
(7)将步骤(6)中得到的中间体式VII化合物溶于二氯甲烷，加入Boc-乙二胺、4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式VIII化合物。
所述反应优选于室温下搅拌进行。
反应中溶剂优选无水二氯甲烷，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选室温下搅拌反应5-6小时。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用石油醚/乙酸乙酯为流动相柱色谱法分离提纯产物。
(8)向步骤(7)中得到的中间体式VIII化合物中加入硼氢化锂，加入无水乙醚，于-6℃低温反应器中搅拌至反应结束，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪旋干，得到中间体式IX化合物。
所述反应优选于-6℃搅拌反应。
反应中溶剂优选无水乙醚，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选-6℃下反应6-8小时。
反应结束后，优选加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取产物。
(9)将步骤(8)中得到的中间体式IX化合物溶于二氯甲烷，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯、无水吡啶，移至室温搅拌反应3天至反应完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式X化合物。
所述反应优选于冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯、无水吡啶，室温下搅拌进行。
反应中溶剂优选无水二氯甲烷，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选室温下搅拌反应3天。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用石油醚/乙酸乙酯为流动相柱色谱法梯度洗脱分离提纯产物。
(10)将步骤(9)中得到的中间体式X化合物溶于二氯甲烷，加入分散红、4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式XI化合物。
所述反应优选于室温下搅拌进行。
反应中溶剂优选无水二氯甲烷，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
加料完毕后，优选室温下搅拌反应5-6小时。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用石油醚/乙酸乙酯为流动相柱色谱法梯度洗脱分离提纯产物。
(11)将步骤(10)中得到的中间体式XI化合物溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸，室温搅拌反应至完成，旋转蒸发仪除去溶剂，柱层析纯化得到中间体式XII化合物。
所述反应优选于室温下搅拌进行。
反应中试剂优选二氯甲烷/三氟乙酸(9/1，v/v)溶液。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选不经进一步处理继续下一步反应。
(12)将步骤(11)中得到的中间体式XII化合物溶于二氯甲烷，加入活化的荧光染料、三乙胺，室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到荧光探针式XIII化合物。
所述反应优选于室温下搅拌进行。
反应中溶剂优选无水二氯甲烷，对原料溶解度高，也便于反应后的脱除。
反应结束后，优选减压蒸去溶剂。优选使用二氯甲烷/甲醇为流动相薄层制备色谱法分离提纯产物。
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单制备得到。
另一方面，本发明还提供了使用上述式XIII化合物检测疟原虫的方法，包括但不限于下列方法：1)将式XIII化合物与待检测红细胞孕孵3小时，然后用流式细胞分析仪检测红细胞的荧光强度，即可检测到感染红细胞的疟原虫；2)将式XIII化合物与待检测红细胞孕孵3小时，然后将感染的红细胞滴到载玻片上，加上盖玻片后用激光共聚焦显微镜观察感染红细胞的疟原虫。
本发明的有益效果是：该类探针化合物能够检测含亚铁血红素的的生物体，包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)等，检测特异性高，灵敏度好，响应快。
由以上描述以及本领域技术人员公知的常识，可以了解此类荧光探针的各种优点：
(1)该荧光探针用于疟原虫的检测，与传统疟原虫检测方法相比，具有分析灵敏度高、选择性强等优点。
(2)该荧光探针化合物的开关设计基于宿主红细胞中疟原虫水解血红蛋白产生的亚铁血红素(Heme)催化荧光探针的分解，引起荧光猝灭基团的离去，反应迅速，不易受其它物质的干扰。
附图说明
图1、探针XIII a与heme反应后heme烷基化产物的质谱图
图2、探针XIII a与heme反应后游离荧光染料产物的质谱图
图3、探针XIII a与heme反应引起的探针荧光强度的变化，hemin：血红素；SA：抗坏血酸钠
图4、探针XIII c与heme反应后heme烷基化产物的质谱图
图5、探针XIII c与heme反应后游离荧光染料产物的质谱图
图6、探针XIII c与heme反应引起的探针荧光强度的变化，hemin：血红素；SA：抗坏血酸钠
图7、探针XIII d与heme反应后heme烷基化产物的质谱图
图8、探针XIII d与heme反应后游离荧光染料产物的质谱图
图9、探针XIII d与heme反应引起的探针荧光强度的变化，hemin：血红素；SA：抗坏血酸钠
图10、利用激光共聚焦显微镜观察探针XIII a、XIII c和XIII d对疟原虫的荧光染色结果，BF：明场成像图片；FL：荧光成像图片；merge：明场成像图片和荧光成像图片的重叠图片
图11、利用流式细胞仪分析探针XIII a、XIII c和XIII d对不同生长时期疟原虫的荧光染色结果
具体实施方式
实施例1、荧光探针XIIIa的合成：
(1)中间体II的合成
将色谱乙腈(40mL)倒入光反应器中，依次加入化合物Ⅰ(1.2g，7.31mmol)、亚甲基蓝(25mg，0.78mmol)，通入氧气，打开光反应器，在0℃搅拌反应1小时，反应完成，得到中间体II，共投12次，累计投料14.4g，合并至1000mL反应瓶，不经处理继续下一步反应。
(2)中间体III的合成
向步骤(1)中得到的中间体Ⅱ中加入对甲基苯磺酸(1000mg，5.8mmol)，室温搅拌使其均匀分散后，室温下反应12小时，减压蒸除溶剂，利用硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯(100/1-20/1，v/v))，得到中间体III，为无色油状物(8.6g，48％)。HRMS(ESI)calcd for[M+H]+:197.1178,found:197.1164。
(3)中间体IV a的合成
将中间体III(8.6g,43.9mmol)溶于干燥二氯甲烷(150mL)，置于-78℃低温反应器中，通入O3至反应溶液呈浅蓝色，停止通入O3，继续反应20分钟，反应结束，转移至常温，滴加二甲硫醚(4mL)，至反应溶液由浅蓝色变无色透明，继续搅拌反应15分钟，反应结束，柱色谱法使用石油醚/乙酸乙酯(10/1-6/1，v/v)梯度洗脱纯化，得到中间体IVa，无色油状物(2.2g，25.3％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 9.80(1H,s,H-10),4.39(1H,m,H-2),2.70(1H,dt,J＝16.0,3.0Hz,H-5a),2.63(1H,m,H-4),2.48-2.53(1H,重叠,H-5b),2.45-2.48(1H,重叠,H-1),2.32(1H,ddd,J＝13.5,7.0,3.0Hz,H-3a),1.89(1H,ddd,J＝13.5,3.0,2.0Hz,H-3b),1.29(3H,d,J＝6.5Hz,H-7),1.08(3H,s,H-9).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 207.3,202.6,88.0,82.2,48.5,42.2,32.7,30.1,17.4,10.9。HRMS(ESI)calcd for[M+H]+:199.0970,found:199.0960。
(4)中间体V a的合成
将中间体IV a(2.2g，11.1mmol)溶于二氯甲烷(50mL)，1-三苯基膦烯基-2-丙酮(4.2g，13.2mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，冰浴下将1-三苯基膦烯基-2-丙酮的二氯甲烷溶液滴入中间体IV a中，滴完搅拌5分钟，然后移至室温反应33小时。反应结束后，通过使用石油醚/乙酸乙酯(100/1-3/1，v/v)梯度洗脱纯化，得到中间体V a，无色油状物(650mg，24.6％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH7.02(1H,d,J＝16.5Hz,H-10),6.28(1H,d,J＝16.5Hz,H-11),4.35(1H,m,H-2),2.77(1H,dd,J＝16.0,3.0Hz,H-5a),2.39-2.47(3H,重叠,H-1,3a,5b),2.34(1H,m,H-4),2.30(3H,s,H-13),1.87(1H,ddd,J＝13.5,3.0,2.0Hz,H-3b),1.26(3H,d,J＝6.5Hz,H-7),1.18(3H,s,H-9).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 207.1,198.0,149.1,129.9,83.6,81.9,48.5,42.7,37.0,29.7,27.5,23.2,10.8.HRMS(ESI)calcd for[M+H]+:239.1283,found:239.1277。
(5)中间体VI a的合成
将中间体V a(650mg，2.7mmol)置于单口瓶，加入硼氢化锂(572mg，27.0mmol)，置于-15℃低温反应器中，加入无水乙醚(50mL)，搅拌3小时反应结束，加水(30mL)淬灭反应，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，将合并的有机部分干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，用制备液相色谱纯化(条件为0-30min，20-95％乙腈，3mL/min)，得到中间体VI a，无色油状物(159.6mg，24.6％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH6.02(1H,dd,J＝16.5,1.5Hz,H-10),5.75(1H,dd,J＝16.5,6.0Hz,H-11),4.37(1H,qd,J＝6.5,1.5Hz,H-12),4.33(1H,m,H-2),2.76(1H,dt,J＝16.0,2.5Hz,H-5a),2.54(1H,ddd,J＝13.5,7.0,3.5Hz,H-3a),2.40-2.46(2H,重叠,H-1,5b),2.28(1H,m,H-4),1.81(1H,ddd,J＝13.5,3.0,2.0Hz,H-3b),1.31(3H,d,J＝6.5Hz,H-13),1.26(3H,d,J＝6.5Hz,H-7),1.14(3H,s,H-9).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC207.8,134.2,133.1,83.3,81.9,68.4,48.6,43.0,37.3,29.4,23.8,23.4,10.9.HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:263.1259,found:263.1267。
(6)中间体VII a的合成
将中间体VI a(159.6mg，0.66mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯(401.67mg，1.99mmol)、无水吡啶(261mg，3.30mmol)，移至室温搅拌反应5小时，反应结束，得到中间体VII a，不经处理继续下一步反应。
(7)中间体VIII a的合成
向步骤(6)中得到的中间体VII a中加入Boc-乙二胺(528mg，3.30mmol)、4-二甲氨基吡啶(241.6mg，1.98mmol)，室温搅拌反应5小时，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(10/1-1/1，v/v)梯度洗脱纯化，得到中间体VIII a，无色油状物(210.6mg，74.3％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.02(1H,d,J＝16.5Hz,H-10),5.70(1H,dd,J＝16.5,5.5Hz,H-11),5.29(1H,m,H-12),4.33(1H,m,H-2),3.27(4H,重叠,H-15,16),2.75(1H,dd,J＝16.0,2.5Hz,H-5a),2.53(1H,ddd,J＝13.5,6.0,3.0Hz,H-3a),2.41-2.46(2H,重叠,H-1,5b),2.27(1H,m,H-4),1.80(1H,ddd,J＝13.5,2.0,2.0Hz,H-3b),1.44(9H,s,H-19,20,21),1.32(3H,d,J＝7.0Hz,H-13),1.26(3H,d,J＝7.0Hz,H-7),1.13(3H,s,H-9).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 208.1,156.4,156.2,134.5,130.2,83.3,81.9,79.6,70.8,48.6,42.9,41.4,40.6,37.3,29.4,28.3,23.8,20.4,10.9.HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:449.2264,found:449.2298。
(8)中间体IX a的合成
将中间体VIII a(210.6mg，0.49mmol)置于单口瓶，加入硼氢化锂(102.9mg，4.90mmol)，置于-6℃低温反应器中，加入无水乙醚(30mL)，搅拌6小时反应结束，加水(30mL)淬灭反应，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，将合并的有机部分干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，得到中间体IX a，无色油状物(201.6mg，95.2％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 5.91(1H,d,J＝15.6Hz,H-10),5.51(1H,dd,J＝15.6,6.0Hz,H-11),5.29(1H,m,H-12),3.92(1H,m,H-2),3.83(1H,dd,J＝5.4Hz,H-6),3.26(4H,重叠,H-15,16),2.35(1H,ddd,J＝13.2,6.6,3.0Hz,H-3a),2.30(1H,dt,J＝15.0,2.4Hz,H-5a),1.97(1H,m,H-1),1.88(1H,dt,J＝15.0,4.8Hz,H-5b),1.79(1H,m,H-4),1.44(9H,s,H-19,20,21),1.38(1H,ddd,J＝13.2,3.0,1.2Hz,H-3b),1.30-1.35(6H,重叠,H-9,13),1.12(3H,d,J＝7.2Hz,H-7).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 156.3,156.2,134.6,130.1,83.1,79.8,79.6,71.0,67.1,41.3,40.7,39.5,34.0,32.6,29.5,28.4,24.5,20.6,13.9.HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:451.2420,found:451.2524。
(9)中间体X a的合成
将中间体IX a(150.0mg，0.35mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯(211.64mg，1.05mmol)、无水吡啶(140.97mg，1.75mmol)，移至室温搅拌反应4天，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(50/1-1/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到中间体X a，为无色油状物(220.1mg)。
(10)中间体XI a的合成
将中间体X a(220.1mg，0.37mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，加入分散红(139.1mg，0.44mmol)、4-二甲氨基吡啶(90.28mg，0.74mmol)，室温搅拌反应5小时，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(50/1-1/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到中间体XI a，为红色固体(100mg，35.1％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δH8.30(2H,d,J＝8.4Hz,H-35,37),7.92(4H,d,J＝8.4Hz,H-28,32,34,38),6.82(2H,d,J＝8.4Hz,H-29,31),5.88(1H,d,J＝16.2Hz,H-10),5.72(1H,dd,J＝16.2,5.4Hz,H-11),5.27(1H,m,H-12),5.16(1H,dd,J＝6.0Hz,H-6),3.84(1H,m,H-2),3.55-3.60(2H,重叠,H-24),3.48-3.54(2H,overlap,H-25),3.40(2H,m,H-23),3.26(4H,重叠,H-15,16),2.34(1H,brd,J＝18.0Hz,H-3a),2.21(1H,brd,J＝15.6Hz,H-5a),2.03(1H,m,H-1),1.95(1H,dt,J＝16.2,4.2Hz,H-5b),1.74(1H,brs,H-4),1.42(9H,s,H-19,20,21),1.35(3H,brd,J＝12.6Hz,H-3b),1.30(3H,brs,H-13),1.23(3H,t,J＝6.6Hz,H-26),1.13(3H,s,H-9),1.06(3H,d,J＝7.2Hz,H-7).13C NMR(150MHz,CDCl3)δC157.1,156.3,156.1,151.6,147.3,143.5,135.5,129.6,126.8,124.7,122.4,111.7,81.8,79.5,77.5,71.1,69.2,49.9,45.8,41.3,40.7,38.4,37.7,31.9,31.5,29.3,28.3,24.4,20.6,13.0,12.3.HRMS(ESI)calcd for[M+1]+:768.3932,found:768.3877。
(11)中间体XII a的合成
将中间体XI a(80mg，0.10mmol)溶于二氯甲烷(9mL)，加入三氟乙酸溶液(1mL)，室温搅拌反应1小时，反应结束，减压浓缩除去溶剂，得到中间体XII a，不经处理继续下一步反应。
(12)荧光探针XIII a的合成
将步骤(11)中得到的中间体XII a溶于二氯甲烷(5mL)，加入活化的荧光染料(38.9mg，0.1mmol)、三乙胺(41.7μL)，室温搅拌反应6小时，反应结束，通过使用二氯甲烷/甲醇(20/1，v/v)的薄层制备色谱法纯化，得到荧光探针XIII a，为红色固体(44.9mg，46.7％)。HRMS(ESI)calcd for[M+H]+:942.4497,found:942.4488。1H NMR(600MHz,CDCl3)δH8.30(2H,d,J＝8.4Hz,H-44,46),7.12(4H,重叠,H-37,41,43,47),7.09(1H,s,H-25),7.02(2H,d,J＝8.4Hz,H-38,40),6.88(1H,d,J＝3.6Hz,H-27),6.28(1H,d,J＝3.6Hz,H-28),6.12(1H,s,H-22),5.90(1H,d,J＝15.6Hz,H-10),5.70(1H,dd,J＝16.2,4.2Hz,H-11),5.26(1H,m,H-12),5.14(1H,m,H-6),3.83(1H,m,H-2),3.66-3.73(2H,H-33),3.58-3.66(2H,重叠H-34),3.47(2H,m,H-32),3.32(2H,dd,J＝4.8Hz,H-16),3.26(2H,dd,J＝7.2Hz,H-19),3.21(2H,dd,J＝4.8Hz,H-15),2.65(2H,dd,J＝7.2Hz,H-18),2.55(3H,s,H-29),2.34(1H,m,H-3a),2.25(3H,s,H-30),2.18(1H,d,J＝15.6Hz,H-5a),2.02(1H,m,H-1),1.94(1H,dt,J＝15.6,4.8Hz,H-5b),1.74(1H,brs,H-4),1.26-1.36(7H,重叠H-3b,13,35),1.13(3H,s,H-9),1.03(3H,d,J＝7.2Hz,H-7).
13C NMR(150MHz,CDCl3)δC 172.6(C-17),160.5(C-21),157.1(C-31),157.0(C-20),156.8(C-45),156.3(C-14),152.5(C-36),147.0(C-42),144.1(C-24),142.2(C-39),135.4(C-10),135.2(C-23),133.2(C-26),129.7(C-11),128.2(C-27),124.9(C-44,46),123.9(C-25),121.4(C-37,41),121.1(C-43,47),120.6(C-22),117.4(C-28),114.0(C-38,40),81.8(C-8),78.0(C-2),70.9(C-12),69.5(C-6),50.9(C-33),47.2(C-34),41.0(C-15),39.9(C-16),38.4(C-32),37.7(C-1),35.7(C-18),31.9(C-4),31.5(C-5),29.3(C-3),24.8(C-19),24.4(C-9),20.6(C-13),15.0(C-29),13.0(C-7),12.4(C-35),11.3(C-30).
实施例2、荧光探针XIII c的合成：
(3)中间体IV c的合成
将中间体III(8.6g,43.9mmol)溶于干燥二氯甲烷(150mL)，置于-78℃低温反应器中，通入O3至反应溶液呈浅蓝色，停止通入O3，继续反应20分钟，反应结束，转移至常温，滴加二甲硫醚(4mL)，至反应溶液由浅蓝色变无色透明，继续搅拌反应15分钟，反应结束，柱色谱法使用石油醚/乙酸乙酯(10/1-5/1，v/v)梯度洗脱纯化，得到中间体IV c，为无色油状物(1.8g，20.7％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 9.35(1H,s,H-10),4.43(1H,m,H-2),2.62(1H,ddd,J＝10.5,7.0,3.5Hz,H-3a),2.39-2.52(4H,重叠H-1,4,5),1.91(1H,ddd,J＝13.5,3.0,2.0Hz,H-3b),1.55(3H,s,H-9),1.29(3H,d,J＝7.0Hz,H-7).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC206.9,200.6,87.8,82.5,48.8,43.4,35.5,28.2,17.9,11.0.HRMS(ESI)calcd for[M+H]+:199.0970,found:199.0959。
(4)中间体V c的合成
将中间体IV c(1.8g，9.1mmol)溶于二氯甲烷(50mL)，1-三苯基膦烯基-2-丙酮(3.5g，11.2mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，冰浴下将1-三苯基膦烯基-2-丙酮的二氯甲烷溶液滴入中间体IV c中，滴完搅拌5分钟，然后移至室温反应一周。反应结束后，通过使用石油醚/乙酸乙酯(100/1-3/1，v/v)梯度洗脱纯化，得到中间体V c，为无色油状物(1.1g，50.9％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH6.49(1H,d,J＝16.5Hz,H-10),6.02(1H,d,J＝16.5Hz,H-11),4.39(1H,m,H-2),2.69(1H,m,H-5a),2.54(1H,dt,J＝16.0,2.5Hz,H-3a),2.41(1H,qd,J＝6.5,4.0Hz,H-1),2.34(1H,dd,J＝16.0,5.0Hz,5b),2.23(4H,重叠H-4,13),1.90(1H,ddd,J＝13.5,3.0,1.5Hz,H-3b),1.61(3H,s,H-9),1.27(3H,d,J＝6.5Hz,H-7).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 206.8,197.4,145.3,127.8,82.6,82.0,48.8,43.7,36.8,28.6,28.2,21.9,11.0.HRMS(ESI)calcd for[M+H]+:239.1283,found:239.1276。
(5)中间体VI c的合成
将中间体V c(1.1g，4.6mmol)置于单口瓶，加入硼氢化锂(966mg，46.0mmol)，置于-15℃低温反应器中，加入无水乙醚(50mL)，搅拌3小时反应结束，加水(30mL)淬灭反应，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，将合并的有机部分干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，用制备液相色谱纯化(条件为0-45min，20-95％乙腈，3mL/min)，得到中间体VI c，为无色油状物(348.1mg，31.5％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH5.50(1H,dd,J＝16.0,2.0Hz,H-11),5.44(1H,d,J＝16.0Hz,H-10),4.37(1H,m,H-2),4.25(1H,m,H-12),2.71(1H,dd,J＝15.5,2.5Hz,H-5a),2.65(1H,dt,J＝13.5,3.0Hz,H-3a),2.42(1H,qd,J＝7.0,4.0Hz,H-1),2.30(1H,dd,J＝15.5,4.5Hz,H-5b),2.12(1H,m,H-4),1.87(1H,dt,J＝13.5,1.5Hz,H-3b),1.57(3H,s,H-9),1.22-1.25(6H,重叠H-7,13).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 208.6,134.2,130.2,82.4,81.9,68.2,48.7,43.5,37.3,28.4,23.2,22.3,11.0.HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:263.1259,found:263.1244。
(6)中间体VII c的合成
将中间体VI c(348.1mg，1.45mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯(878.78mg，4.35mmol)、无水吡啶(573mg，7.25mmol)，移至室温搅拌反应5小时，反应结束，得到中间体VII c，不经处理继续下一步反应。
(7)中间体VIII c的合成
向步骤(6)中得到的中间体VII c中加入Boc-乙二胺(1160mg，7.25mmol)、4-二甲氨基吡啶(530.7mg，4.35mmol)，室温搅拌反应5小时，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(10:1-1/1，v/v)梯度洗脱纯化，得到中间体VIII c，为无色油状物(549.6mg，88.9％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δH 5.45(2H,重叠H-10,11),5.20(1H,m,H-12),4.38(1H,m,H-2),3.24(4H,重叠H-15,16),2.65(2H,重叠H-3a,5a),2.40(1H,m,H-1),2.29(2H,dd,J＝16.0,4.0Hz,H-5b),2.11(1H,m,H-4),1.86(1H,brd,J＝13.5,H-3b),1.58(3H,s,H-9),1.43(9H,s,H-19,20,21),1.27(6H,重叠H-7,13).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 207.8(C-6),156.3(C-17),156.1(C-14),131.8(C-10),130.1(C-11),82.3(C-8),81.8(C-2),79.5(C-18),70.8(C-12),48.8(C-1),43.6(C-5),41.2(C-15),40.6(C-16),37.3(C-4),28.4(C-3),28.3(C-19,20,21),22.1(C-9),20.4(C-13),11.0(C-7).HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:449.2264,found:449.2230。
(8)中间体IX c的合成
将中间体VIII c(529.0mg，1.24mmol)置于单口瓶，加入硼氢化锂(260.4mg，12.40mmol)，置于-6℃低温反应器中，加入无水乙醚(30mL)，搅拌6小时反应结束，加水(30mL)淬灭反应，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，将合并的有机部分干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，得到中间体IX c，为无色油状物(500.1mg，94.2％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 5.81(1H,d,J＝16.0Hz,H-10),5.63(1H,dd,J＝16.0,6.0Hz,H-11),5.24(1H,m,H-12),3.97(1H,brs,H-2),3.81(1H,dd,J＝5.5Hz,H-6),3.23(4H,重叠H-15,16),2.51(1H,ddd,J＝13.0,7.0,3.5Hz,H-3a),2.19(1H,brd,J＝15.0Hz,H-5a),1.97(1H,qd,J＝7.0,3.0Hz,H-1),1.82(1H,dt,J＝15.0,5.0Hz,H-5b),1.72(1H,m,H-4),1.61(3H,s,H-9),1.42(10H,重叠H-3b,19,20,21),1.28(3H,d,J＝6.5Hz,H-13),1.11(3H,d,J＝6.5Hz,H-7).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 156.4(C-17),156.1(C-14),133.4(C-10),130.6(C-11),81.8(C-8),79.8(C-2),79.4(C-18),70.7(C-12),67.1(C-6),41.2(C-15),40.5(C-16),39.7(C-1),34.8(C-5),33.3(C-4),28.8(C-3),28.4(C-19,20,21),22.7(C-9),20.3(C-13),13.9(C-7).HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:451.2420,found:451.2478。
(9)中间体X c的合成
将中间体IX c(500.1mg，1.17mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯(707.47mg，3.51mmol)、无水吡啶(462.74mg，5.85mmol)，移至室温搅拌反应4天，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(50/1-1/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到中间体X c，为无色油状物(542.4mg,90％)。
(10)中间体XI c的合成
将中间体Xb(542.4mg，0.91mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，加入分散红(342.19mg，1.09mmol)、4-二甲氨基吡啶(222.04mg，1.82mmol)，室温搅拌反应5小时，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(50/1-1/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到中间体XI c，为红色固体(356.1mg，50.7％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δH 8.32(2H,d,J＝9.0Hz,H-35,37),7.96(4H,重叠H-28,32,34,38),6.90(2H,brs,H-29,31),5.71(1H,d,J＝16.2Hz,H-10),5.57(1H,dd,J＝16.2,5.4Hz,H-11),5.20(1H,m,H-12),5.11(1H,m Hz,H-6),3.92(1H,m,H-2),3.59-3.69(2H,重叠H-24),3.45-3.59(3H,重叠H-23a,25),3.34(1H,m,H-23b),3.22(4H,重叠H-15,16),2.51(1H,brd,J＝12.6Hz,H-3a),2.02-2.15(2H,overlap,H-1,5a),1.86(1H,dt,J＝16.2,4.8Hz,H-5b),1.69(1H,brs,H-4),1.55(3H,s,H-9),1.42(10H,重叠H-3b,19,20,21),1.24-1.29(6H,重叠H-13,26),1.06(3H,d,J＝6.6Hz,H-7).13C NMR(150MHz,CDCl3)δC157.3(C-22),156.6(C-17),156.1(C-14),151.7(C-27),155.8(C-36),147.2(C-33),143.4(C-30),134.7(C-10),129.3(C-11),127.1(C-28,32),124.7(C-35,37),122.3(C-34,38),112.1(C-29,31),81.3(C-8),79.6(C-18),77.7(C-2),70.8(C-12),69.4(C-6),50.2(C-24),46.1(C-25),41.6(C-15),40.5(C-16),38.4(C-23),37.9(C-1),32.9(C-4),32.3(C-5),28.6(C-3),28.4(C-19,20,21),23.0(C-9),20.5(C-13),12.9(C-7),12.4(C-26).HRMS(ESI)calcd for[M+1]+:768.3932,found:768.3869。
(11)中间体XII c的合成
将中间体XI c(300mg，0.39mmol)溶于二氯甲烷(27mL)，加入三氟乙酸溶液(3mL)，室温搅拌反应1小时，反应结束，减压浓缩除去溶剂，得到中间体XII c，不经处理继续下一步反应。
(12)荧光探针XIII c的合成
将步骤(11)中得到的中间体XII c溶于二氯甲烷(10mL)，加入活化的荧光染料(151.71mg，0.39mmol)、三乙胺(162.64μL)，室温搅拌反应6小时，反应结束，通过使用二氯甲烷/甲醇(500:1-20/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到荧光探针XIII c，为红色固体(113.1mg，30.8％)。HRMS(ESI)calcd for[M+1]+:942.4497,found:942.4453。1H NMR(600MHz,CDCl3)δH 8.30(2H,d,J＝9.0Hz,H-44,46),7.89(2H,d,J＝9.0Hz,H-43,47),7.87(2H,d,J＝9.0Hz,H-37,41),7.06(1H,s,H-25),6.86(1H,d,J＝3.6Hz,H-27),6.82(2H,d,J＝9.0Hz,H-38,40),6.28(1H,d,J＝3.6Hz,H-28),6.10(1H,s,H-22),5.70(1H,d,J＝16.2Hz,H-10),5.55(1H,dd,J＝16.2,4.8Hz,H-11),5.18(1H,m,H-12),5.09(1H,m,H-6),3.91(1H,m,H-2),3.54-3.60(2H,重叠H-33),3.45-3.54(3H,重叠H-34,32a),3.29-3.38(2H,重叠H-16a,32b),3.21-3.29(3H,重叠H-16b,19),3.09-3.20(2H,重叠H-15),2.64(2H,dd,J＝7.2Hz,H-18),2.54(3H,s,H-29),2.48(1H,d,J＝12.6Hz,H-3a),2.23(3H,s,H-30),2.12(1H,d,J＝12.6Hz,H-5a),2.05(1H,m,H-1),1.84(1H,m,H-5b),1.66(1H,brs,H-4),1.54(3H,s,H-9),1.43(1H,m,H-3b),1.21-1.25(6H,overlap,H-13,35),1.06(3H,d,J＝6.0Hz,H-7).
13C NMR(150MHz,CDCl3)δC 173.0(C-17),160.3(C-21),157.3(C-31),157.0(C-20),156.8(C-45),156.1(C-14),151.4(C-36),147.2(C-42),144.0(C-24),143.6(C-39),135.1(C-23),134.5(C-10),133.3(C-26),129.4(C-11),128.2(C-27),126.4(C-37,41),124.6(C-44,46),123.8(C-25),122.5(C-43,47),120.5(C-22),117.3(C-28),111.4(C-38,40),81.4(C-8),77.7(C-2),70.6(C-12),69.3(C-6),49.9(C-33),45.6(C-34),41.5(C-15),39.5(C-16),38.3(C-32),37.9(C-1),35.6(C-18),32.9(C-4),32.2(C-5),28.6(C-3),24.8(C-19),23.1(C-9),20.6(C-13),14.9(C-29),13.0(C-7),12.3(C-35),11.3(C-30).
实施例3、荧光探针XIII d的合成：
(5)中间体VI d的合成
将中间体V c(1.1g，4.6mmol)置于单口瓶，加入硼氢化锂(966mg，46.0mmol)，置于-15℃低温反应器中，加入无水乙醚(50mL)，搅拌3小时反应结束，加水(30mL)淬灭反应，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，将合并的有机部分干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，用制备液相色谱纯化(条件为0-45min，20-95％乙腈，3mL/min)，得到中间体VI d，为无色油状物(313.1mg，28.3％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 5.53(1H,dd,J＝16.0,5.0Hz,H-11),5.46(1H,d,J＝16.0Hz,H-10),4.37(1H,m,H-2),4.28(1H,m,H-12),2.72(1H,dd,J＝15.5,3.0Hz,H-5a),2.66(1H,ddd,J＝13.0,7.0,3.5Hz,H-3a),2.40(1H,qd,J＝6.5,4.0Hz,H-1),2.30(1H,dd,J＝15.5,4.5Hz,H-5b),2.14(1H,m,H-4),1.87(1H,ddd,J＝13.0,2.5,1.5Hz,H-3b),1.58(3H,s,H-9),1.23-1.26(6H,重叠H-7,13).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 208.4(C-6),134.2(C-11),130.0(C-10),82.5(C-8),81.9(C-2),67.8(C-12),48.7(C-1),43.6(C-5),37.3(C-4),28.5(C-3),23.1(C-13),22.4(C-9),11.0(C-7).HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:263.1259,found:263.1248。
(6)中间体VII d的合成
将中间体VI d(313.1mg，1.30mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯(786.08mg，3.90mmol)、无水吡啶(514mg，6.50mmol)，移至室温搅拌反应5小时，反应结束，得到中间体VII d，不经处理继续下一步反应。
(7)中间体VIII d的合成
向步骤(6)中得到的中间体VII d中加入Boc-乙二胺(1040mg，6.50mmol)、4-二甲氨基吡啶(475.8mg，3.90mmol)，室温搅拌反应5小时，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(10/1-1/1，v/v)梯度洗脱纯化，得到中间体VIII d，为无色油状物(299.1mg，53.8％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δH 5.50(1H,d,J＝16.0Hz,H-10),5.30(1H,dd,J＝16.0,6.5Hz,H-11),5.12(1H,m,H-12),4.37(1H,m,H-2),3.14-3.39(4H,重叠H-15,16),2.60-2.71(2H,重叠H-3a,5a),2.38(1H,qd,J＝6.5,3.5Hz,H-1),2.26(1H,dd,J＝15.5,4.0Hz,H-5b),2.10(1H,m,H-4),1.85(1H,brd,J＝13.5,H-3b),1.55(3H,s,H-9),1.42(9H,s,H-19,20,21),1.25(6H,overlap,H-7,13).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 208.3(C-6),156.4(C-17),156.2(C-14),133.0(C-10),129.4(C-11),82.0(C-8),81.8(C-2),79.1(C-18),71.2(C-12),48.7(C-1),43.6(C-5),41.1(C-15),40.3(C-16),37.0(C-4),28.4(C-3,19,20,21),21.9(C-9),20.3(C-13),10.9(C-7).HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:449.2264,found:449.2254。
(8)中间体IX d的合成
将中间体VIII d(279.0mg，0.65mmol)置于单口瓶，加入硼氢化锂(137.3mg，6.5mmol)，置于-6℃低温反应器中，加入无水乙醚(30mL)，搅拌6小时反应结束，加水(30mL)淬灭反应，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，将合并的有机部分干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，得到中间体IX d，为无色油状物(250.0mg，87.8％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 5.80(1H,d,J＝16.0Hz,H-10),5.51(1H,dd,J＝16.0,6.5Hz,H-11),5.21(1H,m,H-12),3.97(1H,brs,H-2),3.74(1H,dd,J＝5.0Hz,H-6),3.27(2H,m,H-15),3.13(2H,m,16),2.51(1H,ddd,J＝13.0,6.5,3.0Hz,H-3a),2.15(1H,brd,J＝15.0Hz,H-5a),1.97(1H,m,H-1),1.80(1H,dt,J＝15.0,5.0Hz,H-5b),1.70(1H,m,H-4),1.59(3H,s,H-9),1.43(10H,重叠H-3b,19,20,21),1.27(3H,d,J＝6.5Hz,H-13),1.11(3H,d,J＝7.0Hz,H-7).13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 156.6(C-17),155.9(C-14),135.0(C-10),129.6(C-11),81.7(C-8),79.7(C-2),79.0(C-18),70.7(C-12),66.9(C-6),41.2(C-15),39.8(C-16),39.6(C-1),34.5(C-5),33.4(C-4),28.7(C-3),28.4(C-19,20,21),22.9(C-9),20.2(C-13),13.8(C-7).HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+:451.2420,found:451.2468。
(9)中间体X d的合成
将中间体IX d(250.0mg，0.58mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯(350.71mg，1.74mmol)、无水吡啶(229.39mg，2.90mmol)，移至室温搅拌反应4天，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(50/1-1/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到中间体X d，为无色油状物(303.2mg，88％)。
(10)中间体XI d的合成
将中间体X d(303.2mg，0.51mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，加入分散红(191.15mg，0.61mmol)、4-二甲氨基吡啶(148.84mg，1.22mmol)，室温搅拌反应5小时，反应结束，通过使用石油醚/乙酸乙酯(50/1-1/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到中间体XI d，为红色固体(214.3mg，54.6％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δH 8.31(2H,d,J＝8.4Hz,H-35,37),7.96(4H,重叠H-28,32,34,38),6.91(2H,brd,H-29,31),5.66-5.79(2H,重叠H-10,11),5.14(2H,重叠H-6,12),3.92(1H,m,H-2),3.46-3.70(5H,重叠H-23a,24,25),3.40(1H,brs,H-23b),3.22(4H,重叠H-15,16),2.52(1H,brd,J＝12.0Hz,H-3a),2.02-2.12(2H,重叠H-1,5a),1.86(1H,dt,J＝15.6,5.4Hz,H-5b),1.66(1H,brs,H-4),1.54(3H,s,H-9),1.42(10H,重叠H-3b,19,20,21),1.23-1.30(6H,重叠H-13,26),1.08(3H,d,J＝6.6Hz,H-7).13C NMR(150MHz,CDCl3)δC 157.4(C-22),156.5(C-17),156.4(C-14),155.8(C-36),152.3(C-27),147.2(C-33),143.0(C-30),134.4(C-10),129.9(C-11),127.5(C-28,32),124.7(C-35,37),122.2(C-34,38),112.3(C-29,31),80.7(C-8),79.5(C-18),77.8(C-2),70.7(C-12),69.2(C-6),50.2(C-24),46.1(C-25),41.7(C-15),40.3(C-16),38.4(C-23),38.0(C-1),32.6(C-4),32.5(C-5),28.7(C-3),28.4(C-19,20,21),22.4(C-9),19.2(C-13),12.9(C-7),12.4(C-26).HRMS(ESI)calcd for[M+1]+:768.3932,found:768.3873。
(11)中间体XII d的合成
将中间体XI d(180mg，0.23mmol)溶于二氯甲烷(18mL)，加入三氟乙酸溶液(2mL)，室温搅拌反应1小时，反应结束，减压浓缩除去溶剂，得到中间体XII d，不经处理继续下一步反应。
(12)荧光探针XIII d的合成
将步骤(11)中得到的中间体XII d溶于二氯甲烷(10mL)，加入活化的荧光染料(89.47mg，0.23mmol)、三乙胺(95.9μL)，室温搅拌反应6小时，反应结束，通过使用二氯甲烷/甲醇(500:1-20/1，v/v)的柱色谱法梯度洗脱纯化，得到荧光探针XIII d，为红色固体(91.2mg，42.1％)。HRMS(ESI)calcd for[M+1]+:942.4497,found:942.4477。1H NMR(600MHz,CDCl3)δH 8.30(2H,d,J＝8.4Hz,H-44,46),7.89(2H,d,J＝8.4Hz,H-43,47),7.85(2H,d,J＝8.4Hz,H-37,41),7.06(1H,s,H-25),6.86(1H,d,J＝3.6Hz,H-27),6.81(2H,d,J＝8.4Hz,H-38,40),6.26(1H,d,J＝3.6Hz,H-28),6.09(1H,s,H-22),5.70(1H,d,J＝16.2Hz,H-10),5.61(1H,dd,J＝16.2,6.0Hz,H-11),5.21(1H,m,H-12),5.11(1H,m,H-6),3.90(1H,m,H-2),3.42-3.61(5H,重叠H-33,34,32a),3.31-3.38(2H,重叠H-16a,32b),3.24-3.28(2H,dd,J＝7.2Hz,H-19),3.14-3.23(2H,重叠H-15a,16b),3.09(1H,m,H-15b),2.64(2H,dd,J＝7.2Hz,H-18),2.53(3H,s,H-29),2.48(1H,d,J＝12.6Hz,H-3a),2.22(3H,s,H-30),2.07(1H,重叠H-5a),2.00-2.05(1H,重叠H-1),1.81(1H,m,H-5b),1.64(1H,brs,H-4),1.53(3H,s,H-9),1.41(1H,m,H-3b),1.20-1.25(6H,重叠H-13,35),1.06(3H,d,J＝6.6Hz,H-7).
13C NMR(150MHz,CDCl3)δC 172.6(C-17),160.2(C-21),157.4(C-31),157.3(C-20),156.8(C-45),156.4(C-14),151.5(C-36),147.2(C-42),143.9(C-24),143.6(C-39),135.1(C-23),134.8(C-10),133.3(C-26),129.9(C-11),128.3(C-27),126.3(C-37,41),124.6(C-44,46),123.8(C-25),122.5(C-43,47),120.4(C-22),117.4(C-28),111.3(C-38,40),81.7(C-8),77.8(C-2),70.8(C-12),69.3(C-6),49.8(C-33),45.6(C-34),41.4(C-15),39.3(C-16),38.4(C-32),38.0(C-1),35.7(C-18),32.6(C-4),32.4(C-5),28.6(C-3),24.8(C-19),22.2(C-9),19.4(C-13),14.9(C-29),13.0(C-7),12.3(C-35),11.3(C-30).
实验例1、探针XIII a与Heme作用
将Hemin(0.65mg，0.001mmol)，抗坏血酸钠(1.98mg，0.01mmol)，溶于0.1M氢氧化钠溶液(100μL)，加入荧光探针XIII a(0.94mg，0.001mmol,溶解于乙腈100μL)，继续反应30分钟，反应结束，取样进行HPLC-MS分析。得到Hemin烷基化的产物和游离荧光染料的产物。两个产物均经高分辨质谱确定，Hemin烷基化的产物：HRMS(ESI)calcd for[M-Fe]+:1083.3942,found:1083.3964(图1)。游离荧光染料的产物：HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+497.2147，found:497.2148(图2)。说明荧光探针XIIIa能被heme激活，可用于heme的检测。将反应移至96孔板中进行，用荧光检测反应的。结果表明探针具有非常弱的荧光信号，但在heme的作用下，荧光信号增加了约3倍(图3)。由于heme在疟原虫体内含量很高，该荧光探针可实现对疟原虫的检测。
实验例2、探针XIII c与Heme作用
将Hemin(0.65mg，0.001mmol)，抗坏血酸钠(1.98mg，0.01mmol)，溶于0.1M氢氧化钠溶液(100μL)，加入荧光探针XIII c(0.94mg，0.001mmol，溶解于乙腈100μL)，继续反应30分钟，反应结束，取样进行HPLC-MS分析。得到Hemin烷基化的产物和游离荧光染料的产物。两个产物均经高分辨质谱确定，Hemin烷基化的产物：HRMS(ESI)calcd for[M]+:1083.3942,found:1083.3964(图4)。游离荧光染料的产物：HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+497.2147，found:497.2142(图5)。说明荧光探针XIII c能被heme激活，可用于heme的检测。将反应移至96孔板中进行，用荧光检测反应的。结果表明探针具有非常弱的荧光信号，但在heme的作用下，荧光信号增加了约43倍(图6)。由于heme在疟原虫体内含量很高，该荧光探针可实现对疟原虫的检测。
实验例3、探针XIII d与Heme作用
将Hemin(0.65mg，0.001mmol)，抗坏血酸钠(1.98mg，0.01mmol)，溶于0.1M氢氧化钠溶液(100μL)，加入荧光探针XIII d(0.94mg，0.001mmol，溶解于乙腈100μL)，继续反应60分钟，反应结束，取样进行HPLC-MS分析。得到Hemin烷基化的产物和游离荧光染料的产物。两个产物均经高分辨质谱确定，Hemin烷基化的产物：HRMS(ESI)calcd for[M]+:1083.3942,found:1083.3967(图7)。游离荧光染料的产物：HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+497.2147，found:497.2139(图8)。说明荧光探针XIII d能被heme激活，可用于heme的检测。将反应移至96孔板中进行，用荧光检测反应的。结果表明探针具有非常弱的荧光信号，但在heme的作用下，荧光信号增加了100多倍(图9)。由于heme在疟原虫体内含量很高，该荧光探针可实现对疟原虫的检测。实施例9、探针XIII检测疟原虫的应用(以恶性疟原虫为例)
将探针XIII a，XIII c，XIII d与待检测红细胞孕孵3小时，然后用激光共聚焦仪或流式细胞分析仪检测红细胞的荧光强度，即可检测到感染红细胞的疟原虫。激光共聚焦的结果如图10所示，流式细胞分析仪的结果如图11所示。这些结果表明三种探针均能检测出感染疟原虫的红细胞。
Claims (5)
1.如下化合物或其药学上可接受的盐:
2.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物XIII包括以下异构体：
3.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将式Ⅰ化合物氧化，得到中间体式Ⅱ化合物：将式Ⅰ化合物加入光反应器中，加入乙腈、亚甲基蓝，通氧气，打开光反应器，0℃搅拌至反应完成，得到中间体式Ⅱ化合物，不经处理继续下一步反应；
(2)向步骤(1)中得到的中间体式Ⅱ化合物中加入对甲基苯磺酸，室温搅拌使其均匀分散后，室温下反应12个小时，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式III化合物；
(3)将步骤(2)中得到的中间体式III化合物溶于二氯甲烷，置于-78℃低温反应器中，通入O3反应至溶液呈浅蓝色，反应结束后，转移至常温，滴加二甲硫醚，搅拌至反应完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式IV化合物；
(4)将步骤(3)中得到的中间体式IV化合物溶于二氯甲烷，冰浴下滴加1-三苯基膦烯基-2-丙酮的二氯甲烷溶液，搅拌5分钟后移至室温反应，反应结束后，柱层析纯化得到中间体式V化合物；
(5)向步骤(4)中得到的中间体式V化合物中加入硼氢化锂，加入无水乙醚，于-15℃低温反应器中搅拌至反应结束，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，将合并的有机部分用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩除去有机相，得到中间体式VI化合物；
(6)将步骤(5)中得到的中间体式VI化合物溶于二氯甲烷，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯、无水吡啶，移至室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式VII化合物；
(7)将步骤(6)中得到的中间体式VII化合物溶于二氯甲烷，加入Boc-乙二胺、4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式VIII化合物；
(8)向步骤(7)中得到的中间体式VIII化合物中加入硼氢化锂，加入无水乙醚，于-6℃低温反应器中搅拌至反应结束，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪旋干，得到中间体式IX化合物；
(9)将步骤(8)中得到的中间体式IX化合物溶于二氯甲烷，冰浴下加入4-硝基苯基氯甲酸酯、无水吡啶，移至室温搅拌反应3天至反应完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式X化合物；
(10)将步骤(9)中得到的中间体式X化合物溶于二氯甲烷，加入分散红、4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到中间体式XI化合物；
(11)将步骤(10)中得到的中间体式XI化合物溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸，室温搅拌至反应完成，旋转蒸发仪除去溶剂，得到中间体式XII化合物，不经处理继续下一步反应；
(12)将步骤(11)中得到的中间体式XII化合物溶于二氯甲烷，加入N-羟基丁二酰亚胺活化的荧光染料、三乙胺，室温搅拌反应至完成，蒸去溶剂，柱层析纯化得到式XIII化合物，
4.权利要求1中VIII化合物或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备检测亚铁血红素相关产品中的应用。
5.权利要求1中VIII化合物或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备检测疟原虫或其它含亚铁血红素的生物体相关产品中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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