CN114072206A - 治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗或预防增生性视网膜疾病的方法。

Description

治疗方法
发明领域
本发明涉及治疗和预防增生性视网膜疾病的方法。
本文中提到和本说明书结尾所列的所有文献均以引用的方式并入本文中。
背景技术
补体
补体系统为身体针对外来侵袭的自然防御机制的基本部分并且还参与发炎过程。血清中和细胞表面处的超过30种蛋白质参与补体系统的运行和调节。最近，已变得显而易见的是除了可与有益过程和病理过程二者相关的补体系统的大约35种已知组分外，补体系统自身还与具有如血管新生、血小板活化和止血、葡萄糖代谢和精子发生的多样功能的至少85种生物路径相互作用。
补体系统通过免疫系统识别为非自身的材料的存在活化。存在三种活化路径：(1)经典路径，其通过IgM和IgG复合体或通过识别碳水化合物而活化；(2)旁路路径，其通过非自身表面(缺少特异性调节分子)和通过细菌内毒素而活化；和(3)凝集素路径，其通过甘露聚糖结合凝集素(MBL)与病原体表面上的甘露糖残基结合而活化。三种路径包含通过在细胞表面上形成类似C31和C5转化酶，从而引起急性发炎介体(C3a和C5a)释放和攻膜复合体(MAC)形成，引起产生补体活化的事件的平行级联。在经典(此处定义为经典通过C1q，且凝集素通过MBL)和旁路路径中所涉及的平行级联展示于图1中。
经典补体路径、旁路补体路径和凝集素补体路径在本文中统称为补体路径。C5b起始补体活化的‘晚期’或‘末期’事件。这些包括一系列聚合反应，其中末端补体组分相互作用以形成MAC，其在一些病原体的细胞膜中产生孔而可使得其死亡，或活化身体自身的细胞而不引起溶解。末端补体组分包括C5b(其起始攻膜系统组装)、C6、C7、C8和C9。
LTB4
Figure BDA0003430629220000011
白三烯B4(LTB4)为描述的最强力趋化性和化学增活的类二十烷酸且通过整合素上调促进嗜中性粒细胞粘附至血管内皮[1]。它还是嗜中性粒细胞的完全促泌素，诱导其聚集且增加微血管渗透性。LTB4募集和活化自然杀伤细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。其增加超氧自由基形成[2]且调节基因表达，包括多种可加强和延长组织发炎的促炎性细胞因子和介体的产生[3,4]。LTB4还在诱导和管理后天性免疫反应中有作用。举例来说，调节树突状细胞运输至引流淋巴结[5,6]、来自肺T细胞的Th2细胞因子IL-13产生[7]、募集抗原特异性效应CD8+T细胞[8]和人B淋巴细胞的活化和增殖[9]。
LTB4和羟基类二十烷酸通过BLT1和BLT2 G蛋白偶联受体介导其作用[10,11]。人BLT1为特异性针对LTB4的高亲和力受体(Kd 0.39-1.5nM；[12])，其中仅20个羟基的LTB4和12epi的LTB4能够在竞争性结合研究中取代LTB4[13]。人BLT2具有比BLT1低20倍的针对LTB4的亲和力(Kd 23nM)且通过结合更广范围的类二十烷酸，包括12epi的LTB4、20个羟基的LTB4、12(S)-和15(S)-HETE和12(S)-和15(S)-HPETE来活化[13]。人BLT2与人和小鼠BLT1具有45.2％和44.6％氨基酸同一性，而人和小鼠BLT2具有92.7％同一性[11]。
人BLT1主要表达于白细胞表面上，不过最近描述了其表达于内皮细胞和血管平滑肌细胞中。人BLT2表达于更广范围的组织和细胞类型中。已描述BLT1和BLT2的多种特异性拮抗剂，其抑制人嗜中性粒细胞的活化、外渗和细胞凋亡[14]并且减少由发炎关节炎[15]和肾缺血再灌注[16]的小鼠模型中的嗜中性粒细胞浸润引起的症状。越来越多的研究指示BLT1和BLT2均可通过LTB4和羟基类二十烷酸介导病理作用[17]，但BLT1当然在一些病变，例如小鼠中的胶原蛋白诱导的关节炎中具有主导作用[18]。BLT1-/-缺陷小鼠也已突出显示了BLT1在发炎性反应中引导嗜中性粒细胞迁移中的重要性。确切地说，5LO缺陷小鼠品系用于展示BLT1于嗜中性粒细胞上的自分泌活化对于将嗜中性粒细胞募集至关节炎关节中为所需的[19]。
多种市售药物以类二十烷酸为目标。这些包括糖皮质激素，其调节磷脂酶A2(PLA2)且由此抑制类二十烷酸前体花生四烯酸(AA)的释放[20]。非类固醇抗炎药(NSAID)和其它防止前列腺素和血栓素合成的COX2抑制剂[21]。还存在多种白三烯(LK)调节剂，其抑制LTB4合成和其它白三烯所需的5-LOX酶(齐留通(Zileuton)；[22])，或拮抗介导半胱氨酰基白三烯作用的CysLT1受体(扎鲁司特(Zafirlukast)和孟鲁司特(Montelukast))[23]。LK调节剂为口服可用的且已由FDA批准用于治疗例如哮喘。市面上还没有特异性作用于LTB4或其受体的药物。
眼病状况
背景
本发明涉及治疗增生性视网膜疾病，其为涉及视网膜上血管形成的视网膜病状。举例来说，血管可回应于由视网膜缺血引起的血液供应减少而产生。此新血管生成一般回应于生长激素血管内皮细胞生长因子(VEGF)发生，所述因子刺激在视神经盘或视网膜表面上产生新血管。然而，这些新血管尤其弱，易于渗漏且可容易地断裂，导致出血和严重视觉损失。
所述疾病包括自身免疫葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)(脉络膜新血管形成)、干性年龄相关性黄斑变性(地图状萎缩)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视神经炎(例如青光眼相关视神经炎)、视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病。还包括斯塔加特氏病(Stargardt disease)和息肉状脉络膜血管病变。尤其相关的是葡萄膜炎。
当前存在用于这些病状中的某些的治疗。举例来说，在非感染性葡萄膜炎中，治疗集中于用抗炎药品控制眼发炎，所述药品例如作为滴眼剂，或注射于眼中或周围、口服(经口)或静脉内给予的类固醇(例如皮质类固醇)或免疫调节疗法(IMT)药物(例如甲氨喋呤、硫唑嘌呤和霉酚酸酯)、生物反应调节(BRM)药物(例如抗TNFα剂，其可以是结合TNFα的抗体或其片段，例如英利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))。对于湿性AMD，糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞和糖尿病性视网膜病变当前治疗包括抗VEGF治疗。这些包括抗VEGF-A抗体或其片段(如贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin))、兰比珠单抗(ranibizumab)(乐舒晴(Lucentis)))、抗VEGF适体(如哌加他尼(pegaptanib)(玛古真(Macugen)))，和其它VEGF拮抗剂，如阿柏西普(aflibercept)(埃利亚(Eylea))，一种由与人IgG1免疫球蛋白的Fc部分融合的来自人VEGF受体1和2的细胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分组成的重组融合蛋白))。所述抗VEGF药品可以大约每1到2个月玻璃体内注射。还已提议这些治疗用于早产儿视网膜病。
增生性视网膜疾病仍未满足临床需求。
补体抑制剂
WO 2004/106369(Evolutec Limited[24])涉及补体抑制剂。所公开的补体抑制剂的特定子集针对C5且防止C5通过补体活化路径中的任一个裂解为C5a和C5b。C5裂解的所述抑制剂的特定实例为由蜱物种毛白钝缘蜱(Ornithdoros moubata)产生的蛋白质，其成熟形式为由WO 2004/106369的图4中示出的氨基酸序列的氨基酸19到168组成的蛋白质。在WO2004/106369中，这种蛋白质称为“rVA576”、“EV576”和“OmCI蛋白质”并且最近被称为“Coversin”[25]。此蛋白质在本文中称为“nomacopan”，其为蛋白质的INN。
在蜱中，nomacopan表达为具有前导序列的前蛋白质，所述前导序列包含在成熟nomacopan蛋白质的N端处的如WO 2004/106369的图4中所示的氨基酸序列的氨基酸1到18。前导序列在表达之后裂解掉。成熟蛋白质具有由WO 2004/106369的图4和本申请的图2中示出的氨基酸序列的氨基酸19到168组成的序列。
nomacopan还具有抑制白三烯B4(LTB4)活性的能力。结合LTB4的能力可通过所属领域中已知的标准体外分析展现，例如借助于nomacopan与抗LTB4抗体间竞争与标记的LTB4结合的竞争性ELISA、通过等温滴定量热法或通过荧光滴定。
存在多个另外的专利申请，如WO 2007/028968、WO 2008/029167、WO 2008/029169、WO 2011/083317和WO 2016/198133，其涉及在各种应用中使用nomacopan或其功能等效物。在这些应用中不存在证实nomacopan或其任何功能等效物在治疗增生性视网膜疾病中的功效的实验证据。
在本发明之前的研究中，本发明人已展示LTB4受体和C5a受体共同位于实验自身免疫葡萄膜炎模型中使用的小鼠的视网膜内细胞上，其中疾病通过注射视网膜结合蛋白(RBP3)诱导。这些细胞中的至少一些被认为是M2巨噬细胞，其已知迁移到视网膜损伤区域，其在此回应于LTB4刺激释放VEGF。此外，当注射于玻璃体内时，如上文所论述的分子nomacopan(其结合LTB4并且还通过与C5结合抑制补体路径)，和nomacopan和LTB4特异性nomacopan的长效形式(或“L-nomacopan”，其结合LTB4但不通过与C5结合抑制补体路径)，在本文中称为PAS-nomacopan和PAS-L-Nomacopan，已经展示提高实验自身免疫葡萄膜炎(EAU)模型中的临床评分和复合组织学评分。这些分子还减少Th17细胞的群体(和IL-17)。Th17子集已在人葡萄膜炎中检测到并且在EAU中介导疾病。当局部施用时，nomacopan，L-nomacopan和长效nomacopan还对这些小鼠中的临床评分具有影响，这被视为出人意料的，因为不认为这一分子可穿透角膜。
本发明人还已经展示，在EAU的个别小鼠模型中，用RBP3(也称为IRBP)诱导引起视网膜组织中VEGF水平的显著增加。nomacopan型蛋白质的玻璃体内注射引起VEGF水平降低，如同玻璃体内注射抗VEGF抗体(实施例4和图7A)。因为不知道nomacopan和其变异体对VEGF具有任何直接作用，所以提出这是通过至少抑制上文提及的被认为是这种模型中VEGF的主要来源的M2巨噬细胞的LTB4活化的间接作用。还认为通过nomacopan型蛋白质从嗜中性粒细胞清除LTB4也具有减少视网膜到外周血液LTB4浓度梯度的作用，由此减少Th17细胞(如实施例3中所示)和巨噬细胞的发炎细胞运输。
nomacopan能够抑制LTB4并且因此在单独或与其它治疗组合预防和治疗增生性视网膜疾病方面特别有利。此外，其可以抑制补体路径(通过抑制C5)，这例如在补体路径涉及疾病病变的情况下提供某些优点。抑制LTB4但不抑制C5的nomacopan的修饰形式也可为有用的，且尤其在抑制补体路径可能不合需要的情况下。
先前已将nomacopan公开为眼表面病状(例如特应性角膜结膜炎，通过将蛋白质施用到眼表面，参见例如WO2018193120)的潜在治疗，但先前不知道分子可穿透角膜且因此可局部施用以治疗不是眼表面病状的眼病状，先前也不知道当直接施用到眼中时分子可有效。举例来说，即使当直接施用到眼中时，由于各种屏障(如内部限制膜和布鲁赫氏膜(Bruch's membrane)的存在)，治疗性分子也可能不能够达到其有效作用所需的位置。实际上，先前已经针对眼病状测试各种先前补体抑制剂分子，但未发现其有效(参见例如[26])。
因此在本发明研究之前，并不知道nomacopan型蛋白质可以通过局部施用或通过直接引入到眼中用来治疗增生性视网膜疾病。此外，不知道nomacopan型蛋白质可以用于降低视网膜组织中的VEGF水平。
发明内容
现在已展示nomacopan型蛋白质在局部施用时或通过直接引入到眼中降低实验自身免疫葡萄膜炎小鼠模型中的临床评分。这表明所述蛋白质能够用于治疗葡萄膜炎，以及支持所述蛋白质单独或与其它治疗组合用于治疗增生性视网膜疾病的用途。nomacopan此外具有抑制补体路径(通过抑制C5)以及LTB4的能力，并且因此在也存在补体组分的情况下，在单独或与其它治疗组合预防和治疗增生性视网膜疾病中尤其有利。可进一步操纵蛋白质的双功能，使得其结合LTB4但不结合C5的修饰形式(例如L-nomacopan)可在不存在补体组分和/或抑制补体系统可能不利的情况下，在预防和治疗增生性视网膜疾病中尤其有利。同样，这可以是单独或与其它治疗组合的。
在实施例1中，局部施用nomacopan型蛋白质降低小鼠模型中实验自身免疫葡萄膜炎中的临床评分。在后续实施例中，玻璃体内施用nomacopan型蛋白质降低小鼠模型中实验自身免疫葡萄膜炎中的临床评分。
本发明人因此已证实，施用蜱蛋白质Nomacopan(在所属领域中并且在本文[24]中也称为EV576和OmCI，且此前被称作“Coversin”)和其变异体可以用于治疗或预防自身免疫葡萄膜炎和其它增生性视网膜疾病。
因此，本发明提供一种治疗或预防增生性视网膜疾病的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
本发明还提供一种用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
本发明还提供一种治疗或预防受试者的增生性视网膜疾病的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的核酸分子。
本发明还提供一种用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的核酸分子。
本发明还提供一种治疗或预防受试者的增生性视网膜疾病的方法，其包括向所述受试者施用(a)治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，和(b)第二增生性视网膜疾病治疗。
本发明还提供用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的(a)一种试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，和(b)一种第二增生性视网膜疾病治疗。
本发明还提供一种治疗或预防受试者的增生性视网膜疾病的方法，其包括向所述受试者施用(a)治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的核酸分子，和(b)第二增生性视网膜疾病治疗。
本发明还提供用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的(a)一种试剂，其为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的核酸分子，和(b)一种第二增生性视网膜疾病。
本发明还提供一种减少治疗或增生性视网膜疾病所需的第二增生性视网膜疾病治疗的量，或减少用第二增生性视网膜疾病治疗来治疗或预防增生性视网膜疾病所需的治疗持续时间，或增加用所述第二增生性视网膜疾病治疗进行的连续治疗之间的时间量的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，或编码所述试剂的核酸分子，和所述第二增生性视网膜疾病治疗。
实施例4展示nomacopan型蛋白质可有效地降低EAU的小鼠模型中VEGF水平。因为不知道nomacopan和其变异体对VEGF具有任何直接作用，所以提出这是通过抑制上文提及的被认为是这种模型中VEGF的主要来源的M2巨噬细胞的LTB4活化的间接作用。
因此，本发明的试剂和方法可以通过降低例如视网膜组织中的VEGF水平来预防或治疗如本文中其它地方所描述的增生性视网膜疾病。举例来说，通过减少视网膜组织中的VEGF信号传导。所述减少的作用继而引起例如血管新生的减少和/或血管渗透性的减少。
本发明的试剂和方法还可以通过减少M2巨噬细胞的LTB4活化来预防或治疗如本文中其它地方所描述的增生性视网膜疾病。
具体实施方式
疾病
增生性视网膜疾病为视网膜病状，其涉及视网膜上的血管形成。举例来说，血管可回应于由视网膜缺血引起的血液供应减少而产生。此新血管生成一般回应于生长激素血管内皮细胞生长因子(VEGF)发生，所述因子刺激在视神经盘或视网膜表面上产生新血管。然而，这些新血管尤其弱，易于渗漏且可容易地断裂，导致出血和严重视觉损失。可能的增生性视网膜疾病包括自身免疫葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、湿性年龄相关性黄斑变性(脉络膜新血管形成)、干性年龄相关性黄斑变性(地图状萎缩)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视神经炎(例如青光眼相关)、视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病。其它增生性视网膜疾病包括斯塔加特氏病和息肉状脉络膜血管病变。
本发明人已在实验自身免疫葡萄膜炎小鼠模型中的实验中测试nomacopan、L-nomacopan、PAS-nomacopan和PAS-L-nomacopan。局部施用某些分子。玻璃体内施用某些分子。如在实施例1和3中所陈述，展示nomacopan型蛋白质可降低此小鼠模型中的临床评分。下文呈现的数据还展现，这些分子可以减少Th-17细胞的群体并且由此降低IL-17水平。本发明人还已经展示，在此小鼠模型中，可在浸润到小鼠视网膜中的细胞上观察到LTB4受体(BLT1)。此外，这些nomacopan型分子可以与LTB4结合并且抑制其作用。
所测试的分子减少LTB4信号传导的能力符合在视网膜损伤时M2巨噬细胞迁移并且附接到视网膜的损伤区域的观察结果。这些M2巨噬细胞随后回应于LTB4刺激释放VEGF，其刺激新血管的产生[35]。因此，不希望受任何理论所束缚，认为nomacopan型蛋白质的施用引起VEGF水平的降低，其减少和/或阻止新血管的产生。此理论符合实施例4和图7A中的数据，其展现在EAU的小鼠模型中，nomacopan型蛋白质的施用显著降低视网膜组织中VEGF的水平。
因此，nomacopan型蛋白质可用于治疗或预防增生性视网膜疾病。因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的增生性视网膜疾病的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，其用于预防或治疗增生性视网膜疾病。
这些疾病的存在可通过所属领域中充分理解的常规诊断测定。还可以对某些病状的严重程度评分，这可用于评估某一治疗是否有效。
葡萄膜炎
自身免疫葡萄膜炎为葡萄膜组件(虹膜、睫状体和脉络膜)归因于对自身抗原的自身免疫反应，或由外部刺激继发的先天性发炎反应引起的发炎过程。其可以不同解剖形式-前、中间、后或弥漫性存在。前葡萄膜炎为疾病的最常见形式，其体现为影响虹膜的虹膜炎或影响睫状体的虹膜睫状体炎。中间葡萄膜炎或玻璃体炎涉及玻璃体腔且可涉及睫状体平坦部(pars plan)，且后葡萄膜炎划分为三种类型：脉络膜炎、视网膜脉络膜炎和脉络膜视网膜炎。脉络膜视网膜炎通常与感染性疾病，例如，弓形体病相关。弥漫性涉及或葡萄膜炎影响许多区域时，将其描述为全葡萄膜炎。
葡萄膜炎的类型可以使用国际葡萄膜炎研究小组(IUSG)分类来分类，且葡萄膜炎命名标准(SUN)组可以用来定义葡萄膜炎的发作、持续时间和病程的准则[27]。葡萄膜炎主要影响年龄20到50岁的人；尽管其可在任何年龄发生且甚至影响儿童。葡萄膜炎比率在年龄为65岁或以上的患者中也较高。
如实施例1和3中所示，已经展示nomacopan型蛋白质降低自身免疫葡萄膜炎(EAU)的小鼠模型中的临床评分和组织学评分。
此外，CD4+T细胞子集Th17细胞产生白介素(IL)-17，一种已展示参与若干形式的感染性和非感染性葡萄膜炎的促炎性细胞因子。IL-17诱导产生其它发炎性细胞因子，如IL-6、粒细胞集落刺激因子(CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF、IL-1、TGF-β和肿瘤坏死因子(TNF)-α[28]。实施例还展现nomacopan型蛋白质可降低表达IL-17的CD4+细胞的百分比。不希望受任何特定理论所束缚，这些分子可降低产生IL-17的Th17细胞水平，这使得葡萄膜中的发炎减少，从而减少葡萄膜炎的进展。因此，nomacopan型蛋白质可尤其可用于治疗或预防自身免疫葡萄膜炎或感染性葡萄膜炎。
VEGF在发炎过程中通过促进血管新生和增加血管渗透性而发挥重要作用。VEGF的表达与发炎级联中的许多主要细胞因子，包括NFκB有关。公认VEGF在视网膜新血管形成的发展中的重要性[29]。nomacopan型蛋白质可以与LTB4结合并且抑制其作用，提出这降低M2巨噬细胞的VEGF表达水平。这在实施例4和图7A中的EAU小鼠模型中展现，其展示nomacopan型蛋白质降低视网膜组织中的VEGF水平。VEGF水平的所得降低阻止新血管的产生。因此，nomacopan型蛋白质可用于治疗或预防自身免疫葡萄膜炎或感染性葡萄膜炎。
在优选实施方式中，本发明提供一种预防或治疗受试者的自身免疫葡萄膜炎的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗自身免疫葡萄膜炎的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
在某些实施方式中，本发明提供一种预防或治疗受试者的感染性葡萄膜炎的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗感染性葡萄膜炎的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
在某些实施方式中，自身免疫葡萄膜炎可为前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎或弥漫性葡萄膜炎。在优选实施方式中，本发明提供一种预防或治疗受试者的前葡萄膜炎的方法。还提供本发明的组合物，其用于预防或治疗受试者的前葡萄膜炎。
具有罹患自身免疫葡萄膜炎的风险的受试者可受益于施用本文中所提及的试剂，以便预防自身免疫葡萄膜炎。葡萄膜炎的风险因素包括吸烟。为吸烟者或曾为吸烟者的受试者在治疗或预防自身免疫葡萄膜炎方面是优选的。在一些实施方式中，受试者可具有这些风险因素中的一个或多个，但可不展示任何临床症状。
待治疗的受试者年龄可以在20到50岁之间。在一些实施方式中，受试者的年龄大于65岁。在一些实施方式中，受试者为18岁或更大。在其它实施方式中，受试者年龄小于18岁。
年龄相关性黄斑变性
年龄相关性黄斑变性(AMD)为引起中央视觉的进行性不可逆严重损失的退行性视网膜眼病。所述疾病损害黄斑，即视敏度最高的区域，并且是在60岁或更大美国人中引起失明的主要起因之一。
存在两种类型的AMD，湿性和干性AMD。湿性AMD(也称为新生血管AMD)与快速退化视觉和严重障碍相关。视觉功能在湿性AMD中严重受损，并且最终发炎和疤痕引起受影响的视网膜中视觉功能的永久性损失。湿性MD具有两个亚型，‘经典的’和‘隐匿的(occult)’。在经典亚型中，新血管可由眼科医师使用血管造影明显地看到，而在隐匿亚型中，渗漏的血管是隐蔽的。患者可呈现隐匿和经典CNV的组合[30]。
湿性AMD的特征尤其在于回应于各种刺激视神经视网膜中和下方的异常新血管形成。这种异常的血管生长使得形成通常出血的渗漏血管。异常血管生长通过VEGF活化。nomacopan型蛋白质可以结合且抑制已知活化VEGF的LTB4。因此，nomacopan型蛋白质可在治疗湿性AMD时尤其有效。
干性AMD(也被称为萎缩性AMD)占病例的约80％并且通常缓慢地发展，通常同时影响两眼。其通常仅造成轻微的视觉损失。干性AMD的特征在于视网膜后方的脂肪沉积物，其使得黄斑变薄并且变干。
AMD可以使用STARS问卷自行评估[31]。AMD可基于在55岁以上的人的中央凹的2个视盘直径内评估的眼底病变来分类。无可见玻璃疣或色素异常的受试者应被认为不具有AMD的病征。具有小玻璃疣(<63μm)，也称为小核果(drupelet)的人应该被视为具有正常老化变化而无临床上相关的晚期AMD发展的增加的风险。具有中等玻璃疣(≥63-<125μm)但无被认为与AMD有关的色素异常的人应被认为患有早期AMD。具有大玻璃疣或与至少中等玻璃疣相关的色素异常的人应被视为患有中间AMD。具有与新生血管AMD或地图状萎缩相关的病变的人应被视为患有晚期AMD[32]。
已在AMD中观察到增加的局部和全身性补体活化。多种补体基因中的多态性增加AMD的风险[33]。已知nomacopan抑制补体活化因子C5。因此，与C5结合的nomacopan型蛋白质可以有效地通过抑制补体路径的活化来治疗AMD。
LTB4受体已展示在用于湿型AMD的小鼠模型中促进激光诱导的脉络膜新血管形成，并且VEGF mRNA的表达已经在空间上和时间上与视网膜缺血的若干动物模型中的新血管形成相关[34，35]。如先前所论述，nomacopan型蛋白质可以抑制LTB4。这可引起VEGF水平的降低，这阻止新血管的产生。因此，nomacopan型蛋白质可用于治疗或预防AMD。
因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的湿性年龄相关性黄斑变性的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。在其它实施方式中，本发明提供一种用于预防或治疗湿性年龄相关性黄斑变性的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。湿性年龄相关性黄斑变性可为隐匿的、经典的或其组合。
此外，本发明提供一种预防或治疗受试者的干性年龄相关性黄斑变性的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。在其它实施方式中，本发明提供一种用于预防或治疗干性年龄相关性黄斑变性试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
在优选实施方式中，待治疗的受试者年龄为60岁或更大。
具有罹患AMD的风险的受试者可受益于施用本文中所提及的试剂，以便预防AMD。AMD的风险因素包括吸烟、阳光、人造脂肪(如部分氢化植物油)、加工、包装食品多且新鲜蔬菜少的饮食、不受控制的高血压和高胆固醇、糖尿病、高龄(年龄超过60岁的患者比更年轻患者面临更大的风险)和肥胖。
就AMD的治疗或预防而言，具有这些风险因素中的一个或多个的受试者是优选的。在一些实施方式中，受试者可具有这些风险因素中的一个或多个，但可不展示临床症状。
糖尿病性视网膜病变
糖尿病显著影响几乎每个组织中的微脉管。糖尿病性视网膜病变的特征在于微动脉瘤、硬性渗出、出血和静脉异常。高血糖症诱导微血管视网膜变化，其产生视觉模糊、暗点或闪光和突然失明[36]。
存在三种不同类型的糖尿病性视网膜病变-背景视网膜病变、糖尿病性黄斑病和增生性视网膜病变。背景视网膜病变，也称为简单视网膜病变，涉及血管壁中的微小肿胀。它们被称为疱(bleb)，其在视网膜上出现为小点，且通常伴有黄色渗出斑块(血液蛋白质)。糖尿病性黄斑病是当黄斑受到某种形式的损伤。黄斑损伤的一个所述起因是来自糖尿病性黄斑水肿，由此在黄斑附近的血管将流体或蛋白质渗漏到黄斑上。增生性视网膜病变为糖尿病性视网膜病变的晚期阶段，其中视网膜被堵塞，造成异常血管生长。这些可随后渗到眼中，造成视网膜脱离，且严重损坏视觉。如果未治疗，那么这可造成失明[36]。
VEGF是糖尿病性视网膜病变的发展中的重要因子。nomacopan型蛋白质可结合且抑制LTB4，这可以引起VEGF水平降低。因此，nomacopan型蛋白质可用于治疗或预防糖尿病性视网膜病变。
因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的糖尿病性视网膜病变的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗糖尿病性视网膜病变的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。糖尿病性视网膜病变可以是背景视网膜病变、糖尿病性黄斑病或增生性视网膜病变。
需要治疗的受试者可以患有1型或2型糖尿病。受试者罹患糖尿病的时间越长，并且如果不充分地控制血糖水平，那么罹患糖尿病性视网膜病变的概率越高。在一些实施方式中，受试者患有糖尿病至少5、10、20、30或40年。
其它风险因素包括高血压、高胆固醇、妊娠、烟草使用，和是非裔美国人、西班牙裔美国人或美洲原住民。
具有罹患糖尿病性视网膜病变的风险的受试者可受益于施用本文中所提及的试剂，以便预防糖尿病性视网膜病变。就糖尿病性视网膜病变的治疗或预防而言，具有这些风险因素中的一个或多个的受试者是优选的。在一些实施方式中，受试者可具有这些风险因素中的一个或多个，但可不显示临床症状。
视神经病变
视神经病变在视神经损伤之后出现。视神经病变的经典临床征象为视野缺损、色觉障碍和异常乳头状反应。主要症状是视觉损失，其中颜色在受影响的眼中出现微妙的褪色。在许多情况下，仅影响一只眼，且患者可能未察觉颜色视觉损失，直到医生要求他们盖住健康眼为止。
视神经病变的快速发作为视神经炎、缺血性视神经病变、发炎性(非脱髓鞘)和创伤性视神经病变的特征。在压迫性毒性/营养视神经病变中观察到症状的逐渐进展。
存在数种类型的视神经病变，包括：
(a)缺血性视神经病变，其中到视神经的血流不足。这些包括影响视神经头并且引起视神经盘的肿胀的前缺血性视神经病变，和不涉及视神经盘肿胀的后缺血性视神经病变；
(b)视神经炎，其为视神经的发炎且与覆盖视神经的髓鞘的肿胀和损坏相关。视神经炎可以分类为单一孤立性视神经炎、复发性孤立性视神经炎、慢性复发性发炎性视神经病变、视神经脊髓炎谱系障碍、多发性硬化症相关的视神经炎和分类的视神经炎形式。视神经炎还可以与青光眼相关；
(c)压迫性视神经病变，其由造成眼眶内，且较少见地，视神经管内的病变的肿瘤、感染和发炎过程引起。所述病变压迫视神经使得视神经盘肿胀且渐进视觉损失。牵涉的眼眶病症包括视神经胶质瘤、脑膜瘤、血管瘤、淋巴管瘤、皮样囊肿、癌瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、发炎眼眶假瘤和甲状腺眼病；
(d)浸润性视神经病变，其中视神经通过多种过程，包括肿瘤、发炎和感染浸润。浸润视神经的最常见发炎性病症为结节病。机会性真菌、病毒和细菌也可以浸润视神经。如果在神经的近端部分中发生浸润，那么视神经可升高。检查时神经的外观取决于受影响的神经的部分；
(e)创伤性视神经病变，其中当暴露于直接或间接损伤时视神经被损坏。摔倒也是常见的起因，并且当存在与多系统创伤和严重脑损伤相关的意识丧失时，最常发生视神经病变；
(f)线粒体视神经病变。由于视网膜神经节细胞的高能量依赖性，线粒体在维持视网膜神经节细胞的生命周期中起重要作用。线粒体DNA中的基因突变、维生素耗乏、酒精和烟草滥用和某些药物的使用可引起线粒体有效转运的紊乱，这可引起原发性或继发性视神经病变；
(g)营养视神经病变，由患者饮食中缺乏营养引起。营养缺陷影响全身，因此常在患有营养视神经病变的患者中发现臂和腿中的疼痛或感觉丧失(外周神经病变)；
(h)毒性视神经病变。其最常见的起因为甲醇中毒；
(i)遗传性视神经病变，其通常显现为对称双侧中央视觉损失。可能的遗传性视神经病变包括：莱博氏遗传性视神经病变(Leber's hereditary optic neuropathy)、显性视神经萎缩、贝氏综合症(Behr's syndrome)和伯-塔氏综合症(Berk-Tabatznik syndrome)。
因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的视神经病变病状的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗视神经病变病状的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
在一些实施方式中，视神经病变病状包括视神经损坏的任何病状。视神经病变病状可以选自：视神经炎、缺血性视神经病变、压迫性视神经病变、浸润性视神经病变、创伤性视神经病变、线粒体视神经病变、营养视神经病变、毒性视神经病变和遗传性视神经病变。在优选实施方式中，视神经病变病状为青光眼相关的视神经炎。
视网膜静脉阻塞
视网膜静脉阻塞是视网膜的血管病症。其为次于糖尿病性视网膜病变的失明第二最常见起因，且主要出现于60岁以上的患者中。存在三种类型的视网膜静脉阻塞。第一种为由四条视网膜静脉中的一条中的堵塞引起的分支视网膜静脉阻塞。第二种为由主视网膜静脉的阻塞引起的中央视网膜静脉阻塞，且第三种为分支视网膜静脉阻塞，其中阻塞出现于视网膜静脉的远端分支处。中央视网膜静脉阻塞通常导致更严重的视觉损失。根据视网膜毛细管缺血的量，视网膜静脉阻塞可以进一步细分成非缺血性和缺血性类型[37]。
视网膜静脉阻塞可以使用光学相干层析术来诊断。这涉及使用具有5微米分辨率的扫描检眼镜获取视网膜的高清图像。这些图像可以通过测量视网膜的厚度来确定肿胀和水肿的存在。检眼镜检查和荧光素血管造影还可以分别用于通过检查视网膜和视网膜血管来诊断视网膜静脉阻塞。
视网膜静脉阻塞的两个主要并发症为黄斑水肿和视网膜局部缺血，引起虹膜和视网膜新血管形成。肾静脉中出现堵塞之后，压力在毛细管中累积，引起流体和血液的出血和渗漏。随后发生新血管形成、新异常血管生长，这可导致新生血管性青光眼、玻璃体出血，并且在晚期或重度病例中导致视网膜脱离[37]。VEGF在视网膜静脉阻塞发病机理中具有主要作用，因为产生局部缺血的情况下，分泌VEGF，这引起进一步的血管渗漏和视网膜水肿[38]。
nomacopan型蛋白质可结合且抑制LTB4，这可以引起VEGF水平降低。因此，nomacopan型蛋白质可用于治疗或预防糖尿病性视网膜病变。因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的视网膜静脉阻塞的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗视网膜静脉阻塞的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。视网膜静脉阻塞可以是分支视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞或半中央视网膜静脉阻塞。
在一些实施方式中，受试者为60岁或更大、65岁或更大、70岁或更大或80岁或更大。在优选实施方式中，受试者为65岁或更大。
早产儿视网膜病
早产儿视网膜病(ROP)是儿童失明的主要起因之一，其特征在于可最终导致牵拉性视网膜脱离的视网膜新血管形成。ROP影响约20％早产婴儿。其主要出现于妊娠第32周之前出生的婴儿或出生时体重小于1500g的婴儿中。
ROP不具有外部症状，因此眼科医师每周或每两周对在妊娠第32周之前出生或体重小于1.5kg的所有早产婴儿进行筛选。ROP的程度和严重程度传统地根据ROP国际分类定义以位置(区；I到III)、严重程度(期；1到5)、程度(时钟时间；1到12)和血管扩张和纡曲(加疾病)描述[39]。
血管通常在妊娠的第16到36周之间发育，并且VEGF在胎儿的血管新生中起关键作用。在正常发育期间，VEGF回应于视网膜组织的较高需氧量释放，这引起血管的发育。然而，在早产婴儿中，VEGF水平升高，这引起异常血管增生[40]。
因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的早产儿视网膜病的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗早产儿视网膜病的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
在一些实施方式中，受试者为在27周孕龄之前出生、在27与32周孕龄之间出生或在>32周孕龄之后出生但出生体重<1501克的早产婴儿。
前增生性视网膜疾病(Pre-Proliferative retinal disease)
受试者可能患有增生性视网膜疾病、怀疑患有增生性视网膜疾病或可能具有罹患增生性视网膜疾病的风险。举例来说，受试者可以患有前增生性视网膜病变。前增生性视网膜病变指示归因于毛细管堵塞的慢性视网膜局部缺血的发生。前增生性视网膜病变的临床征象包括多个棉絮斑、静脉成珠和/或成环、多处深圆形和斑点出血和视网膜内微血管异常。
如先前所提到，增生性视网膜疾病的特征在于新血管生成，其通过VEGF活化。VEGF促进血管渗透性和血管新生，其可引起增生性视网膜疾病中血管的异常产生。nomacopan型蛋白质可结合且抑制LTB4，这可以降低VEGF水平。这例如展示于实施例4中。
因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的前增生性视网膜疾病的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗前增生性视网膜疾病的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
斯塔加特氏病
斯塔加特氏病为由编码视网膜转运蛋白的ABCA4基因中的突变引起的遗传性黄斑营养不良。其是儿童黄斑变性最普遍的形式，估计在美国发病率为大约10到12.5例/100,000个体。患有斯塔加特氏病的患者在其寿命前十年或二十年内出现严重视觉损失，这在几乎所有病例中发展到不可逆的视敏度降低[41]。
病理学可包括脉络膜新血管形成，在此情况下，进行玻璃体内抗VEGF注射[42]。本发明人已展示nomacopan型蛋白质可降低增生性视网膜疾病中的VEGF水平。
因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的斯塔加特氏病的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗斯塔加特氏病的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
息肉状脉络膜血管病变
息肉状脉络膜血管病变(PCV)为脉络膜血管结构的疾病。其存在于许多种族的男性和女性中，其特征在于色素上皮的血清血液脱落和通常可导致视网膜下纤维化的渗出性变化。证据支持患有PCV的有症状的患者可以在光动力疗法和抗VEGF治疗下完全消退而无严重视觉损失[43]。本发明人已展示nomacopan型蛋白质可降低增生性视网膜疾病中的VEGF水平。
因此，本发明提供一种预防或治疗受试者的息肉状脉络膜血管病变的方法，其包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。此外，本发明提供一种用于预防或治疗息肉状脉络膜血管病变疾病的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。在一些实施方式中，试剂与光动力疗法组合施用。
施用结果
受试者可由于治疗而具有降低的症状发生率、症状缓解、症状发生或复发的抑制或延缓或其组合。优选地，治疗引起典型疾病病状症状的减少。举例来说，将视敏度用作许多增生性视网膜疾病治疗临床研究中的终点。根据本发明的治疗可因此引起视敏度的提高。
例如使用上文关于特定疾病中的一个所提及的方法中的一个，作为治疗的结果，受试者可以展现其临床评分的改进。
此外，由于治疗，受试者可以展现减少的血管形成或减少的血管增生(例如，在眼内)。其它结果可包括视敏度的提高、视觉损失的减少、视觉恢复的增加、中央视网膜厚度的减少和/或糖尿病性视网膜病变严重程度评分的改进。此外，治疗可使得玻璃体出血、虹膜或膜角的新血管形成、新生血管青光眼和/或视网膜脱离减少。在施用活性剂之后所观察到的降低可以相对于健康个体、患有更严重形式的相关增生性视网膜疾病的个体或在用活性剂治疗之前在患者中观察到的来测量。
治疗可以引起视网膜发炎减少、Th17细胞数目减少、表达RORgt/Tbet的CD4+细胞数目减少(例如，葡萄膜炎中)。
治疗还可引起所需的第二疾病治疗的量或持续时间或治疗频率的减少。
因此，在本发明的另一实施方式中，提供一种在患有视网膜增生疾病的受试者中提高视敏度、改进临床评分、减少血管形成或血管增生(例如，在眼内)、减少视觉损失、增加视觉恢复、减少中央视网膜厚度和/或改进糖尿病性视网膜病变严重程度评分、减少玻璃体出血、减少虹膜或膜角的新血管形成、减少新生血管青光眼和/或视网膜脱离、减少发炎、减少Th17细胞的数目和/或减少表达RORgt/Tbet的CD4+细胞数目(例如，葡萄膜炎中)的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，或编码所述试剂的核酸分子。这可以是单独的或伴随第二视网膜增生性疾病治疗。
本发明还提供一种试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物、一种编码所述试剂的核酸分子，其用于在患有视网膜增生疾病的受试者中提高视敏度、改进临床评分、减少血管形成或血管增生(例如，在眼内)、减少视觉损失、增加视觉恢复、减少中央视网膜厚度和/或改进糖尿病性视网膜病变严重程度评分、减少玻璃体出血、减少虹膜或膜角的新血管形成、减少新生血管青光眼和/或视网膜脱离、减少发炎、减少Th17细胞的数目和/或减少表达RORgt/Tbet的CD4+细胞数目(例如，葡萄膜炎中)的方法。
在本发明的另一实施方式中，提供一种治疗或预防受试者的增生性视网膜疾病的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，或编码所述试剂的核酸分子，其中所述试剂引起例如视网膜组织中VEGF水平降低，和/或所述试剂引起例如视网膜组织中VEGF信号传导减少。
本发明还提供一种用于治疗或预防受试者的增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，或一种编码所述试剂的核酸分子，其中所述试剂引起例如视网膜组织中VEGF水平降低，和/或所述试剂引起例如视网膜组织中VEGF信号传导减少。
本发明的试剂可以如上文所论述与其它视网膜增生疾病治疗组合使用。本发明的试剂与另一(此处称为“第二”)视网膜增生疾病治疗的组合可以使得相比于在不存在本发明的试剂治疗的情况下使用的量，第二试剂的量减少，或相比于在不存在本发明的试剂治疗的情况下使用的治疗持续时间，第二试剂治疗的持续时间减少，或需要施用第二试剂的频率降低。鉴于某些已知治疗的副作用，这是有利的。因此，还提供一种减少第二治疗的量、减少第二治疗的施用频率或减少第二治疗的持续时间的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，并且任选地进一步包括施用所述第二治疗。
在使用第二视网膜增生疾病治疗时，优选地，其选自抗炎药品，例如类固醇，如皮质类固醇；IMT药物，例如甲氨喋呤、硫唑嘌呤和霉酚酸酯；BRM药物(例如抗TNFα剂，例如结合TNFα的抗体或其片段，如英利昔单抗或阿达木单抗)；抗VEGF治疗，如抗TNFα抗体或其片段(如贝伐单抗兰比珠单抗(乐舒晴)、抗VEGF适体(如哌加他尼(玛古真))，或另一VEGF拮抗剂，如阿柏西普(埃利亚，一种由与人IgG1免疫球蛋白的Fc部分融合的来自人VEGF受体1和2的细胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分组成的重组融合蛋白)。
当使用nomacopan型蛋白质和第二试剂时，其可在一起或分开施用。可以首先施用nomacopan型蛋白质并且可以其次施用第二视网膜增生疾病治疗，或反之亦然。
因此，例如在如上文所描述的方法中，当本发明的试剂与一种或多种其它视网膜增生疾病治疗组合使用时，这可以描述为(i)为与第二视网膜增生疾病治疗一起用于治疗或预防视网膜增生疾病的方法的包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂，或(ii)作为与包含图2中的氨基酸序列(SEQID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂一起用于治疗或预防视网膜增生疾病的方法的第二视网膜增生疾病治疗，或(iii)为用于治疗或预防视网膜增生疾病的方法的包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂和第二视网膜增生疾病治疗。在(i)到(iii)中的每一个中，所述方法包括施用为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂和施用第二视网膜增生疾病治疗。
在一些实施方式中，为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂局部施用，且第二视网膜增生疾病治疗局部施用或例如玻璃体内或脉络膜上直接施用到眼中，优选例如玻璃体内或脉络膜上直接施用到眼中。
在一些实施方式中，为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂例如玻璃体内或脉络膜上直接施用到眼中，且第二视网膜增生疾病治疗局部施用或例如玻璃体内或脉络膜上直接施用到眼中。
在一些实施方式中，第二视网膜增生疾病治疗也是包含图2中的氨基酸序列(SEQID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂。
在治疗引起第二视网膜增生性疾病治疗的量或持续时间减少的情况下，减少可为相比于不存在本发明的试剂的情况下使用的第二治疗的量高达或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％。
在治疗引起第二视网膜增生性疾病治疗的治疗频率降低的情况下，这可引起第二视网膜增生性疾病治疗施用之间的时间增加至多约1、2、3、4、5、6、7或8周。
受试者
优选的受试者、试剂、剂量等如本文所公开。
任何提及的任何减少或增加均为相比于在不存在治疗的情况下的所述受试者的疾病参数的减少或增加。优选地，可对参数进行定量，且在此情况下，增加或减少优选地统计显著。举例来说，相比于不存在治疗的情况下(例如，在所述治疗开始之前)的参数，增加或减少可以是至少3、5、10、15、20、30、40、50％或更多。
在本发明的实践中施用试剂的受试者优选为哺乳动物，优选地人类。施用试剂的受试者具有患视网膜增生疾病风险或患有视网膜增生疾病。
本发明的方法还可包括以下一个或多个额外步骤：(i)确定受试者是否具有患视网膜增生疾病的风险或患有视网膜增生疾病，(ii)确定视网膜增生疾病的严重程度，其可在施用本发明的试剂之前和/或之后进行。
用于本发明的试剂
根据本发明的一个实施方式，试剂为nomacopan自身或其功能等效物。在下文中，术语“nomacopan型蛋白质”用作“包含图2中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或其功能等效物”的简写。
nomacopan分离自毛白钝缘蜱的唾液腺。nomacopan为脂质运载蛋白家族的外围成员且为展示抑制补体活化的首个脂质运载蛋白家族成员。nomacopan通过与C5结合且防止其通过C5转化酶裂解为C5a和C5b而抑制经典、旁路和凝集素补体路径，因此抑制为活性(例如促炎性)肽的C5a的产生，和MAC的形成。nomacopan已展现在大鼠、小鼠和人血清中以大约0.02mg/ml的IC50与C5结合且防止其通过C5转化酶裂解。
因此，nomacopan型蛋白质可包含以下或由以下组成：图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)的氨基酸19到168或图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸1到168。图2中给出的蛋白质序列的前18个氨基酸形成信号序列，其对于C5结合或对于LTB4结合活性来说不是必需的并且因此可任选地省去，例如为了重组蛋白生产效率。
nomacopan的C5结合特性
已经证实，使用表面等离子体共振(SPR)测定，nomacopan蛋白质以1nM的Kd与C5结合[44]。nomacopan型肽(例如nomacopan蛋白质的功能等效物)优选地保持结合C5的能力，宜具有小于360nM，更宜小于300nM，最宜小于250nM，优选地小于200nM，更优选地小于150nM，最优选地小于100nM，甚至更优选地小于50、40、30、20或10nM，并且有利地小于5nM的Kd，其中所述Kd优选地根据[44]中描述的方法使用表面等离子体共振测定。
nomacopan抑制经典补体路径、旁路补体路径和凝集素补体路径。优选地，nomacopan型蛋白质以使C5的全局构象稳定化但不直接阻断三种活化路径的C5转化酶靶向的C5裂解位点的方式与C5结合。nomacopan与C5的结合使得C5的全局构象稳定化但不阻断转化酶裂解位点。nomacopan的功能等效物也优选地共有这些特性。
C5由C5转化酶裂解(图1)。此裂解的产物包括过敏毒素C5a和溶解复合体C5b，其促进形成C5b、C6、C7、C8和C9的复合体，也称为攻膜复合体(MAC)。C5a为高度促炎性肽，其牵涉许多病理性发炎过程，包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞趋化性、嗜中性粒细胞活化、增加毛细管渗透性和抑制嗜中性粒细胞凋亡[45]。
已开发结合和抑制C5的单克隆抗体和小分子来治疗各种疾病[46]，尤其是PNH、牛皮癣、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和移植排斥反应。然而，这些单克隆抗体中的一些不结合某些来自具有C5多态性的受试者的C5蛋白质，且因此对这些受试者无效[47]。优选地，nomacopan型蛋白质不仅结合野生型C5并且还结合来自具有使得用依库珠单抗(eculizumab)治疗无效，或降低依库珠单抗治疗的功效的C5多态性的受试者的C5，并且抑制这两种C5的裂解)。术语“C5多态性”包括已通过插入、缺失、氨基酸取代、框移、截短，其中的任一个可为单个或多个，或这些改变中的一个或多个的组合而相比于野生型C5发生改变的C5的任何形式。在人类受试者中，野生型C5认为是具有登录号NP_001726.2；GI版：38016947的C5蛋白质。C5多态性的实例包括在氨基酸位置885处的多态性，例如Arg885Cys(由c.2653C>T编码)p.Arg885His(由c.2654G>A编码)和Arg885Ser，其降低mAb依库珠单抗的有效性[47]。
试剂结合C5，包括来自具有C5多态性，例如使通过依库珠单抗治疗无效或降低用依库珠单抗治疗的功效的C5多态性的受试者的C5的能力可通过所属领域中已知的标准体外分析测定，例如通过表面等离子体共振或在凝胶上培育蛋白质与标记的C5后的蛋白质印迹法。优选地，nomacopan型蛋白质以小于360nM，更宜小于300nM，最宜小于250nM，优选地小于200nM，更优选地小于150nM，最优选地小于100nM，甚至更优选地小于50、40、30、20或10nM，并且有利地小于5nM的Kd结合野生型C5和/或来自具有C5多态性，例如使通过依库珠单抗治疗无效或降低用依库珠单抗治疗的功效的C5多态性的受试者的C5，其中所述Kd优选地根据[44]中描述的方法使用表面等离子体共振测定。
其对野生型C5与来自具有C5多态性，例如使通过依库珠单抗治疗无效或降低用依库珠单抗治疗的功效的C5多态性的受试者的C5可展示更高、更低或相同亲和力。
nomacopan型蛋白质抑制补体活化的能力还可通过测量试剂抑制血清中补体活化的能力而测定。举例来说，血清中的补体活性可通过所属领域中已知或本文所述的任何方式来测量。
nomacopan的LTB4结合特性
nomacopan型蛋白质还可定义为具有抑制类二十烷酸活性的功能。nomacopan还已展现结合LTB4。nomacopan蛋白质的功能等效物也可以保持以与nomacopan蛋白质类似的亲和力结合LTB4的能力。
nomacopan型蛋白质结合LTB4的能力可通过所属领域中已知的标准体外分析测定，例如借助于nomacopan与抗LTB4抗体间竞争与标记的LTB4结合的竞争性ELISA、通过等温滴定量热法或通过荧光滴定。使用荧光滴定获得的数据展示nomacopan以200到300pM的Kd与LTB4结合。举例来说，磷酸盐缓冲盐水(PBS)中对LTB4(美国密歇根州安娜堡(AnnArbor,MI,USA)Caymen Chemicals)的结合活性可在分光荧光计，例如LS 50 B分光荧光计(美国康涅狄格州诺瓦克(Norwalk,CT,USA)Perkin-Elmer)中定量。这可如下进行：
将nomacopan于2mL PBS中的纯化100nM溶液施加于装备有电磁搅拌器的石英比色杯(10mm路径长度；德国穆尔海姆(Mühlheim,Germany)Hellma)中。将温度调节至20℃，且在达到平衡之后，在280nm(狭缝宽度：15nm)下激发蛋白质Tyr/Trp荧光。在对应于发射最大值的340nm(狭缝宽度：16nm)下测量荧光发射。逐步添加30μM LTB4于PBS中的配体溶液，直至20μL的最大体积(总样品体积的1％)，且在30s培育之后测量稳态荧光。为计算KD值，将数据相对于100％的初始荧光强度标准化，使用3μM N-乙酰基-色氨酰胺溶液的滴定校正内滤效应且相对于对应配体浓度标绘数据。随后，基于双分子复合体形成的质量作用定律的非线性最小平方回归用于利用Origin软件版本8.5(美国马萨诸塞州北安普敦(Northampton,MA,USA)OriginLab)使用公开的公式来拟合数据(Breustedt等人,2006)[48]。
nomacopan可以小于1nM、更宜小于0.9nM、最宜小于0.8nM、优选小于0.7nM、更优选小于0.6nM、最优选小于0.5nM、甚至更优选小于0.4nM且有利地小于0.3nM的Kd结合LTB4，其中所述Kd使用荧光滴定，优选地根据上述方法测定。nomacopan型蛋白质优选地共有这些特性。
与C5和LTB4结合的分子
根据本发明的一个实施方式，nomacopan型蛋白质可以与C5和LTB4(例如与野生型C5和来自具有用依库珠单抗治疗无效，或降低的依库珠单抗治疗的功效的C5多态性的受试者的C5结合，且与LTB4结合)结合。
nomacopan型蛋白质可因此用以防止补体C5通过C5转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，并且还用以抑制LTB4活性。使用与C5和LTB4结合的试剂可以是有利的。C5和类二十烷酸路径可能都促成所观察到的增生性视网膜疾病中的病理学。因此，通过使用抑制多个涉及增生性视网膜疾病的路径的单一试剂，相比于使用仅抑制单一路径的试剂，可以实现增强的作用。存在与施用单一分子相关的另外的实践优势。
结合LTB4但不结合C5或展示与C5结合减少的分子
不结合C5或展示与C5的结合减少但确实保留LTB-4结合活性的nomacopan型蛋白质例如在WO2018/193121中公开，其全部内容以引用的方式并入本文中。所述具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的nomacopan型蛋白质可以用于本发明的所有方面。
所述具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的nomacopan型蛋白质可包含以下序列或由以下序列组成：
SEQ ID NO:22(WO2018/193121的SEQ ID NO:5)为经修饰nomacopan的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Met114变为Gln、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Asp118变为Asn、Ala119变为Gly、Gly120变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Asp且Val124变为Lys。(nomacopan变异体1)
SEQ ID NO:23(WO2018/193121的SEQ ID NO:6)为经修饰nomacopan的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Ala且Asp149变为Gly。(nomacopan变异体2)
SEQ ID NO:24(WO2018/193121的SEQ ID NO:7)为经修饰nomacopan的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu122变为Asp且Asp149变为Gly。(nomacopan变异体3)
SEQ ID NO:25(WO2018/193121的SEQ ID NO:8)为经修饰nomacopan的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Ala44变为Asn。(nomacopan变异体4)。
在一些优选实施方式中，相比于未经修饰的nomacopan多肽，展现与C5结合的能力降低的经修饰的nomacopan多肽可不展现与C5的可检测的结合。
C5结合可以例如相对于SEQ ID NO:4中的未经修饰的nomacopan多肽所展现的结合降低至少2、5、10、15、20、50、100倍或消除。
在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO:4中的未经修饰的nomacopan多肽，C5结合降低了至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
所述多肽可例如如根据[49]中所描述的方法或如WO2018193121的实施例2中所陈述通过表面等离子体共振所测定以大于1微摩尔的KD结合C5，和/或可在以0.02mg/mL的浓度存在于混合正常全血清中时将绵羊红细胞溶解抑制小于10％，其中根据或类似于[50]中所进行来进行CH50溶解分析。所述多肽结合C5的能力还可以通过测量试剂抑制血清中补体活化的能力来测定。
在某些优选实施方式中，使用变异体2。
这些分子为是nomacopan的功能变异体的分子的实例，其共有结合LTB4的能力但不结合C5或与C5的结合减少。
因而，nomacopan的功能等效物可以是nomacopan的同源物或片段，其(i)保持nomacopan结合C5并且防止C5通过C5转化酶裂解为C5a和C5b的能力，和/或(ii)保持nomacopan结合LTB4的能力。在某些实施方式中，功能等效物具有特性(i)和(ii)。在其它实施例中，功能等效物具有特性(ii)，但与C5的结合减少或不结合C5(例如nomacopan变异体1到4中的一个)。
在一些实施方式中，本发明的试剂来源于吸血性节肢动物。术语“吸血性节肢动物”包括从适合的宿主吸食血液的所有节肢动物，如昆虫、蜱、虱子、跳蚤和螨虫。优选地，试剂来源于蜱，优选地来源于毛白钝缘蜱。
同源物包括在图2中明确鉴别的nomacopan序列的旁系同源物和直系同源物，包括例如来自包括以下的其它蜱物种的nomacopan蛋白质序列：具尾扇头蜱(Rhipicephalusappendiculatus)、血红扇头蜱(R.sanguineus)、囊形扇头蜱(R.bursa)、美洲钝眼蜱(A.americanum)、卡延钝眼蜱(A.cajennense)、希伯来钝眼蜱(A.hebraeum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、具环牛蜱(B.annulatus)、消色牛蜱(B.decoloratus)、网纹革蜱(Dermacentor reticulatus)、安氏革蜱(D.andersoni)、边缘革蜱(D.marginatus)、变异革蜱(D.variabilis)、缺角血蜱(Haemaphysalis inermis)、犬血蜱(Ha.leachii)、点状血蜱(Ha.punctata)、小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、嗜驼璃眼蜱(Hy.dromedarii)、边纹璃眼蜱(Hy.marginatum marginatum)、羊硬蜱(Ixodes ricinus)、全沟硬蜱(I.persulcatus)、肩突硬蜱(I.scapularis)、六角硬蜱(I.hexagonus)、波斯锐缘蜱(Argas persicus)、鸽锐缘蜱(A.reflexus)、游走钝缘蜱(Ornithodoros erraticus)、毛白毛白钝缘蜱(O.moubata moubata)、豚钝缘蜱(O.m.porcinus)和萨维尼钝缘蜱(O.savignyi)。
术语“同源物”还意在包括来自蚊类物种，包括库蚊属(Culex)、按蚊属(Anopheles)和伊蚊属(Aedes)物种，尤其是致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)；跳蚤物种，如猫栉头蚤(Ctenocephalides felis)(猫蚤)；马蝇；白蛉；黑蝇；采采蝇；虱子；螨虫；水蛭；和扁虫的等效nomacopan蛋白质序列。天然nomacopan蛋白质被认为以约18kDa的另外三种形式存在于毛白钝缘蜱中，且术语“同源物”意在包括nomacopan的这些替代形式。
所属领域的技术人员将清楚鉴别图2中给出的nomacopan序列的同源物的方法。举例来说，同源物可通过公共和私有序列数据库的同源性搜索来鉴别。适宜地，可使用公开可用的数据库，但私有的或商用的数据库同样可用，尤其在其含有公共数据库中未示出的数据时。主数据库为一级核苷酸或氨基酸序列数据存放的站点且可为公开可用或商用的。公开可用的主数据库的实例包括GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL数据库(http://www.ebi.ac.uk/)、DDBJ数据库(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)、SWISS-PROT蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/)、PIR(http://pir.georgetown.edu/)、TrEMBL(http://www.ebi.ac.uk/)、TIGR数据库(参见http://www.tigr.org/tdb/index.html)、NRL-3D数据库(http://www.nbrfa.georgetown.edu)、蛋白质数据库(Protein Data Base)(http://www.rcsb.org/pdb)、NRDB数据库(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OWL数据库(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)，和辅助数据库PROSITE(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS(http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html)、Profiles(http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html)、Pfam(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(http://dna.stanford.edu/identify/)和Blocks(http://www.blocks.fhcrc.org)数据库。商用数据库或私有数据库的实例包括PathoGenome(Genome Therapeutics公司)和PathoSeq(先前属于Incyte Pharmaceuticals公司)。
通常，两个多肽之间(优选地在指定区域，如活性位点上)大于30％的同一性被视为指示功能等效性且因此指示两个蛋白质同源。优选地，为同源物的蛋白质与图2中鉴别的nomacopan蛋白质序列(SEQ ID NO:2)具有大于60％的序列同一性程度。更优选的同源物与图2中给出的nomacopan蛋白质序列(SEQ ID NO:2)的同一性程度分别大于70％、80％、90％、95％、98％或99％。如本文中所提及的同一性百分比使用BLAST版本2.1.3，使用由美国国家生物技术信息中心(NCBI；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62矩阵；空位开放罚分＝11且空位扩展罚分＝1]测定。同一性％可在相关参考序列(例如SEQ ID NO:2的氨基酸1-168或SEQ ID NO:2的氨基酸19-168)的全长上。
nomacopan型蛋白质因此可以参考与例如图2SEQ ID NO:2的氨基酸19到168或图2SEQ ID NO:2的氨基酸1到168的参考序列的某一氨基酸序列同一性％来描述，例如作为包含或其组成为与图2SEQ ID NO:2的氨基酸19到168或图2SEQ ID NO:2的氨基酸1到168具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列的蛋白质)，在nomacopan型蛋白质包含所述序列的情况下，nomacopan型蛋白质可以是融合蛋白(具有例如第二蛋白质，例如异源蛋白质)。下文论述适合的第二蛋白质。
在本公开的各种方面和实施方式中，经修饰的nomacopan多肽(例如nomacopan型蛋白质)可与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的未经修饰的nomacopan多肽相差1到50、2-45、3-40、4-35、5-30、6-25、7-20、8-25、9-20、10-15个氨基酸、至多1、2、3、4、5、7、8、9、10、20、30、40、50个氨基酸。这些可以是取代、插入或缺失，但优选是取代。在缺失的情况下，这些优选地为缺失至多1、2、3、4、5、7或10个氨基酸(例如N端或C端缺失)。因此，突变体包括含有氨基酸取代，例如不以不利方式影响蛋白质的功能或活性的保守氨基酸取代的蛋白质。这个术语还旨在包括天然生物变异体(例如nomacopan蛋白质来源的物种内的等位基因变异体或地理(geographical)变异体)。具有提高的结合野生型C5和/或来自具有使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗治疗的功效的C5多态性的受试者的C5和/或LTB4的能力的突变体也可以通过蛋白质序列中的特定残基的系统性或定向突变来设计。
这些修饰可以对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中所示的nomacopan多肽进行，并且分子将保持有用并且将被视为功能变异体，其前提是所得经修饰的nomacopan多肽保持与如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中所示的nomacopan多肽相当的(i)LTB4结合活性和/或(ii)C5结合，其可以例如使用本文中其它地方提及的测试来测定(例如与这些中的一个或两个的结合是与未经修饰的nomacopan多肽结合相比的至少80％、85％、90％、95％)。如本文中其它地方所论述，nomacopan和L-nomacopan都已经展示对自身免疫葡萄膜炎的小鼠模型的处理有效。L-nomacopan结合LTB4但不结合C5。nomacopan样蛋白质可以通过参考其结合C5的能力和/或其结合LTB4的能力来定义。结合LTB4的那些在本发明中特别有用。结合LTB4和C5的那些也在本发明中特别有用。
鉴于对功能变异体结合LTB4和任选地还有C5的要求，当进行修饰时，某些残基应从修饰排除。这些包括保守半胱氨酸残基。
其它残基应从修饰排除，或如果经取代，那么仅应经历保守修饰。这些是LTB4结合残基。在功能变异体结合LTB4和C5的实施方式中，则如下定义的C5结合残基也应优选地从修饰排除，或如果经取代，那么优选地应仅经历保守修饰。鉴于相对良好地理解LTB4和C5结合，有可能设计可以具有约65％与nomacopan的同一性百分比但其中改变被限制于不参与LTB4结合并且任选地还有C5结合的残基的分子。
对于LTB4结合变异体，在一些实施方式中，成熟nomacopan分子(例如如SEQ IDNO:4中所示，其对应于包含信号序列的全长蛋白质的残基19到168)的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且以下陈述的LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个保留或经历保守修饰。
对于LTB4结合变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个保留或经历保守修饰，其中下文陈述的LTB4结合残基中的至多2、3、4、5、10、15、20个经历保守修饰。
对于LTB4结合变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且以下陈述的LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个保留。
对于LTB4结合变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且以下陈述的LTB4结合残基中的每一个保留或经历保守修饰。
对于LTB4结合变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且以下陈述的LTB4结合残基中的每一个保留或经历保守修饰，其中LTB4结合残基中的至多2、3、4、5、10、15、20个经历保守修饰。
对于LTB4结合变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且以下陈述的LTB4结合残基中的每一个保留。
对于结合C5和LTB4的变异体，在一些实施方式中，成熟nomacopan分子(例如如SEQID NO:4中所示，其对应于包含信号序列的全长蛋白质的残基19到168)的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个保留或经历保守修饰，并且以下陈述的C5结合残基中的至少五个、十个或十五个或二十个或每一个保留或经历保守修饰。
对于结合C5和LTB4的变异体，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个和以下陈述的C5结合残基中的至少五个、十个或十五个或二十个或每一个保留或经历保守修饰，其中LTB4和C5结合残基中的至多2、3、4、5、10、15、20个经历保守修饰。
对于结合C5和LTB4的变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个和以下陈述的C5结合残基中的至少五个、十个或十五个或二十个或每一个保留。
对于结合C5和LTB4的变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且LTB4结合残基中的每一个和下文陈述的C5结合残基中的每一个保留或经历保守修饰。
对于结合C5和LTB4的变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且LTB4结合残基中的每一个和下文陈述的C5结合残基中的每一个保留或经历保守修饰，其中C5和/或LTB4结合残基中的至多2、3、4、5、10、15、20个经历保守修饰。
对于结合C5和LTB4的变异体，在一些实施方式中，SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，并且LTB4结合残基中的每一个和下文陈述的C5结合残基中的每一个保留。
在这些区域之外作出的修饰可为保守或非保守的。
在这些实施方式中的每一个中，优选地保持这六个半胱氨酸氨基酸残基之间的间距以保持分子的总体结构(例如分子包含六个半胱氨酸残基，其以相隔32个氨基酸、相隔62个氨基酸、相隔28个氨基酸、相隔1个氨基酸和相隔21个氨基酸的距离相对于彼此间隔开，如从根据图2中的氨基酸序列的氨基酸1到168的序列的氨基端到羧基端排列)。
LTB4结合残基
认为参与与LTB4结合且在相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4经修饰的任何分子的序列中优选地以未经修饰形式保留或仅经历保守变化的残基为Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115(编号根据SEQ ID NO:4)。
C5结合残基
认为参与与C5结合，可以在相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4经修饰的任何分子的序列中以未经修饰形式保留的残基为Val26、Val28、Arg29、Ala44、Gly45、Gly61、Thr62、Ser97、His99、His101、Met 114、Met 116、Leu117、Asp118、Ala119、Gly120、Gly121、Leu122、Glu123、Val124、Glu125、Glu127、His146、Leu147和Asp 149(编号根据SEQ ID NO:4)。这些残基在结合LTB4但已经修饰以减少与C5的结合的nomacopan变异体中进行修饰的那些残基当中。
LTB4和/或C5结合残基
存在参与LTB4和C5结合的两个组氨酸残基，His99和His101。因此，参与LTB4和/或C5结合的残基的列表是Phe18、Tyr25、Val26、Val28、Arg29、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Ala44、Gly45、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Gly61、Thr62、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、Ser97、His99、His101、Asp103、Met 114、Trp115、Met 116、Leu117、Asp118、Ala119、Gly120、Gly121、Leu122、Glu123、Val124、Glu125、Glu127、His146、Leu147和Asp 149(编号根据SEQ ID NO:4)。
结合LTB4但展示与C5结合减少或不结合C5的分子的其它实例
如上文所论述，不结合C5或展示与C5的结合减少但确实保留LTB-4结合活性的nomacopan型蛋白质例如在WO2018/193121中公开，其全部内容以引用的方式并入本文中。所述具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的nomacopan型蛋白质可以用于本发明的所有方面。
四种示例性具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的nomacopan型蛋白质在WO2018/193121中公开，确切地说，具有如SEQ ID NO:22(WO2018/193121的SEQ IDNO:5，变异体1)、SEQ ID NO:23(WO2018/193121的SEQ ID NO:6，变异体2)、SEQ ID NO:24(WO2018/193121的SEQ ID NO:7，变异体3)和SEQ ID NO:25(WO2018/193121的SEQ ID NO:8，变异体4)中所示的氨基酸序列的蛋白质。L-nomacopan如在本发明实施例中称为变异体2。
所述蛋白质为nomacopan型蛋白质，且因此被视为nomacopan的功能等效物，然而其仅共有其LTB4结合特性而与C5结合减少或不结合C5。
如WO2018/193121中所定义的所述nomacopan型蛋白质在下文被更详细地描述并且可以用于本发明中。
这些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的蛋白质可包含以下序列或由以下序列组成：
SEQ ID NO:22(WO2018/193121的SEQ ID NO:5)为经修饰nomacopan的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Met114变为Gln、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Asp118变为Asn、Ala119变为Gly、Gly120变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Asp且Val124变为Lys。(nomacopan变异体1)
SEQ ID NO:23(WO2018/193121的SEQ ID NO:6)为经修饰Coversin的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Ala且Asp149变为Gly。(nomacopan变异体2)
SEQ ID NO:24(WO2018/193121的SEQ ID NO:7)为经修饰Coversin的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu122变为Asp且Asp149变为Gly。(nomacopan变异体3)
SEQ ID NO:25(WO2018/193121的SEQ ID NO:8)为经修饰Coversin的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4被修饰以将Ala44变为Asn。(nomacopan变异体4)
SEQ ID NO:26(WO2018/193121的SEQ ID NO:9)为在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124(SEQ ID NO:2的氨基酸位置132-142)处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27(WO2018/193121的SEQ ID NO:10)为在nomacopan变异体1(SEQ IDNO:22)中SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28(WO2018/193121的SEQ ID NO:11)为在nomacopan变异体2(SEQ IDNO:23)中SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29(WO2018/193121的SEQ ID NO:12)为在nomacopan变异体3(SEQ IDNO:24)中SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的nomacopan型多肽可被描述为经修饰nomacopan多肽(例如其具有白三烯或羟基类二十烷酸结合活性并且与C5的结合减少或不存在)。对“经修饰nomacopan多肽”的提及应理解为对SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4，即具有或不具有见于SEQ ID NO:2的N端的18个氨基酸信号序列的nomacopan多肽的经修饰形式的提及。因此，其可被认为是nomacopan型蛋白质。
所述多肽可具有白三烯或羟基类二十烷酸结合活性和与C5的结合减少或不存在且可包含其中发生1到30个氨基酸取代的SEQ ID NO:4，其中
(i)在SEQ ID NO:4的位置114到124中发生以下取代(a)-(j)中的一个或多个：
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换；
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met Pro、His或Thr替换；
e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换；
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换；
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；或/和其中
(ii)SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
或其中经修饰nomacopan多肽的N端缺失至多五个氨基酸的其片段。
如本文所用，LK/E结合活性是指结合白三烯和羟基类二十烷酸，包括但不限于LTB4、B4异白三烯和其任何羟基化衍生物、HETE、HPETE和EET的能力。LTB4结合尤其受关注。
具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽可以由根据以下描述修饰的SEQ ID NO:2或4组成，或可以包含根据以下描述修饰的SEQ ID NO:2或4。
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的nomacopan多肽在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124(SEQ ID NO:2的氨基酸位置132-142)处在βH与α2之间具有环。此环具有下文所示的序列：
-Met-Trp-Met-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Val-(SEQ ID NO:26)
第一Met处于SEQ ID NO:4的位置114和SEQ ID NO:2的位置132处。
在具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，修饰SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处发生以下取代(a)-(j)中的一个或多个：
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln或Ala替换；
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln或Ala替换；
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro，优选地Ser或Ala替换；
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met Pro、His或Thr，优选地Asn替换；
e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Gly或Asn替换；
f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Ser或Asn替换；
g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Ala或Asn替换；
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His，优选地Asp或Ala替换；
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr，优选地Asp、Ala、Gln或Asn替换；
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Lys或Ala替换。
在具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处发生以下取代(a)-(j)中的一个或多个：
a.Met114被Gln替换；
b.Met116被Gln替换；
c.Leu117被Ser替换；
d.Asp118被Asn替换；
e.Ala119被Gly替换；
f.Gly120被Ser替换；
g.Gly121被Ala替换；
h.Leu122被Asp替换；
i.Glu123被Asp或Ala替换；
j.Val124被Lys替换。
在经修饰nomacopan多肽中，存在取代(a)-(j)中的两、三、四、五、六、七、八、九或十个。优选地，存在取代(a)-(j)中的两个或更多个、五个或更多个或八个或更多个。
在具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代：
a.Met114被Gln替换；
b.Met116被Gln替换；
c.Leu117被Ser替换；
d.Asp118被Asn替换；
e.Ala119被Gly替换；
f.Gly120被Ser替换；
g.Gly121被Ala替换；
h.Leu122被Asp替换；
i.Glu123被Asp替换；
j.Val124被Lys替换。
任选地，在上文提及的经修饰nomacopan多肽中，Trp115未被取代。优选的经修饰nomacopan多肽在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124处在βH与α2之间具有环，所述环具有序列Gln-Trp-Gln-Ser-Asn-Gly-Ser-Ala-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:27)。
在具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代：
a.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln替换；
b.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro，优选地Ser替换；
c.Gly121被Ala、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Ala替换；
d.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His，优选地Asp替换；
e.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr，优选地Asp替换。
在更特定实施方式中；
a.Met116被Gln替换；
b.Leu117被Ser替换；
c.Gly121被Ala替换；
d.Leu122被Asp替换；
e.Glu123被Ala替换。
任选地，在上文提及的此经修饰nomacopan多肽中，Trp 115未被取代。任选地，在此实施方式中，Met114、Trp 115、Asp118、Ala119、Gly120和Val124未被取代，或经如本文中其它地方提及的保守取代来取代。具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选经修饰nomacopan多肽在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124处在βH与α2之间具有环，所述环具有序列Met-Trp-Gln-Ser-Asp-Ala-Gly-Ala-Asp-Ala-Val(SEQ ID NO:28)。
在具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代：
a.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln替换；
b.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His，优选地Asp替换；
在更特定实施方式中；
a.Met116被Gln替换；
b.Leu122被Asp替换。
任选地，在上文提及的此经修饰nomacopan多肽中，Trp 115未被取代。任选地，在此实施方式中，Met114、Trp 115、Leu117、Asp118、Ala119、Gly120、Gly121、Glu123和Val124未被取代。具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选经修饰nomacopan多肽在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124处在βH与α2之间具有环，所述环具有序列Met-Trp-Gln-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Asp-Glu-Val(SEQ ID NO:29)。
在具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰nomacopan多肽以使得SEQ ID NO:4中的Ala44(SEQ ID NO:2中的Ala62)被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换。
在优选实施方式中，SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。
SEQ ID NO:4的位置44(或SEQ ID NO:2的位置62)处的此取代可与本文中提及的任何其它取代组合进行。
在另一具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代(a)-(j)中的一个或多个：
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln或Ala，例如Gln替换；
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln或Ala，例如Gln替换；
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro，优选地Ser或Ala，例如Ser替换；
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met Pro、His或Thr，优选地Asn替换；
e.Ala119被Gly、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Gly或Asn，例如Gly替换；
f.Gly120被Ser、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Ser或Asn，例如Ser替换；
g.Gly121被Ala、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Ala或Asn，例如Ala替换；
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His，优选地Asp或Ala，例如Asp替换；
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr，优选地Asp、Ala、Gln或Asn，例如Asp或Ala替换；
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Lys或Ala，例如Lys替换；
且另外，SEQ ID NO:4中的Ala44(SEQ ID NO:2中的Ala62)被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Asn替换。
在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代：
a.Met116被Gln替换；
b.Leu117被Ser替换；
c.Gly121被Ala替换；
d.Leu122被Asp替换；
e.Glu123被Ala替换；
且SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。
在此实施方式的优选方面，对应于SEQ ID NO:4的位置114到124的氨基酸残基如SEQ ID NO:28中所示。
在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，修饰nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代：
a.Met116被Gln替换；
b.Leu122被Asp替换；
且SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换
在此实施方式的优选方面，对应于SEQ ID NO:4的位置114到124的氨基酸残基如SEQ ID NO:29中所示。
在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰Coversin多肽以使得SEQ ID NO:4中的Asp149被Gly、Gln、Asn、Ala、Met、Arg、Lys、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换。在一些实施方式中，nomacopan多肽经修饰，使得SEQ ID NO:4的Asp149被Gly替换。SEQ ID NO:4的位置149(SEQ ID NO:2的位置167)处的此取代可与本文中提及的任何其它取代组合进行。
在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代：
a.Met116被Gln替换；
b.Leu117被Ser替换；
c.Gly121被Ala替换；
d.Leu122被Asp替换；
e.Glu123被Ala替换；
SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换且SEQ ID NO:4的Asp149被Gly149替换。
在此实施方式的优选方面，对应于SEQ ID NO:4的位置114到124的氨基酸残基如SEQ ID NO:28中所示。
在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，可修饰nomacopan多肽以使得在SEQ ID NO:4的位置114到124处存在以下取代：
a.Met116被Gln替换；
b.Leu122被Asp替换；
SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换且SEQ ID NO:4的Asp149被Gly149替换。
在此实施方式的优选方面，对应于SEQ ID NO:4的位置114到124的氨基酸残基如SEQ ID NO:29中所示。
在本公开的各种方面和实施方式中，具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的未经修饰的nomacopan多肽相差1到30个氨基酸。可以对SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的nomacopan多肽进行任何修饰，其前提是与未经修饰的nomacopan多肽相比，所得经修饰nomacopan多肽展现LK/E结合活性和与C5的结合减少或不存在。
在一些实施方式中，在本发明的经修饰nomacopan多肽中SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸保留。
在一些经修饰nomacopan多肽中，SEQ ID NO:4中的Asn60和Asn84各自被Gln替换。此修饰可通过定点突变诱发进行以在多肽表达于酵母中时防止N-连接型高糖基化。
在一些经修饰nomacopan多肽中，SEQ ID NO:4中的以下氨基酸中的一个或多个被认为参与结合LTB4并且因此可以未经修饰的形式保留：Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115。在一些经修饰nomacopan多肽中，这些氨基酸中的至少五个、十个或十五个或全部以未经修饰的形式保留在本发明的经修饰nomacopan多肽中。在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，这些氨基酸中的一个或多个可以被保守取代。在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，这些氨基酸中的至多五个、十个或十五个或全部在本发明的经修饰nomacopan多肽中被保守取代。
SEQ ID NO:4中的以下位置处的氨基酸在nomacopan与TSGP2和TSGP3之间高度保守：5、6、11、13-15、20-21、24-27、29-32、35-41、45、47-48、50、52-60、64、66、69-81、83、84、86、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150。
SEQ ID NO:4中的以下位置处的氨基酸被认为参与结合LTB4和/或在nomacopan与TSGP2和TSGP3之间高度保守：5、6、11、13-15、18、20-21、24-27、29-32、35-41、43、45、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150。
SEQ ID NO:4中的以下位置处的氨基酸被认为参与结合LTB4和/或在nomacopan与TSGP2和TSGP3之间高度保守：5、6、11、13-15、18、20-21、24-25、27、30-32、35-41、43、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、98、100、102-104、112-113、115、126、128-129、132-139、145、148和150。
在一些具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽中，因此以上氨基酸以未经修饰形式保留。在一些实施方式中，这些氨基酸中的至少五个、十个或十五个或全部以未经修饰形式保留在本发明的经修饰nomacopan多肽中。在一些实施方式中，这些氨基酸中的一个或多个可经保守取代。在一些实施方式中，这些氨基酸中的至多五、十或十五、二十、二十五、30、40、50个或全部在本发明的经修饰nomacopan多肽中经保守取代。
本文中提及的经修饰nomacopan多肽通常与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相差1到30，优选地2到25，更优选地3到20，甚至更优选地4到15个氨基酸。通常，差异将为5到12，或6到10个氨基酸变化。举例来说，可以在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中进行1到30或2到25、3到30、4到15、5到12或6到10个氨基酸取代。
在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124(SEQ ID NO:2的氨基酸位置132-142)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:27中所示的环的经修饰nomacopan多肽由于此环存在而与SEQ ID NO:4相比具有10个氨基酸取代。在一些实施方式中，因此除在SEQ ID NO:22中(例如在SEQ ID NO:27的环中)所示的那些以外，相比于SEQ ID NO:4，本文中所提及的经修饰nomacopan多肽优选地具有1到15、2到10、3到5或至多2、3、4或5个额外取代。
在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124(SEQ ID NO:2的氨基酸位置132-142)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:28中所示的环的经修饰nomacopan多肽由于此环存在而与SEQ ID NO:4相比具有5个氨基酸取代。在一些实施方式中，因此除在SEQ ID NO:23中(例如在SEQ ID NO:28的环中)所示的那些以外，相比于SEQ ID NO:4，本文中所提及的经修饰nomacopan多肽优选地具有1-20、2-15、3-10或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10个额外取代。额外取代优选地包括如本文中其它地方陈述的位置44和149处的取代。
在SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124(SEQ ID NO:2的氨基酸位置132-142)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:29中所示的环的经修饰nomacopan多肽由于此环存在而与SEQ ID NO:4相比具有2个氨基酸取代。在一些实施方式中，因此除在SEQ ID NO:24中所示的那些(例如在SEQ ID NO:29的环中的取代)以外，相比于SEQ ID NO:4，经修饰nomacopan多肽优选地具有1到25、2到12、3到15或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个额外取代。额外取代优选地包括如本文中其它地方陈述的位置44和149处的取代。
如本文中其它地方所陈述在SEQ ID NO:4的位置44处具有取代的经修饰nomacopan多肽与SEQ ID NO:4相比，优选地具有1到25、2到12、3到15或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个额外取代。
除了上文明确提及的取代以外的取代优选为保守取代，例如根据下表。第二列中的相同框和优选第三列中的相同行中的氨基酸可以彼此取代：
Figure BDA0003430629220000411
优选的具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽可包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22、23、24、25中的一个中所示的氨基酸序列。
具有降低的或无C5结合活性但保留LTB-4结合能力的经修饰nomacopan多肽的实例包括
1.一种经修饰nomacopan多肽，其具有白三烯或羟基类二十烷酸结合活性和与C5的结合减少或不存在，所述经修饰nomacopan多肽包含其中发生1到30个氨基酸取代的SEQID NO:4，其中
(i)在SEQ ID NO:4的位置114到124中发生以下取代(a)-(j)中的一个或多个：
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换；
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met Pro、His或Thr替换；
e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换；
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换；
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；或/和其中
(ii)SEQ ID NO:3中的Ala44被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
或其中经修饰nomacopan多肽的N端缺失至多五个氨基酸的其片段。
2.根据条目1的经修饰nomacopan多肽，其中
(i)在SEQ ID NO:4的位置114到124中发生以下取代(a)-(j)中的一个或多个：
a.Met114被Gln替换；
b.Met116被Gln替换；
c.Leu117被Ser替换；
d.Asp118被Asn替换；
e.Ala119被Gly替换；
f.Gly120被Ser替换；
g.Gly121被Ala替换；
h.Leu122被Asp替换；
i.Glu123被Asp或Ala替换；
j.Val124被Lys替换；或/和其中
(ii)SEQ ID NO:3中的Ala44被Asn44替换；
或其中经修饰nomacopan多肽的N端缺失至多五个氨基酸的其片段。
3.根据条目1或条目2的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中在SEQ ID NO:4的位置114到124中，存在取代(a)-(j)中的一个或多个。
4.根据条目3的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中存在取代(a)-(j)中的两个或更多个。
5.根据条目4的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中存在取代(a)-(j)中的五个或更多个。
6.根据条目5的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中存在取代(a)-(j)中的每一个，任选地其中Trp 115未被取代。
7.根据条目5的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中存在如条目2中所定义的取代(a)-(j)中的每一个，任选地其中Trp 115未被取代。
8.根据条目7的经修饰多肽或其片段，其中Glu123被Asp替换。
9.根据条目1到8中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其具有如SEQ IDNO:27中所示的SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124之间的环序列，并且除在SEQ ID NO:22中所示的那些以外，其与SEQ ID NO:4相比具有1到15个额外取代。
10.根据条目9的经修饰nomacopan多肽或其片段，其除在SEQ ID NO:22中所示的那些以外，与SEQ ID NO:27相比具有2-10个额外取代。
11.根据条目9或10的经修饰nomacopan多肽或其片段，其除在SEQ ID NO:22中所示的那些以外，与SEQ ID NO:27相比具有3-5个额外取代。
12.根据条目1到8中任一项的经修饰nomacopan多肽，其由SEQ ID NO:22组成或包含SEQ ID NO:22。
13.根据条目1到5中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中：
a.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln替换；
b.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro，优选地Ser替换；
c.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Ala替换；
d.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His，优选地Asp替换；和
e.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr，优选地Ala或Asp替换。
14.根据条目13的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中SEQ ID NO:4的位置114到124中：
a.Met116被Gln替换；
b.Leu117被Ser替换；
c.Gly121被Ala替换；
d.Leu122被Asp替换；和
e.Glu123被Ala替换。
15.根据条目13或条目14的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中Trp 115未被取代。
16.根据条目13、14或15的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中Met114、Trp 115、Asp118、Ala119、Gly120和Val124未被取代。
17.根据条目1到5或13到16中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其具有如SEQ ID NO:28中所示的SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124之间的环序列，并且除在SEQID NO:23中所示的那些以外，其与SEQ ID NO:4相比具有1到20个额外取代。
18.根据条目17的经修饰nomacopan多肽或其片段，其除在SEQ ID NO:23中所示的那些以外，与SEQ ID NO:4相比具有2-15个额外取代。
19.根据条目17或18的经修饰nomacopan多肽或其片段，其除在SEQ ID NO:23中所示的那些以外，与SEQ ID NO:4相比具有3-10个额外取代。
20.根据条目1到5或13到16中任一项的经修饰nomacopan多肽，其由SEQ ID NO:23组成或包含SEQ ID NO:23。
21.根据条目1到4中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中：
a.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln替换；
b.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His，优选地Asp替换。
22.根据条目21的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中
a.Met116被Gln替换；和
b.Leu122被Asp替换。
23.根据条目21或条目22的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中Trp 115未被取代。
24.根据条目21、22或23的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中Met114、Trp 115、Leu117、Asp118、Ala119、Gly120、Gly121、Glu123和Val124未被取代。
25.根据条目1到4或21到24中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其具有如SEQ ID NO:29中所示的SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124之间的环序列，并且除在SEQID NO:24中所示的那些以外，其与SEQ ID NO:4相比具有1到25个额外取代。
26.根据条目25的经修饰nomacopan多肽或其片段，其除在SEQ ID NO:24中所示的那些以外，与SEQ ID NO:4相比具有2-12个额外取代。
27.根据条目25或26的经修饰nomacopan多肽或其片段，其除在SEQ ID NO:24中所示的那些以外，与SEQ ID NO:4相比具有3-15个额外取代。
28.根据条目1到4或21到24中任一项的经修饰nomacopan多肽，其由SEQ ID NO:24组成或包含SEQ ID NO:24。
29.根据条目1到11或13到28中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中SEQID NO:4中的Ala44被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换。
30.根据条目29的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。
31.根据条目1到11或13到30中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中SEQID NO:4中的Asp149被Gly、Gln、Asn、Ala、Met、Arg、Lys、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换。
32.根据条目30或31的经修饰nomacopan多肽，其中SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换且SEQ ID NO:4中的Asp149被Gly替换。
33.根据前述条目中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸以未经修饰形式保留。
34.根据条目1到11、13到19或21到27中任一项的经修饰nomacopan多肽，其中Asn60和Asn84各自被Gln替换。
35.根据前述条目中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中以下氨基酸中的一个或多个未被取代：Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115。
36.根据条目35的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中所有以下氨基酸未被取代：Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115。
37.根据条目1到36中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其中：
a.SEQ ID NO:4中的氨基酸5、6、11、13-15、20-21、24-27、29-32、35-41、45、47-48、50、52-60、64、66、69-81、83、84、86、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150都未被取代；或
b.SEQ ID NO:4中的氨基酸5、6、11、13-15、18、20-21、24-27、29-32、35-41、43、45、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150都未被取代；或
c.SEQ ID NO:4中的氨基酸5、6、11、13-15、18、20-21、24-25、27、30-32、35-41、43、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、98、100、102-104、112-113、115、126、128-129、132-139、145、148和150都未被取代。
38.根据条目1或条目2的经修饰nomacopan多肽，其包含序列SEQ ID NO:25或由序列SEQ ID NO:25组成。
39.根据前述条目中任一项的经修饰nomacopan多肽或其片段，其与LTB4结合。
片段
nomacopan的功能等效物包括nomacopan蛋白质的片段，其前提是所述片段保持以下能力：(i)结合LTB4和/或(ii)C5(例如野生型C5和/或来自具有使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗治疗的功效的C5多态性的受试者的C5)。优选地，功能片段具有特性(i)和(ii)。在其它优选实施方式中，功能片段具有特性(i)但与C5的结合减少或不存在。
片段可以包括例如小于150个氨基酸、小于145个氨基酸的来源于nomacopan蛋白质序列(或同源物)的多肽，其前提是这些片段保持结合LTB4和任选地还有C5的能力。
片段可以包括例如至少150个氨基酸、至少145个氨基酸的来源于nomacopan蛋白质序列(或同源物)的多肽，其前提是这些片段保持结合LTB4和任选地还有C5的能力。
任何功能等效物或其片段优选地保留在nomacopan中发现的半胱氨酸残基的模式。举例来说，所述功能等效物包含六个半胱氨酸残基，其以相隔32个氨基酸、相隔62个氨基酸、相隔28个氨基酸、相隔1个氨基酸和相隔21个氨基酸的距离相对于彼此间隔开，如从根据图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸1到168的序列的氨基端到羧基端排列。nomacopan蛋白质的示例性片段公开于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14中。编码对应片段的DNA公开于SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13中。
作为所述片段包括的不仅是在本文中明确鉴别于图2中的毛白钝缘蜱nomacopan蛋白质的片段，并且还是此蛋白质的同源物(例如变异体)的片段，如上文所述。同源物的所述片段将通常与图2中的nomacopan蛋白质序列的片段具有大于60％的同一性，但同源物的更优选片段将分别与图2中的nomacopan蛋白质序列的片段呈现大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性程度。优选地，所述片段将保持上文提及的半胱氨酸间距。当然，可以通过使野生型序列系统突变或片段化随后进行适当的活性分析来合理地设计具有改良特性的片段。片段可对于LTB4展现与nomacopan类似或更大的亲和力，并且任选地对于C5展现与nomacopan类似或更大的亲和力。这些片段可具有上文针对nomacopan蛋白质的片段所描述的大小。
如上文所论述，nomacopan型蛋白质优选地结合LTB4和任选地还有C5。
保守取代
任何取代优选地为保守取代，例如根据下表。第二列中的相同框和优选第三列中的相同行中的氨基酸可以彼此取代：
Figure BDA0003430629220000481
融合蛋白
根据本发明使用的功能等效物可以是融合蛋白，其例如通过克隆在异源蛋白序列的编码序列框内的编码nomacopan蛋白质或功能等效物的多核苷酸而获得。
当用于本文中时，术语“异源”意图指示除nomacopan蛋白质或其功能等效物以外的任何多肽。可在N端或C端包含于可溶融合蛋白中的异源序列的实例为以下：膜结合蛋白的细胞外结构域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、PAS或XTEN或类似的非结构化多肽、多聚化结构域、细胞外蛋白结构域、信号序列、输出序列或允许通过亲和色谱法纯化的序列。这些异源序列中的许多以表达质粒市售，因为这些序列通常包含于融合蛋白中以在不显著损害与其融合的蛋白质的特定生物活性的情况下提供额外特性[51]。所述额外特性的实例为体液中持续时间更长的半衰期(例如由于添加Fc区或PAS化[52])，细胞外定位，或更容易的纯化程序，如由例如组氨酸、GST、FLAG、抗生物素蛋白或HA标签的标签所允许。融合蛋白可另外含有连接序列(例如长度为1-50个氨基酸，使得组件被此连接序列分隔开。
融合蛋白因此为包含nomacopan样蛋白质的蛋白质的实例，且作为特定实例包括包含PAS序列和nomacopan型蛋白质序列的蛋白质。PAS序列描述于例如[52]和EP2173890中，且PAS化nomacopan分子描述于Kuhn等人[53]中。
Figure BDA0003430629220000491
描述蛋白质与由氨基酸Pro、Ala和/或Ser构成的构象无序多肽序列的基因融合。这是由XL Protein(http://xl-protein.com/)开发的技术且提供将具有大流体动力学体积的溶剂化无规链与其所融合的蛋白质连接的简单方式。多肽序列呈现无规卷曲结构。因此，所得融合蛋白的表观分子量比融合蛋白的实际分子量大得多。这极大地降低了在生物系统中通过肾过滤的清除率。适当PAS序列描述于EP2173890以及[52]中。融合蛋白中可以使用任何适合的PAS序列。实例包括由形成无规卷曲构象的至少约100个氨基酸残基组成并且由以下组成或基本上由以下组成的氨基酸序列：丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基(或由以下组成或基本上由以下组成：脯氨酸和丙氨酸残基)。这可以包含多个氨基酸重复序列，其中所述重复序列由以下组成或基本上由以下组成：Ala、Ser和Pro残基(或脯氨酸和丙氨酸残基)，并且其中不超过6个连续氨基酸残基相同。脯氨酸残基可占序列的氨基酸的大于4％且小于40％。序列可包含选自以下的氨基酸序列：
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:15)；
AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:16)；
APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:17)，
SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:18)，
SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:19)，
AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:20)和
ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:21)
或这些序列整体或这些序列的部分的环状排列形式或多聚体。举例来说，PAS序列中可存在5到40、10到30、15到25、18到20，优选地20到30或30个重复序列中的一个，即SEQID NO 15到21中的一个，优选SEQ ID NO:15的拷贝。优选地，PAS序列包含以下或由以下组成：30个SEQ ID NO:15的拷贝。优选地，PAS序列与nomacopan型蛋白质的N端融合(直接或通过连接序列)。
在某些优选实施方式中，nomacopan型蛋白质可包含以下或由以下组成：SEQ IDNO:2的氨基酸19到168(例如融合蛋白包含(a)由30个SEQ ID NO:15的拷贝组成的PAS序列和(b)SEQ ID NO:2的氨基酸19到168，其中(a)直接或通过连接序列与(b)的N端融合)。示例性序列提供于图2D和SEQ ID NO:30中。
在另一优选实施方式中，nomacopan型蛋白质可包含以下或由以下组成：SEQ IDNO:22、23、24或25(例如融合蛋白包含(a)由30个SEQ ID NO:15的拷贝组成的PAS序列和(b)SEQ ID NO:22、23、24或25，其中(a)直接或通过连接序列与(b)的N端融合)。优选的形式将含有SEQ ID NO:22。示例性序列提供于图2E和SEQ ID NO:31中。
融合蛋白可以另外含有连接序列(例如长度为1到50、2到30、3到20、5到10、2到4、3到5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸)，使得组件被此连接序列分隔开。在一个实施方式中，连接序列可为单一丙氨酸残基。
在本发明中“PAS-nomacopan”意图指例如如上文所描述PAS化的nomacopan的功能等效物，且PAS-L-nomacopan意图指结合LTB4而非C5且PAS化的nomacopan的功能等效物。实例中所测试的PAS-nomacopan分子的序列在图2D和SEQ ID NO:30中所示。实例中所测试的PAS-L-nomacopan分子的序列在图2E和SEQ ID NO:31中所示。PAS-nomacopan和PAS-L-nomacopan具有以下优势：其各自具有更长的半衰期，从而允许施用频率较低，这对于患者来说更方便。因此PAS-nomacopan组合了nomacopan的优势，因为其抑制C5和LTB4依赖性路径，但又可以比nomacopan施用频率更低，因此提供施用优势。因此PAS-L-nomacopan组合了L-nomacopan的优势，因为其抑制LTB4依赖性路径而不抑制C5依赖性路径，但又可以比L-nomacopan施用频率更低，因此提供施用优势。
试剂的制备
蛋白质和其功能等效物可通过宿主细胞中的表达以重组形式制备。所述表达方法为所属领域的技术人员众所周知的，且通过[54]和[55]详细描述。nomacopan蛋白质和其功能等效物的重组形式优选地是未糖基化的。优选地，宿主细胞为大肠杆菌。
nomacopan蛋白质和其功能等效物优选地呈分离形式，例如与宿主细胞的至少一种组分和/或表达其的细胞生长培养基分离。在一些实施方式中，如例如通过电泳或色谱所测定，将nomacopan蛋白质或其功能等效物纯化到至少90％、95％或99％纯度。本发明的蛋白质和片段也可使用蛋白质化学的常规技术制备。举例来说，蛋白质片段可以通过化学合成来制备。产生融合蛋白的方法在所属领域中为标准的且将为熟练读者所已知。举例来说，大多数通用分子生物学、微生物学重组DNA技术和免疫学技术可见于[54]或[56]。
作为核酸分子的试剂
根据本发明的另一实施方式，试剂可以是编码nomacopan型蛋白质的核酸分子。举例来说，可以采用基因疗法来实现体内或离体的受试者中的相关细胞内源性产生nomacopan型蛋白质。另一种方法为施用“裸DNA”，其中将治疗性基因直接注射到血流中或注射到肌肉组织中。
优选地，所述核酸分子包含以下或由以下组成：图2中的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的碱基55到507。此核苷酸序列在无信号序列的情况下编码图2中的nomacopan蛋白质。图2中的核苷酸序列的前54个碱基编码信号序列，其对于补体抑制活性或LTB4结合活性来说不是必需的。或者，核酸分子可包含以下或由以下组成：图2中的核酸序列的碱基1到507，其编码具有信号序列的蛋白质。
施用模式
nomacopan型蛋白质可直接施用到眼或全身性施用。其优选地例如局部(例如以滴剂或软膏形式)或通过直接引入到眼中(例如在如巩膜所界定的眼的边界内直接施用)直接施用到眼表面上。在眼的边界内直接施用的实例包括玻璃体内施用和脉络膜上施用。玻璃体内施用(例如玻璃体内注射)为所属领域中众所周知的。还可以进行脉络膜上施用。
局部施用
本发明人已观察到，向眼局部施用nomacopan型蛋白质会影响实验UAE，这是出人意料的，因为先前不认为所述蛋白质可穿过角膜。如实施例1中所示，在所使用的UAE小鼠模型中，L-nomacopan、nomacopan和PAS-nomacopan全部在一定程度上临床评分减小。这符合这些分子能够穿过角膜并且在眼内发挥其作用。
nomacopan型蛋白质局部治疗对视网膜增生疾病，即其中病理作用在眼内的疾病具有功效的事实意味着nomacopan型蛋白质中的任一种可以在某些实施方式中单独用于治疗视网膜增生疾病。在本发明的某些实施方式中，nomacopan型蛋白质局部施用，例如每日施用，或每日施用2-5次、3-4次。
直接施用到眼中
可有利的是将本发明的试剂直接引入到眼中，例如在如巩膜所界定的眼的边界内直接施用。在某些实施方式中，本发明的试剂玻璃体内引入。在其它实施方式中，本发明的试剂脉络膜上引入。
在某些实施方式中，本发明的试剂玻璃体内引入。玻璃体内施用是所属领域中众所周知的。在本发明的某些实施方式中，玻璃体内施用约每4到6、4到8、4到10周进行一次。
在其它实施方式中，本发明的试剂脉络膜上引入。脉络膜上空间(SCS)为跨越眼后段圆周的巩膜与脉络膜之间的潜在空间。向SCS中引入试剂以高生物可用性靶向脉络膜、视网膜色素上皮和视网膜，同时维持眼中其它地方的低水平。实际上，III期临床试验在研究SCS药物递送的安全性和功效。试剂可以例如用皮下注射针、微针、微血管支架向SCS施用[57]。在本发明的某些实施方式中，脉络膜上施用约每4到6、4到8、4到10周进行一次。
局部施用结合直接施用到眼中
如本文中其它地方所论述，nomacopan型蛋白质也可以与第二试剂组合使用。在某些实施方式中，将第二试剂直接引入到眼中。其优点为其可降低需要直接将所述第二试剂施用到眼中的频率。直接施用到眼中，尽管通常是安全的，但具有某些并发情况(例如感染、进入眼的主要动脉堵塞、视网膜脱离、眼中出血和眼中晶状体损伤)的风险。此外，这还是一种需要患者去医院的医疗程序。对于治疗视网膜增生疾病，所述施用可以例如每1到2个月进行一次。因此，降低进行这些施用的频率将是有利的。
因此，在某些实施方式中，治疗或预防受试者的视网膜增生疾病的方法包括(i)局部施用如本文所定义的nomacopan型蛋白质和(ii)将第二视网膜增生治疗直接施用到所述受试者的眼中。第二视网膜增生治疗可以如本文中其它地方所定义，或其自身可以是nomacopan型蛋白质(例如其可以是与局部施用的nomacopan型蛋白质相同的nomacopan型蛋白质，或其可以是第二nomacopan型蛋白质)。
第二视网膜增生治疗的实例包括抗VEGF剂(例如抗VEGF-A抗体或其片段，如贝伐单抗(阿瓦斯汀)、兰比珠单抗(乐舒晴)、抗VEGF适体(如哌加他尼(玛古真))，或另一VEGF拮抗剂，如阿柏西普(埃利亚，一种由与人IgG1免疫球蛋白的Fc部分融合的来自人VEGF受体1和2的细胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分组成的重组融合蛋白)、类固醇(例如皮质类固醇)、免疫调节疗法(IMT)药物(例如甲氨喋呤、硫唑嘌呤或霉酚酸酯)、生物反应调节(BRM)药物(抗TNFα剂，例如结合TNFα的抗体或其片段，如英利昔单抗或阿达木单抗)。优选地，所述第二试剂为抗VEGF剂。
在其中局部施用nomacopan型蛋白质且将第二nomacopan型蛋白质直接施用到眼中的实施方式中，局部施用的试剂不必为长效蛋白质(例如，含有经设计以减少清除时间的序列的融合蛋白)。因此，其可以例如是为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂，其中蛋白质的长度为至多150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160个氨基酸(优选地至多150个氨基酸)。举例来说，其可以是为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或其功能等效物的试剂，其中如果所述蛋白质为功能等效物，那么其不是融合蛋白(例如其可是为所述蛋白质的同源物、所述蛋白质的片段或同源物的片段的功能等效物，其中同源物如本文中其它地方所定义)。在这些实施方式中，直接施用到眼中的试剂可以是为如本文中其它地方所定义的融合蛋白的功能等效物。举例来说，局部施用的试剂可以是由图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168、SEQ ID NO:22、23、24、25，优选SEQ ID NO:2的氨基酸19到168或SEQ ID NO:22组成的蛋白质，和/或直接施用到眼中的试剂为融合蛋白，其包含(i)图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168、SEQ ID NO:22、23、24、25，优选SEQID NO:2的氨基酸19到168或SEQ ID NO:22，和(ii)如本文所定义的PAS序列，例如由30个SEQ ID NO:15的拷贝组成的序列。
在其它实施方式中，局部施用一种为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的试剂，且将第二视网膜增生性疾病治疗直接施用到眼中。第二视网膜增生性疾病治疗可以例如是抗VEGF剂(例如抗VEGF-A抗体或其片段，如贝伐单抗(阿瓦斯汀)、兰比珠单抗(乐舒晴)、抗VEGF适体(如哌加他尼(玛古真))，或另一VEGF拮抗剂，如阿柏西普(埃利亚，一种由与人IgG1免疫球蛋白的Fc部分融合的来自人VEGF受体1和2的细胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分组成的重组融合蛋白)、类固醇(例如皮质类固醇)、免疫调节疗法(IMT)药物(例如甲氨喋呤、硫唑嘌呤或霉酚酸酯)、生物反应调节(BRM)药物(抗TNFα剂，例如结合TNFα的抗体或其片段，如英利昔单抗或阿达木单抗)。优选地，所述第二试剂为抗VEGF剂。优选地，局部施用的试剂为由图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168、SEQ ID NO:22、23、24、25，优选SEQ IDNO:2的氨基酸19到168或SEQ ID NO:22组成的蛋白质。
全身性施用
在其它实施方式中，nomacopan型蛋白质或试剂全身性地施用，例如皮下施用。
治疗或预防有效量
试剂以治疗或预防有效量施用。术语“治疗有效量”是指治疗相关病状，例如视网膜增生性疾病所需的试剂的量。在此上下文中，“治疗”包括减轻病症的严重程度。
本文所用的术语“预防有效量”是指预防相关病状，例如视网膜增生性疾病所需的试剂的量。在此上下文中，“预防”包括减轻病症的严重程度，例如在开始施用试剂之前未检测到存在病症的情况下。减轻病症的严重程度可例如改善视敏度。
减轻或改善是相对于在不施用如本文所述的试剂的情况下的结果。根据用于评估所述患者的标准准则来评估结果。就此可定量来说，相对准则中存在至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的减轻或改善。
对于全身性施用，以nomacopan分子为基础计算的剂量为0.1mg/kg/天到10mg/kg/天(药物质量相较于患者质量)，例如0.2到5、0.25到2或0.1到1mg/kg/天。因为融合蛋白(例如如本文中所论述)大于nomacopan分子，所以可对所述蛋白质使用相当摩尔量。因此，对于nomacopan的功能等效物，可以使用上述剂量的相当摩尔量。举例来说，对于包含nomacopan和约600个氨基酸的PAS部分或如本文所定义的PAS部分的融合蛋白，例如PAS-nomacopan)，0.1mg/kg/天的相当摩尔量为0.4mg/kg/天，因此剂量可以是0.4mg/kg/天到40mg/kg/天(药物质量相较于患者质量)，例如0.8-20、1-8或0.4-4mg/kg/天。或者，并且考虑这些融合蛋白的较长半衰期，每剂量可以给定较大量，且剂量施用频率较低，例如一周内，例如每周一次或两次施用40mg-2g、50mg-1.5g、75mg-1g。
治疗或预防有效量可另外关于抑制末端补体而定义，例如意味着相比于在不存在治疗的情况下的末端补体活性(TCA)，末端补体活性减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的量。可调节剂量和频率以将末端补体活性维持于所期望水平，其可例如为相比于在不存在治疗的情况下的末端补体活性的10％或更小，例如9、8、7、6、5、4、3、2、1％或更小。
治疗或预防有效量可另外关于降低血浆中LTB4水平而定义，例如意味着相比于在不存在治疗的情况下血浆中的LTB4水平，血浆中的LTB4水平降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％，或使LTB4水平在正常水平的某一范围内(例如正常水平的90％到110％、正常水平的85％到115％)的量。可调节剂量和频率以将血浆中LTB4水平维持于所期望水平，其可例如为相比于在不存在治疗的情况下血浆中的LTB4水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更小，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小，或在正常水平的某一范围内(例如正常水平的90％到110％、正常水平的85％到115％)。LTB4水平可以通过常规方法(例如免疫分析，参见例如基于依序竞争性结合技术[58]的市售R&D Systems分析)测定。
当给出剂量时，这涉及作为蛋白质或其功能等效物的试剂的剂量。为核酸分子的试剂的适当剂量可用于产生这些水平。剂量可以变化以考虑存在的非活性蛋白质的存在(例如，具有600个氨基酸PAS部分的PAS-nomacopan具有nomacopan的大约4×分子量，因此相当摩尔量将是nomacopan的量的大约四倍)。所提供的nomacopan的任何剂量的相当摩尔量可用于含有额外序列的其任何nomacopan功能等效物。相当摩尔量可使用常规方法计算。
末端补体活性可通过所属领域中已知的标准分析测量，例如使用Quidel CH50溶血分析和绵羊红细胞溶解CH50分析。
需要施用剂量的频率将取决于涉及的试剂的半衰期。nomacopan蛋白质或其功能等效物可以例如每日两次、每日或每两天、三天、四天、五天、六天或七天或更久，例如每日两次或每日)施用。半衰期延长形式，例如PAS化nomacopan分子可以施用频率较低(例如每两天、三天、四天、五天、六天、七天、10天、15天或20天或更久，例如每天或每两天或更久，或每周一次)
确切剂量和剂量频率还可取决于施用时患者的状态。确定剂量时可考虑的因素包括治疗或预防的需求、患者的疾病状态的严重程度、患者的一般健康状况、年龄、体重、性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和患者对疗法的耐受性或反应。确切量可通过常规实验确定，但可能最终取决于临床医师的判断。
剂量方案还可以采取初始“消除方案(ablating regimen)”后跟一个或多个后续剂量(例如维持剂量)的形式。一般来说，消除方案将大于一个或多个后续剂量。举例来说，对于nomacopan，这可以是0.6到1.2mg/kg，随后8到18、10到14或11到13小时(例如，约12小时)后0.3到0.6mg/kg的消除方案，后跟0.45到0.9mg/kg的维持剂量，其可以例如每日施用一次。
对于PAS化形式(例如PAS-nomacopan，例如如本文中其它地方所描述，适合的方案可以是6到12mg/kg(例如600mg)，随后3到10、4到8、5到7天，例如约7天后6到12mg/kg(例如600mg)的消除方案后，后跟4到8mg/kg(例如400mg)的维持剂量，其可以例如每日施用一次。
一个或多个消除剂量可以比维持剂量大至少1.5倍、2倍或5倍。消除剂量可以作为单次剂量，或在特定时间范围中一次或多次剂量(例如两次剂量)施用。通常，起始剂量将为单一24小时时段(或对于半衰期延长形式，单一周)中施用的1、2、3、4或5次剂量。维持剂量可为以规律时间间隔重复的更低剂量。维持剂量可以一定间隔，例如每12、24或48小时(或对于半衰期延长形式，每周，或每两周)重复。确切方案可通过常规实验确定，但可能最终取决于临床医师的判断。维持剂量可以是初始消除剂量的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或初始消除剂量的至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在另一实施方式中，在整个治疗过程中使用相同剂量(例如每日或每日两次或每周)。
优选地，nomacopan型蛋白质的局部剂量在每剂量50与500μg之间，更优选地在每剂量100与400μg之间，并且最优选地在每剂量200与300μg之间。或者，剂量可以是每剂量500到2000、600到1500、700到1250或约1250μg。对于融合蛋白，可以选择剂量以得到活性剂的相当摩尔量，例如对于PAS-nomacopan大约为每剂量4倍的量(例如，每剂量400与1600μg之间，并且最优选每剂量800与1200μg之间)。或者，剂量可以是每剂量2000到8000、2400到6000、2800到5000或约5000μg。
在局部施用组合物中，通常指示将一定数目的滴剂或一定长度的软膏施加至眼。调节任何组合物中的nomacopan型蛋白质的浓度以确保当遵循施加指令时施用正确的剂量对于所属领域的技术人员将是常规操作。举例来说，一滴通常为约40μl，并且因此一滴含有0.5％w/v nomacopan或L-nomacopan的溶液将含有200μg nomacopan或L-nomacopan。同样地，一滴含有2％w/v PAS-nomacopan或PAS-L-nomacopan的溶液将含有800μg PAS-nomacopan或PAS-L-nomacopan。因为PAS-nomacopan或PAS-L-nomacopan的分子量为nomacopan或L-nomacopan的分子量的大约4倍，所以相等体积的含有2％w/v PAS-nomacopan或PAS-L-nomacopan的溶液、含有0.5％w/v nomacopan或L-nomacopan的溶液提供相当摩尔量的蛋白质的nomacopan部分。类似剂量的nomacopan型分子可用于直接施用到眼中。在将组合物直接施加到眼中时，可使用例如10到50μl的体积。调节任何组合物中的nomacopan型蛋白质的浓度以确保施用正确的剂量对于所属领域的技术人员将是常规操作。举例来说，如果使用50μl含有0.5％w/v nomacopan或L-nomacopan的溶液，那么其将含有250μgnomacopan或L-nomacopan。同样地，一滴含有2％w/v PAS-nomacopan或PAS-L-nomacopan的溶液将含有1000μg PAS-nomacopan或PAS-L-nomacopan。
局部施用或直接施用到眼中的组合物也可以就其nomacopan型蛋白质浓度来定义，例如0.1-20％w/v、0.2-15、0.25-10、0.5-5％w/v(例如对于其PAS化形式，0.4-80、0.8-60、1-40、2-20％w/v)。
药物配制物
试剂一般将与药学上可接受的载体联合或含于其中来施用。术语“药学上可接受的载体”一般将为液体或可包括其它试剂，其前提是载体自身不诱导毒性作用或致使产生对接受药物组合物的个体有害的抗体。药学上可接受的载体可例如含有液体，如水、生理盐水、甘油、乙醇或助剂物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所用的药物载体将因此根据施用途径而不同。药学上可接受的载体的充分论述可见于[59]。在一优选实施方式中，试剂以眼用可接受的组合物施用，所述组合物可以是液体，例如在水中或PBS中的溶液。
试剂可任选地使用胶体递送系统(例如脂质体、纳米粒子或微粒(例如如[60]中所论述))递送。这些载体系统的优点包括保护敏感蛋白质、延长释放、降低施用频率、患者顺应性和受控血浆水平。
脂质体(例如，包括合成和/或天然来源的磷脂)可例如为20nm 100或200微米，例如小单室脂质体(25-50nm)、大单室脂质体(100-200nm)、巨单室脂质体(1-2μm)或多室脂质体(MLV；1μm-2μm)。
纳米粒子(大小在10到1000nm范围内的胶体载体)可由脂质、聚合物或金属制成。聚合纳米粒子可由天然或合成聚合物(例如壳聚糖、海藻酸酯、PCL、聚乳酸(PLA)、聚(乙交酯)、PLGA)制成，且可产生为纳米球(分子均匀地分布到聚合基质中)或纳米胶囊(携带限于聚合膜内的药物分子)。
还可使用例如由淀粉、海藻酸酯、胶原蛋白、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)制成的微粒子。
可替代地或另外存在水凝胶。
对于较大分子量分子，例如融合蛋白，还可使用额外赋形剂，例如透明质酸酶，例如以允许施用较大体积(例如2-20ml)。
治疗持续时间
优选地，治疗过程持续至少1、2、3、4、5或6周，或至少1、2、3、4、5或6个月或至少1、2、3、4、5或6年。治疗过程优选地持续至少直至受试者的症状减轻。治疗过程因此可以施用试剂(例如每日、每隔一天或每周)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40周。
附图简要说明
图1A：补体活化的经典和旁路路径的示意图。过敏毒素位于星暴状图形(starburst)中。
图1B：类二十烷酸路径的示意图。
图2A：nomacopan的一级序列。信号序列加下划线。半胱氨酸残基呈粗体。核苷酸和氨基酸数目指示于右侧。
图2B：nomacopan变异体的实例
图2C：结合LTB4但展示与C5的结合减少或不存在的nomacopan变异体的实例。
图2D和2E：示例性PAS-nomacopan(D)和PAS-L-nomacopan序列(E)。
图3：展示在免疫接种后第21天局部处理7天之后，个别眼(n＝12)的眼底检查的结果。条指示SD或SEM，且已应用双尾非参数t检验。
图4：展示实验自身免疫葡萄膜炎(EAU)模型中所使用的小鼠的视网膜内的细胞上的BLT1(LTB4受体)和C5a受体。所述图像展示了在玻璃体中捕获的浸润细胞。细胞核以蓝色展示，BLT1以绿色展示且C5a受体以红色展示。存在表达两种受体的细胞(黄色)。细胞由箭头指示。
图5：展示在免疫接种后第15天处理前和在免疫接种后第18天玻璃体内施用nomacopan型蛋白质之后EAU小鼠中的临床评分。在第15天(处理前)和第22天(处理后)对个别眼(n＝16)进行疾病的眼底镜评价。在第15天和第18天，用1-2μl指示化合物玻璃体内处理EAU小鼠。展示代表性眼底和对应的组织病理学图像，连同展示来自经处理小鼠(每组n＝3)的组织学评分的图形概述(nomacopan条指示SD或SEM，且已应用双尾非参数t检验。
图6：展示细胞的流式细胞分析的结果。(A-B)EAU小鼠中CD4+浸润细胞中的RORgt/T.bet+表达(y轴上RORgt表达且x轴上Tbet表达)。(C-D)CD4+细胞中单独的RORgt+表达(x轴上RORgt表达，y轴上FSC-H)。(E-F)CD4+细胞中单独的T.bet表达(x轴上T.bet表达，y轴上FSC-H))。(G-H)CD4+细胞中的IL-17A表达(x轴上IL-17A表达，y轴上FSC-H)。在图6b、图6d、图6f和图6h中的每一个中，每页上的顶行结果是针对生理盐水处理的EAU小鼠，第二行是针对nomacopan处理的小鼠，第三行是针对PAS-nomacopan处理的小鼠，第四行是针对PAS-L-nomacopan处理的小鼠，且第五行是针对地塞米松处理的小鼠。图6A、图6C、图6E、图6G展示相应表达水平的图形概述。条指示SEM。图展示每组中的8只小鼠的平均值(DEX n＝6)。
图7：(A)展示使用B10.RIII小鼠的实验自身免疫葡萄膜炎(EAU)小鼠模型的视网膜组织中的VEGF水平。各组小鼠用nomacopan(noma)、PAS-nomacopan(PAS-noma)、抗VEGF抗体(抗VEGF)或生理盐水玻璃体内处理。在诱导后21天收集视网膜组织。未诱导未处理的健康小鼠用作消极对照组(“健康ct”)。每个玻璃体内注射组存在六只小鼠并且存在两只未诱导未处理的小鼠(“健康ct”)。使用ELISA分析来分析视网膜组织的VEGF水平。所有分析在重复样品上进行两次。(B)展示在免疫接种后第15天处理前和在免疫接种后第18天玻璃体内施用nomacopan型蛋白质之后EAU小鼠中的临床评分。在第15天和第26天进行评价。(C)展示叠加的临床评分。
实施例
实施例1-3的材料和方法
EAU诱导
EAU如先前所描述进行诱导[61]，其是通过用300μg用补充有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(堪萨斯州劳伦斯(Lawrence,KS)Difco,VoigtGlobalDistribution)的完全弗氏佐剂(Complete Freud's Adjuvant，CFA，英国吉林厄姆(Gillingham,U.K.)Sigma-Aldrich)乳化的光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)161-180肽(SGIPYIISYLHPGNTILHVD，英国剑桥(Cambridge,U.K.)剑桥肽(Cambridge Peptides))的PBS溶液皮下对C57/Bl6小鼠(雌性，5-7周龄，Charles River)免疫接种。小鼠也腹膜内接受0.4μg百日咳(Sigma-Aldrich)。
处理
根据先前研究[62,]，从第14天开始监测视网膜发炎以评分(小鼠仅在如通过在第14天开始的视网膜眼底镜检查所评估，检测到视网膜发炎时包括于研究中))。在第1天、第2天和第5天收集小鼠(每组n＝6)。
对于玻璃体内施用，小鼠在免疫接种后第15天和第18天用1-2μl nomacopan(5mg/ml)、PAS-nomacopan(20mg/ml)、PAS-L-nomacopan(20mg/ml)、地塞米松或生理盐水进行处理。对于局部施用，小鼠用2-5μl nomacopan(5mg/ml)、PAS-nomacopan(20mg/ml)、L-nomacopan(5mg/ml)、地塞米松(Maxidex；DEX)或生理盐水每日处理两次，持续7天。疾病进展通过处理前和处理后视网膜眼底镜检查临床上分级并且组织学上评分。
EAU评分
小鼠如先前描述通过定期眼底观察定期评估EAU病征(例如使用Micron III眼底摄像机(加利福尼亚州普莱森顿(Pleasanton,CA)凤凰城研究实验室(Phoenix ResearchLabs))。临床评分基于视网膜视神经盘、视网膜血管、视网膜组织浸润和结构性损伤的观察结果。
在实验结束时自每只小鼠收集一只眼并且固定且包埋以组织学评分(例如去核并且固定于4％戊二醛中1小时并且转移到10％甲醛中至少24小时，包埋，H&E染色加工，且组织学检查)。如先前描述[63]，基于免疫细胞浸润水平和视网膜损伤程度，根据EAU评分的准则，以0到5的尺度分配评分。可进行针对单核细胞、嗜中性粒细胞和T细胞浸润的免疫荧光染色以识别浸润细胞群体的任何变化。
对于视网膜流式细胞测量术，收集视网膜层，将其切碎、过滤且再悬浮于培养基中以离体刺激(4小时)且针对细胞表面和细胞内标记物染色64
实施例1利用nomacopan型蛋白质局部施用的EAU处理
如图3中所示，相比于仅用生理盐水处理的小鼠，在局部施用nomacopan(5mg/ml)、PAS-nomacopan(20mg/ml)、L-nomacopan(5mg/ml)之后，EAU小鼠中的临床评分较低，其中结果对于L-nomacopan是统计学上显著的。观察到nomacopan和PAS-nomacopan处理的小鼠的倾向。L-nomacopan处理的小鼠的临床评分与地塞米松处理的小鼠的临床评分一致。平均评分±SEM；8.083±0.848；n＝12)相对于生理盐水对照组(10.33±0.666；n＝12；P＝0.048)，其中经处理小鼠中CD4+T细胞数目或亚型无显著变化。
这些结果是出人意料的，因为先前不知道测试分子可穿过角膜。与未PAS化形式相比，PAS-nomacopan的功效降低可反映PAS化形式较大的事实。
实施例2小鼠视网膜细胞中BLT1和C5a受体的共表达
用DAPI(蓝色指示细胞核)复染的使用识别BLT1和C5a受体的单克隆抗体的UAE小鼠中小鼠视网膜切片的共焦显微术展示发炎细胞中所表达的两种受体。一些个别细胞共表达两种受体，而也观察到许多表达单一受体的细胞。相信所述细胞中的至少一些是M2巨噬细胞，其已知迁移到视网膜损伤区域，其中其回应于LTB4刺激释放VEGF(参见图4、图7和实施例4)。
这与本文中呈现的其它结果一致，即nomacopan型蛋白质可为治疗所述疾病(例如，其中涉及LTB4和/或涉及补体路径的疾病)的有用试剂。
实施例3利用nomacopan型蛋白质玻璃体内施用的EAU处理
如图5中所示，在第15天和第18天nomacopan型蛋白质的玻璃体内施用之后(nomacopan(5mg/ml)、PAS-nomacopan(20mg/ml)、PAS-L-nomacopan(20mg/ml)，各自以1-2μl的体积向EAU小鼠施用)，在第22天观察到的临床评分一般低于对照(生理盐水处理的)小鼠中的临床评分，并且处理小鼠在两个时间点(第15天和第22天)之间临床评分的增加比对照(生理盐水处理的)小鼠更小。如通过临床评分(平均评分±SEM；3.813±1.014；n＝16)相对于生理盐水对照组(12.36±1.014；n＝16；P＝0.0001)所确定，PAS-nomacopan玻璃体内施用后缓和疾病进展。
图5还展示各种处理的复合组织学评分。同样，与对照(生理盐水处理的)小鼠相比，用每一种Nomocopan型分子处理后的临床评分较低，并且对照(生理盐水处理的)小鼠复合组织学评分与PAS-L-nomacopan(20mg/ml)处理的小鼠的复合组织学评分之间的差异统计学上显著。
举例来说，并且还如图5中所示，视网膜皱襞(retinal folding)(复合组织学评分的组分中的一个)在对照(生理盐水处理的)小鼠中与PAS-L-nomacopan(20mg/ml)处理的小鼠中相比在视觉上极不同。
这些数据首次证实在玻璃体内注射时nomacopan型蛋白质是生物活性的(即，其具有穿透布鲁赫氏膜和/或内部限制膜，以作用于脉络膜内存在的细胞的能力)。这与已经针对眼治疗测试的其它蛋白质分子，如兰帕单抗(Lampalizumab)[65]形成对比
EAU小鼠中的CD4+浸润细胞中的RORgt/T.bet+表达还通过流式细胞测量术分析(参见图6a-b，其展示CD4+细胞中RORgt/T.bet细胞的百分比，其中RORgt表达在y轴上并且Tbet表达在x轴上)。RORgt和Tbet为与Th17细胞类型和IL-17表达相关的T细胞标记物。与对照(生理盐水处理的)小鼠相比，nomacopan型蛋白质处理的小鼠中EAU小鼠中的CD4+浸润细胞中RORgt/T.bet+表达细胞的百分比更低。PAS-nomacopan(20mg/ml)处理的小鼠中的水平最低，并且这些小鼠和对照(生理盐水处理的)小鼠中的水平之间的差异在统计学上显著。在两次玻璃体内处理(第15天和18天)之后，与生理盐水对照组(21.28±3.544；n＝8；P＝0.003)相比，还在PAS-nomacopan处理的EAU小鼠中观察到视网膜双阳性Th1/Th17(RORγt+T-bet+)细胞的显著降低(4.717±2.627；n＝8)，而其它T细胞子集的表达水平无显著差异(数据未展示)。
也在这些细胞中分析单独的RORgt+表达和单独的T.bet表达(参见图6c-6f)。
还在这些细胞中分析IL-17A表达(参见图6g-6h)。相对于生理盐水对照组(27.47±3.461；n＝8；P＝0.02和0.0007)检测nomacopan和PAS-nomacopan处理组(平均％±SEM；分别14.67±3.534和7.019±3.005，n＝8)中Th17(IL-17A+CD4+)细胞的减少。
实施例4 EAU小鼠中的VEGF水平和利用nomacopan型蛋白质玻璃体内施用的处理
材料和方法
EAU诱导
EAU通过用300μg光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)161-180肽(SGIPYIISYLHPGNTILHVD)皮下对B10.RIII小鼠(雌性，5-7周龄，自育群落)免疫接种来诱导。EAU的适当方案陈述于[61]中，其中IRBP(英国剑桥Cambridge Peptides)的PBS溶液用补充有结核分枝杆菌(堪萨斯州劳伦斯Difco,Voigt Global Distribution)的完全弗氏佐剂(CFA，英国吉林厄姆Sigma-Aldrich)乳化。在此方案中，小鼠还腹膜内接受0.4μg百日咳(Sigma-Aldrich)。
处理和VEGF测量
在初始实验中，在诱导之后收集视网膜组织以测定VEGF水平。使用ELISA分析来分析视网膜组织的VEGF水平。
在后续实验中，在诱导后21天收集视网膜组织。各组小鼠诱导后第15天和第18天用1-2μl nomacopan(5mg/ml)、L-nomacopan(5mg/ml)、PAS-nomacopan(20mg/ml)、PAS-L-nomacopan(20mg/ml)、抗VEGF抗体(50μg/ml)BioLegend(Ultra-Leaf纯化抗小鼠VEGF A抗体)或生理盐水玻璃体内处理。未诱导未处理的健康小鼠用作消极对照组(“健康ct”)。每个玻璃体内注射组存在六只小鼠并且存在两只未诱导未处理的健康小鼠(“健康ct”)。使用来自R&D的小鼠VEGF的ELISA分析(小鼠Quantikine ELISA)来分析视网膜组织的VEGF水平。所有分析在重复样品上进行两次。
结果
这些组的视网膜组织中的VEGF水平展示于图7A中。在初始实验中，用IRBP诱导引起VEGF水平相比于正常对照组(数据未示出)显著增加。图7A中还可以看出，当比较“生理盐水”与“健康ct”时的增加。
图7A展示PAS-nomacopan在此EAU模型中对降低视网膜VEGF浓度至少与抗VEGF抗体一样有效。因为nomacopan和其变异体未知对VEGF具有任何直接作用，所以认为VEGF水平的降低是抑制被假定是这种模型中VEGF的主要来源[35]的M2巨噬细胞的基于LTB4活化的间接作用。
虽然还测试了L-nomacopan和PAS-L-nomacopan，但L-nomacopan的可用结果不确定。不确定的结果被认为是实验错误的结果，因此此处未展示。
认为通过nomacopan型蛋白质从嗜中性粒细胞清除LTB4也具有减少视网膜到外周血液LTB4浓度梯度的作用，由此减少Th-17细胞(如实施例3中所示)和巨噬细胞的发炎细胞运输且抑制其活化。补体C5a和攻膜复合体通过nomacopan和PAS-nomacopan对补体C5的抑制作用的额外减少还可以通过减小C5a浓度梯度并且减少包括Th细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的发炎细胞的活化来进一步减少VEGF的二级释放。减少嗜中性粒细胞的运输还可以减少可用于释放的LTB4的量。
如图7B和7C中所示得到临床评分。
抗VEGF抗体对这一模型中的发炎几乎无作用或无作用，然而在某些测试分子下观察到发炎的抑制。
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<210> 1
<211> 507
<212> DNA
<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
<400> 1
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gaaagcgact gcactggaag cgaacctgtt gacgccttcc aagctttcag tgagggcaaa 120
gaggcatatg tcctggtgag gtccacggat cccaaagcga gggactgctt gaaaggagaa 180
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gacaaggtcg agaaggaagt tccagattat gagatgtgga tgctcgatgc gggagggctt 420
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atgtatcccc atctcaagga ctgctag 507
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<212> PRT
<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
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1 5 10 15
Tyr Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser
35 40 45
Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu
50 55 60
Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr
65 70 75 80
Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val
85 90 95
Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp
100 105 110
Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro
115 120 125
Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val
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Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln
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Met Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys
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gggcttgaag tggaagtcga gtgctgccgt caaaagcttg aagagttggc gtctggcagg 420
aaccaaatgt atccccatct caaggactgc tag 453
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<212> PRT
<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
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Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln
1 5 10 15
Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp
20 25 30
Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln
35 40 45
Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp
50 55 60
Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala
65 70 75 80
Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln
85 90 95
Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr
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Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr
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Pro His Leu Lys Asp Cys
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acagactggg cttcaaccga ttggacgttt actttggacg gcgcaaaggt aacggcaacc 240
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cttgaagtgg aagtcgagtg ctgccgtcaa aagcttgaag agttggcgtc tggcaggaac 420
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<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
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Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro
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Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp
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Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser
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Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys
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<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
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Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn
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100 105 110
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115 120 125
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<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
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Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln
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<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
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<212> PRT
<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
<400> 12
Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu
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Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg
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Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu
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Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys
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<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
<400> 13
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<213> 毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）
<400> 14
Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly
1 5 10 15
Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp
20 25 30
Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
<223> PAS序列
<400> 17
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser
20
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 18
Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ser Pro Ser
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 19
Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ala
20
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 20
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala
20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS序列
<400> 21
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala
20
<210> 22
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nomacopan变异体1
<400> 22
Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln
1 5 10 15
Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp
20 25 30
Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln
35 40 45
Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp
50 55 60
Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala
65 70 75 80
Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln
85 90 95
Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr
100 105 110
Glu Gln Trp Gln Ser Asn Gly Ser Ala Asp Asp Lys Glu Val Glu Cys
115 120 125
Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr
130 135 140
Pro His Leu Lys Asp Cys
145 150
<210> 23
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nomacopan变异体2
<400> 23
Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln
1 5 10 15
Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp
20 25 30
Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln
35 40 45
Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp
50 55 60
Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala
65 70 75 80
Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln
85 90 95
Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr
100 105 110
Glu Met Trp Gln Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ala Val Glu Val Glu Cys
115 120 125
Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr
130 135 140
Pro His Leu Lys Gly Cys
145 150
<210> 24
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nomacopan变异体3
<400> 24
Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln
1 5 10 15
Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp
20 25 30
Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln
35 40 45
Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp
50 55 60
Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala
65 70 75 80
Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln
85 90 95
Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr
100 105 110
Glu Met Trp Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asp Glu Val Glu Val Glu Cys
115 120 125
Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr
130 135 140
Pro His Leu Lys Gly Cys
145 150
<210> 25
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nomacopan变异体4
<400> 25
Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln
1 5 10 15
Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp
20 25 30
Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln
35 40 45
Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp
50 55 60
Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala
65 70 75 80
Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln
85 90 95
Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr
100 105 110
Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys
115 120 125
Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr
130 135 140
Pro His Leu Lys Asp Cys
145 150
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环序列
<400> 26
Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nomacopan变异体1的环序列
<400> 27
Gln Trp Gln Ser Asn Gly Ser Ala Asp Asp Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nomacopan变异体2的环序列
<400> 28
Met Trp Gln Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ala Val
1 5 10
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nomacopan变异体3的环序列
<400> 29
Met Trp Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asp Glu Val
1 5 10
<210> 30
<211> 751
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS-nomacopan
<400> 30
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
290 295 300
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
370 375 380
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
385 390 395 400
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
405 410 415
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
420 425 430
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
435 440 445
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
450 455 460
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
465 470 475 480
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
485 490 495
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
500 505 510
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
515 520 525
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
530 535 540
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
545 550 555 560
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
565 570 575
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
580 585 590
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr
595 600 605
Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu
610 615 620
Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu
625 630 635 640
Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met
645 650 655
Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe
660 665 670
Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln
675 680 685
Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp
690 695 700
Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp Ala
705 710 715 720
Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu
725 730 735
Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys
740 745 750
<210> 31
<211> 751
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS-L-nomacopan
<400> 31
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
290 295 300
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
370 375 380
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
385 390 395 400
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
405 410 415
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
420 425 430
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
435 440 445
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
450 455 460
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
465 470 475 480
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
485 490 495
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
500 505 510
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
515 520 525
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
530 535 540
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
545 550 555 560
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
565 570 575
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
580 585 590
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr
595 600 605
Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu
610 615 620
Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu
625 630 635 640
Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met
645 650 655
Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe
660 665 670
Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln
675 680 685
Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp
690 695 700
Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Gln Ser Asp Ala
705 710 715 720
Gly Ala Asp Ala Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu
725 730 735
Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys Gly Cys
740 745 750
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 光感受器间类视黄醇结合蛋白（IRBP）
<400> 32
Ser Gly Ile Pro Tyr Ile Ile Ser Tyr Leu His Pro Gly Asn Thr Ile
1 5 10 15
Leu His Val Asp
20

Claims (59)

1.一种治疗或预防受试者的增生性视网膜疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
2.一种用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
3.一种治疗或预防受试者的增生性视网膜疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的试剂，所述试剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的核酸分子。
4.一种用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物的核酸分子。
5.根据权利要求1或3中任一项所述的方法，或根据权利要求2或4中任一项所述用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中试剂为或编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸19到168的序列的蛋白质，其中已进行至多50个氨基酸取代、插入或缺失，
且所述蛋白质结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，且与LTB4结合，
其中如SEQ ID NO:4中所示的成熟Nomacopan分子的位置6、38、100、128、129、150处的六个半胱氨酸氨基酸中的每一个保留，且LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个和C5结合残基组中的至少五个、十个或十五个或二十个或每一个保留或经历保守修饰，
其中所述LTB4结合残基为Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115(编号根据SEQ ID NO:4)，且所述C5结合残基为Val26、Val28、Arg29、Ala44、Gly45、Gly61、Thr62、Ser97、His99、His101、Met 114、Met 116、Leu117、Asp118、Ala119、Gly120、Gly121、Leu122、Glu123、Val124、Glu125、Glu127、His146、Leu147和Asp 149(编号根据SEQ ID NO:4)。
6.根据权利要求5所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述LTB4结合残基和C5结合残基中的至多2、3、4、5、10、15、20个经历保守修饰。
7.根据权利要求5或6所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述LTB4结合残基中的至少五个、十个或十五个或每一个和所述C5结合残基中的至少五个、十个或十五个或二十个或每一个保留。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述LTB4结合残基中的每一个和所述C5结合残基中的每一个保留或经历保守修饰。
9.根据权利要求5到8中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述LTB4结合残基中的每一个和所述C5结合残基中的每一个保留或经历保守修饰，其中所述C5和/或LTB4结合残基中的至多2、3、4、5、10、15、20个经历保守修饰。
10.根据权利要求5到9中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述LTB4结合残基中的每一个和所述C5结合残基中的每一个保留。
11.根据权利要求1或3中任一项所述的方法或根据权利要求2或4中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19到168的序列具有至少80％序列同一性的序列的蛋白质，
且所述蛋白质：
(i)结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，且与LTB4结合，或
(ii)与LTB4结合，但C5结合活性降低或不存在。
12.根据权利要求1、3或11中任一项所述的方法或根据权利要求2、4或11中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含与SEQID NO:2的氨基酸19到168的序列具有至少90％序列同一性的序列的蛋白质，
且所述蛋白质：
(i)结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b且与LTB4结合，或
(ii)与LTB4结合但C5结合活性降低或不存在。
13.根据权利要求1、3或11到12中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或11到12中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19到168的序列具有至少95％序列同一性的序列的蛋白质，
且所述蛋白质：
(i)结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，且与LTB4结合，或
(ii)与LTB4结合，但C5结合活性降低或不存在。
14.根据权利要求1、3或11中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或11中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码具有LTB4结合活性且与C5的结合减少或不存在的蛋白质，所述蛋白质包含以下或由以下组成：SEQID NO:4，其中1到30个氨基酸被取代，其中
(i)在SEQ ID NO:4的位置114到124中，发生以下取代(a)-(j)中的一个或多个：
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换；
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met Pro、His或Thr替换；
e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换；
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换；
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；或/和其中
(ii)SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换。
15.根据权利要求1、3、11或14中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4、11或14中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14所定义的蛋白质，其中：
a.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr，优选地Gln替换；
b.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro，优选地Ser替换；
c.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His，优选地Ala替换；
d.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His，优选地Asp替换；和
e.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr，优选地Ala或Asp替换。
16.根据权利要求1、3、11或14到15中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4、11或14到15中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14或15中任一项所定义的蛋白质，其中：
SEQ ID NO:4的位置114到124中：
f.Met116被Gln替换；
g.Leu117被Ser替换；
h.Gly121被Ala替换；
i.Leu122被Asp替换；和
j.Glu123被Ala替换。
17.根据权利要求1、3或5、11或14到16中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到16中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到16中任一项所定义的蛋白质，其中Trp 115未被取代。
18.根据权利要求1、3或5、11或14到17中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到17中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到17中任一项所定义的蛋白质，其中Met114、Trp115、Asp118、Ala119、Gly120和Val124未被取代。
19.根据权利要求1、3或5、11或14到18中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5或14到18中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到18中任一项所定义的蛋白质，所述蛋白质具有如SEQ ID NO:28中所示的SEQ ID NO:4的氨基酸位置114到124之间的环序列，并且其具有超出SEQ ID NO:23中所示的那些的相较于SEQ ID NO:4的1到20个额外取代。
20.根据权利要求1、3或5、11或14到19中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到19中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到19中任一项所定义的蛋白质，所述蛋白质具有超出SEQ IDNO:23中所示的那些的相较于SEQ ID NO:4的2到15个额外取代。
21.根据权利要求1、3或5、11或14到20中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到20中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到20中任一项所定义的蛋白质，所述蛋白质具有超出SEQ IDNO:23中所示的那些的相较于SEQ ID NO:4的3到10个额外取代。
22.根据权利要求1、3或5、11或14到21中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到21中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到21中任一项所定义的蛋白质，其中SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换。
23.根据权利要求1、3或5、11或14到22中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到22中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到22中任一项所定义的蛋白质，其中SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。
24.根据权利要求1、3或5、11或14到23中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到23中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到23中任一项所定义的蛋白质，其中SEQ ID NO:4中的Asp149被Gly、Gln、Asn、Ala、Met、Arg、Lys、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换。
25.根据权利要求1、3或5、11或14到24中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到24中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到24中任一项所定义的蛋白质，其中SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换且SEQ ID NO:4中的Asp149被Gly替换。
26.根据权利要求1、3或5、11或14到25中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到25中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到25中任一项所定义的蛋白质，其中SEQ ID NO:4的位置6、38、100、128、129、150处的所述六个半胱氨酸氨基酸保留为未经修饰形式。
27.根据权利要求1、3或5、11或14到26中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到26中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到25中任一项所定义的蛋白质，其中以下氨基酸中的一个或多个未被取代：Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115。
28.根据权利要求1、3或5、11或14到27中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到27中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到27中任一项所定义的蛋白质，其中所有以下氨基酸未被取代：Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115。
29.根据权利要求1、3或5、11或14到27中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5、11或14到27中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求14到27所定义的蛋白质，其中：
a.SEQ ID NO:4中的氨基酸5、6、11、13-15、20-21、24-27、29-32、35-41、45、47-48、50、52-60、64、66、69-81、83、84、86、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150都未被取代；或
b.SEQ ID NO:4中的氨基酸5、6、11、13-15、18、20-21、24-27、29-32、35-41、43、45、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150都未被取代；或
c.SEQ ID NO:4中的氨基酸5、6、11、13-15、18、20-21、24-25、27、30-32、35-41、43、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、98、100、102-104、112-113、115、126、128-129、132-139、145、148和150都未被取代。
30.根据权利要求1、3或5到13中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或5到13中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含以下或由以下组成的蛋白质：(i)SEQ ID NO:2的氨基酸19到168的序列，(ii)SEQ ID NO:22，(iii)SEQ ID NO:23，(iv)SEQ ID NO:24或(v)SEQ ID NO:25，
优选地其中所述试剂为或编码包含以下或由以下组成的蛋白质：SEQ ID NO:2的氨基酸19到168的序列或SEQ ID NO:23。
31.根据权利要求1、3、5到13或30中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4、5到13或30中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含以下或由以下组成的蛋白质：SEQ ID NO:2的氨基酸19到168的序列。
32.根据权利要求1、3或14或30中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或14中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含以下或由以下组成的蛋白质：SEQ ID NO:22(变异体1)。
33.根据权利要求1、3或14到30中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或14到30中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含以下或由以下组成的蛋白质：SEQ ID NO:23(变异体2)。
34.根据权利要求1、3或14或30中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或14或30中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含以下或由以下组成的蛋白质：SEQ ID NO:24(变异体3)。
35.根据权利要求1、3或14或30中任一项所述的方法，或根据权利要求2、4或14或30中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码包含以下或由以下组成的蛋白质：SEQ ID NO:25(变异体4)。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，或根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂为或编码根据权利要求1、2或5到35中任一项所定义的蛋白质的片段，且所述蛋白质
(i)结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，且与LTB4结合，或
(ii)与LTB4结合，但C5结合活性降低或不存在。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中包含SEQ ID NO:2的氨基酸19到168的所述蛋白质的所述功能等效物是融合蛋白，其包含(a)根据权利要求5到35中任一项所定义的序列，或由根据权利要求36所定义的片段组成，和(b)第二序列，且所述融合蛋白
(i)结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，且与LTB4结合，或
(ii)与LTB4结合，但C5结合活性降低或不存在。
38.根据权利要求37所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述第二序列为PAS序列。
39.根据权利要求37或38所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述融合蛋白包含以下中的一个的多个拷贝：ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ IDNO:15)；AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:16)；APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:17)，SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:18)，SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:19)，AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:20)和ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:21)，优选SEQ ID NO 15-21中的一个的20到30或30个拷贝。
40.根据权利要求37到39中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述融合蛋白包含(a)由以下组成的蛋白质：(i)图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168或(ii)SEQ ID NO:22、23、24或25，优选地，SEQ ID NO:2的氨基酸19到168或SEQ ID NO:22。
41.根据权利要求40所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述融合蛋白包含由30个SEQ ID NO:15的拷贝组成的PAS序列。
42.根据权利要求37到41中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述融合蛋白包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30。
43.根据权利要求37到41中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述融合蛋白包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂被局部施用到眼或直接施用到眼中。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂被局部施用到眼。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述试剂被直接施用到眼中，例如玻璃体内或脉络膜上施用。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述受试者为人类。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述增生性视网膜疾病选自自身免疫葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、湿性年龄相关性黄斑变性(脉络膜新血管形成)、干性年龄相关性黄斑变性(地图状萎缩)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视神经炎(例如青光眼相关视神经炎)、视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病，优选自身免疫葡萄膜炎。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述方法进一步包括施用第二增生性视网膜疾病治疗。
50.根据权利要求49所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述第二增生性视网膜疾病治疗选自抗炎药品、免疫调节疗法(IMT)药物、生物反应调节(BRM)药物、抗VEGF治疗和第二药剂，所述第二药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物。
51.根据权利要求50所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中：
(a)所述消炎药品为类固醇，如皮质类固醇，
(b)所述IMT药物选自甲氨喋呤、硫唑嘌呤或霉酚酸酯，
(c)所述BRM药物为抗TNF试剂，例如抗TNFα抗体或其片段，如英利昔单抗或阿达木单抗，
(d)所述抗VEGF治疗为抗VEGF-A抗体或其片段，如贝伐单抗(阿瓦斯汀)或兰比珠单抗(乐舒晴)，抗VEGF适配体，如哌加他尼(玛古真)，或另一抗VEGF拮抗剂，如阿柏西普(埃利亚)，
(e)所述第二药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168的蛋白质或所述蛋白质的功能等效物，如权利要求1到43中任一项所定义。
52.根据权利要求49到51中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述方法包括将根据权利要求5到36中任一项所定义的试剂局部施用到眼，且将所述第二增生性视网膜疾病治疗直接施用到眼中，例如玻璃体内或脉络膜上施用。
53.根据权利要求52所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中第二增生性视网膜疾病治疗是根据权利要求37到43中任一项所定义的融合蛋白的试剂。
54.根据权利要求52或53所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述方法包括将根据权利要求5到31或36中任一项所定义的试剂局部施用到眼，且将第二增生性视网膜疾病治疗直接施用到眼中，所述第二增生性视网膜疾病治疗是试剂，其是融合蛋白，如根据权利要求37到42中任一项所定义，其中所述试剂和所述融合蛋白各自结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，且与LTB4结合。
55.根据权利要求54所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述方法包括将包含以下或由以下组成的蛋白质局部施用到眼：图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19到168，且将根据权利要求42所述的融合蛋白直接施用到眼中。
56.根据权利要求52或53中任一项所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述方法包括将根据权利要求5到30或32到36中任一项所定义的试剂局部施用到眼，且将第二增生性视网膜疾病治疗直接施用到眼中，所述第二增生性视网膜疾病治疗是试剂，其是融合蛋白，如根据权利要求37到41或43中任一项所定义，其中所述药剂和所述融合蛋白各自与LTB4结合，但C5结合活性减少或不存在。
57.根据权利要求56所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述方法包括将根据权利要求32所定义的蛋白质局部施用到眼，且将根据权利要求43所述的融合蛋白直接施用到眼中。
58.根据权利要求52所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述方法包括将根据权利要求5到30或32到36中任一项所定义的试剂局部施用到眼，且将第二增生性视网膜疾病治疗直接施用到眼中，所述第二增生性视网膜疾病治疗为抗VEGF治疗。
59.根据权利要求58所述的方法或用于治疗或预防增生性视网膜疾病的方法中的试剂，其中所述抗VEGF治疗为抗VEGF-A抗体或其片段，如贝伐单抗(阿瓦斯汀)或兰比珠单抗(乐舒晴)，抗VEGF适配体，如哌加他尼(玛古真)，或另一抗VEGF拮抗剂，如阿柏西普(埃利亚)。
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