KR20220018963A

KR20220018963A - 치료 방법

Info

Publication number: KR20220018963A
Application number: KR1020217037686A
Authority: KR
Inventors: 윈 에이치 웨스턴-데이비스; 버지니아 칼더
Original assignee: 볼루션 이뮤노 파마슈티컬스 에스에이
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2022-02-15
Also published as: AU2020263709A1; WO2020216513A1; GB202000955D0; EP3958974A1; IL287250A; CN114072206A; US20220211810A1; CA3137240A1; GB201905810D0; JP2022530068A

Abstract

본 발명은 증식성 망막 질병을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

치료 방법

본 발명은 증식성 망막 질병 (proliferative retinal disease)의 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.

본문에서 언급되고 본 기재내용의 끝에 나열된 모든 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다.

보체(complement)

보체 시스템은 외부 침입에 대한 신체의 자연 방어 메커니즘의 필수적인 부분이며 염증 과정에도 관여한다. 혈청 및 세포 표면의 30개 초과의 단백질이 보체 시스템의 기능 및 조절에 관여한다. 최근에, 이로운 과정과 병적인 과정 모두와 관련될 수 있는 보체 시스템의 약 35가지 공지된 성분뿐만 아니라, 보체 시스템 자체가 혈관 신생, 혈소판 활성화 및 지혈, 글루코스 대사 및 정자 생성과 같은 다양한 기능을 가진 적어도 85개의 생물학적 경로와 상호작용한다는 것이 분명해졌다.

보체 시스템은 면역 시스템에 의해 비자기로 인식되는 물질의 존재에 의해 활성화된다. 3가지 활성화 경로가 존재한다: (1) IgM 및 IgG 복합체 또는 탄수화물 인식에 의해 활성화되는 통상적 경로; (2) 비자기 표면 (특정 조절 분자 부재) 및 박테리아 내독소에 의해 활성화되는 대체 경로; 및 (3) 만난-결합 렉틴 (MBL)이 병원체 표면의 만노스 잔기에 결합함으로써 활성화되는 렉틴 경로. 세 가지 경로는 세포 표면에서 유사한 C3¹ 및 C5 전환효소의 형성을 통해 보체 활성화의 생성을 야기하는 사건의 병렬 전달계로 구성되어 염증의 급성 매개인자 (C3a 및 C5a)의 방출과 막 공격 복합체 (MAC)의 형성을 야기한다. 통상적 (본 명세서에서 C1q를 통한 통상적인 것 및 MBL을 통한 렉틴으로 규정됨) 및 대체 경로에 관련된 병렬 전달계가 도 1에 나와 있다.

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¹문자 "C" 뒤에 "3"과 같이 숫자를 붙임으로써 보체 경로의 성분을 지칭하여 "C3"이 보체 단백질 C3을 지칭하는 것이 일반적이다. 이러한 성분 중 일부는 보체 시스템 활성화 동안 절단되며 절단 산물에는 숫자 뒤에 소문자가 표시된다. 따라서, C5는 통상적으로 C5a 및 C5b로 표지된 단편으로 절단된다. 보체 단백질은 반드시 숫자 순서대로 작용하는 것은 아니므로 숫자가 반드시 작용 순서를 나타내는 것은 아니다. 이 명명 규칙은 본 출원에서 사용된다.

통상적 보체 경로, 대체 보체 경로 및 렉틴 보체 경로는 본 명세서에서 총칭하여 보체 경로로 지칭된다. C5b는 보체 활성화의 '후기' 또는 '말단' 사건을 개시시킨다. 이는 말단 보체 성분이 상호작용하여 MAC을 형성하는 일련의 중합 반응으로 구성되며, MAC는 일부 병원체의 세포막에 기공을 생성하여 이를 사멸에 이르게 하거나 용해 유발 없이 신체 자체 세포를 활성화할 수 있다. 말단 보체 성분에는 C5b (막 공격 시스템의 조립을 개시함), C6, C7, C8 및 C9가 포함된다.

LTB4

류코트리엔 B4 (Leukotriene B4) (LTB4)는 기재된 가장 강력한 화학주성 및 화학동력학적 에이코사노이드 (eicosanoid)이며 인테그린의 상향 조절을 통해 호중구가 혈관 내피에 부착되는 것을 촉진한다[1]. 이는 또한 호중구의 완전한 분비촉진제이며 응집을 유도하고 미세혈관 투과성을 증가시킨다. LTB4는 자연 살해 세포, 단핵구 및 호산구를 집합시키고 활성화한다. 이는 슈퍼옥사이드 라디칼 형성을 증가시키고[2], 조직 염증을 증가시키고 연장시킬 수 있는 다수의 전염증성 사이토카인 및 매개인자의 생성을 포함하는 유전자 발현을 조절한다[3,4]. LTB4는 또한 적응 면역 반응의 유도 및 관리에 관여한다. 예를 들어, 배수 림프절로 이동하는 수지상 세포의 조절[5,6], 폐 T 세포에서 Th2 사이토카인 IL-13 생성[7], 항원 특이적 효과기 CD8+ T 세포의 집합[8] 및 인간 B 림프구의 활성화 및 증식[9].

LTB4와 하이드록시에이코사노이드는 BLT1 및 BLT2 G-단백질 결합 수용체를 통해 효과를 매개한다[10,11]. 인간 BLT1은 LTB4에 특이적인 고친화도 수용체 (Kd 0.39 - 1.5 nM; [12])이며 경쟁 결합 연구에서 20-하이드록시 LTB4 및 12-epi LTB4만이 LTB4를 대체할 수 있다[13]. 인간 BLT2는 BLT1보다 LTB4에 대해 20배 더 낮은 친화도 (Kd 23 nM)를 가지며 12-epi LTB4, 20-하이드록시 LTB4, 12(S)- 및 15(S)-HETE 및 12(S)- 및 15(S)-HPETE를 포함하는 광범위한 에이코사노이드에 결합하여 활성화된다[13]. 인간 BLT2는 인간 및 마우스 BLT1과 45.2 및 44.6%의 아미노산 동일성을 가지며, 인간 및 마우스 BLT2는 92.7% 동일성(identity)을 갖는다[11].

인간 BLT1은 최근에 내피 세포 및 혈관 평활근 세포에서 기재되었지만 주로 백혈구 표면에서 발현된다. 인간 BLT2는 광범위한 조직 및 세포 유형에서 발현된다. BLT1 및 BLT2의 많은 특이적 길항제가 인간 호중구의 활성화, 혈관외유출 및 아폽토시스를 억제하고[14] 염증성 관절염[15] 및 신장 허혈 재관류[16] 마우스 모델에서 호중구 침윤으로 인한 증상을 감소시키는 것으로 기재되었다. BLT1이 확실히 마우스의 콜라겐 유발 관절염과 같은 일부 병리에서 지배적인 역할을 하지만[18], BLT1 및 BLT2가 LTB4 및 하이드록시에이코사노이드를 통해 병리 효과를 매개할 수 있다[17]는 연구 수가 증가하고 있다. BLT1-/- 결핍 마우스는 또한 염증 반응에서 호중구 이동을 유도하는 BLT1의 중요성을 강력하게 나타내었다. 특히, 5LO 결핍 마우스 균주가 호중구에 대한 BLT1의 자가분비 활성화가 관절염 관절로의 집합에 필요하다는 것을 보여주기 위해 사용되었다[19].

많은 시판 약물이 에이코사노이드를 표적화한다. 여기에는 포포리파제 A2 (phopholipase A2)(PLA2)를 조절하여 에이코사노이드 전구체 아라키돈산 (AA)의 방출을 억제하는 글루코코르티코이드 (glucocorticoid)가 포함된다[20]. 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) 및 프로스타글란딘 및 트롬복산의 합성을 억제하는 기타 COX2 억제제[21]. LTB4 합성에 필요한 5-LOX 효소 및 기타 류코트리엔 (Zileuton, [22])을 억제하거나 시스테닐 류코트리엔 (Zafirlukast 및 Montelukast) [23]의 효과를 매개하는 CysLT1 수용체에 길항작용하는 다수의 류코트리엔 (LK) 조절제가 있다. LK 조절제는 경구로 사용할 수 있으며 예를 들어 천식과 같은 치료에 사용하기 위해 FDA의 승인을 받았다. LTB4 또는 그 수용체에 특이적으로 작용하는 약물은 아직 시장에 출시되지 않았다.

안구 병태

배경기술

본 발명은 망막 상의 혈관신생을 수반하는 망막 병태인 증식성 망막 질병의 치료에 관한 것이다. 예를 들어, 망막 허혈로 인한 혈액 공급 감소에 대한 반응으로 혈관이 생성될 수 있다. 이 혈관신생은 일반적으로 시신경유두 또는 망막 표면에서 새로운 혈관 생성을 자극하는 성장 호르몬인 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)에 대한 반응으로 발생한다. 그러나 이러한 새로운 혈관은 특히 약하고 누출되기 쉽고 쉽게 파열되어 출혈과 중증 시력 상실을 야기할 수 있다.

이러한 질병은 자가면역 포도막염 (autoimmune uveitis), 감염성 포도막염 (infective uveitis), 습성 연령 관련 황반 변성 (wet age-related macular degeneration) (맥락막 혈관신생 (choroidal neovascularisation)), 건성 연령 관련 황반 변성 (dry age-related macular degeneration ) (지도모양 위축 (geographic atrophy)), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨병성 황반 부종 (diabetic macular oedema), 시신경염 (optic neuritis) (예를 들어, 녹내장 관련 시신경염 (glaucoma associated optic neuritis)), 망막 정맥 폐쇄 (retinal vein occlusion) 및 미숙아 망막병증 (retinopathy of prematurity)을 포함한다. 또한 스타가르트병 (Stargardts disease) 및 결절성 맥락막 혈관병증이 포함된다. 특히 흥미로운 것은 포도막염이다.

이러한 특정 병태에 대한 현재 치료이 존재한다. 예를 들어, 비감염성 포도막염에서 치료는 점안제로 제공되거나, 안구 내 또는 주변, 경구 (구강) 또는 정맥 주사되는 항염증제, 예를 들어, 스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드) 또는 면역조절 요법 (IMT) 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 미코페놀레이트), 생물학적 반응 조절제 (BRM) 약물 (예를 들어, 인플릭시맙 (infliximab) 또는 아달리무맙 (adalimumab)과 같이 TNF알파에 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있는 항-TNF알파 제제(agent))에 의한 안구 염증의 조절에 집중되고 있다. 습성 AMD의 경우, 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄 및 당뇨병성 망막병증의 현재 치료에는 항-VEGF 치료제가 포함된다. 여기에는 항 VEGF-A 항체 또는 이의 단편 (예를 들어, 베바시주맙 (Avastin), 라니비주맙 (Lucentis)), 항-VEGF 앱타머 (예를 들어, 페갑타닙 (Macugen)) 및 기타 VEGF 길항제, 예를 들어, 애플리버셉트 (Eylea)) (인간 IgG1 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인으로부터 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-결합 부분으로 이루어진 재조합 융합 단백질)가 포함된다. 이러한 항 VEGF 약제는 약 1 내지 2개월마다 유리체내로 주사할 수 있다. 이러한 치료는 미숙아 망막병증에도 제안되었다.

증식성 망막 질병은 충족되지 않은 임상 요구로 남아 있다.

보체 억제제

WO 2004/106369 (Evolutec Limited[24])는 보체 억제제에 관한 것이다. 개시된 보체 억제제의 특정 하위세트는 C5에 대한 것이고 임의의 보체 활성화 경로에 의해 C5가 C5a 및 C5b로 절단되는 것을 방지한다. 이러한 C5 절단 억제제의 특정 예는 오르니트도로스 모우바타 (Ornithdoros moubata) 종의 진드기에 의해 생성되는 단백질이며, 이는 성숙한 형태에서 WO 2004/106369의 도 4에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168로 이루어진 단백질이다. WO 2004/106369에서 이 단백질은 "rVA576", "EV576" 및 "OmCI 단백질"이라는 명칭으로 공지되어 있으며 최근에는 "커버신"으로 공지되어 있다[25]. 이 단백질은 본 명세서에서 단백질에 대한 INN인 "노마코판 (nomacopan)"으로 지칭된다.

진드기에서 노마코판은 성숙 노마코판(mature nomacopan) 단백질의 N-말단에 WO 2004/106369의 도 4에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 18을 포함하는 리더 서열을 갖는 단백질원으로서 발현된다. 리더 서열은 발현 후에 절단된다. 이의 성숙한 단백질은 WO 2004/106369의 도 4 및 본 출원의 도 2에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168로 이루어진 서열을 갖는다.

노마코판은 또한 류코트리엔 B4 (LTB4) 활성을 억제하는 능력이 있다. LTB4에 결합하는 능력은 당업계에 공지된 표준 시험관내 분석, 예를 들어 등온 적정 열량계 또는 형광 적정에 의해 표지된 LTB4에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항-LTB4 항체와 노마코판 간의 경쟁적 ELISA에 의해 입증될 수 있다.

WO 2007/028968, WO 2008/029167, WO 2008/029169, WO 2011/083317 및 WO 2016/198133과 같은 다수의 추가 특허 출원이 있으며, 이는 다양한 분야에서 노마코판 또는 이의 기능적 균등물의 사용에 관한 것이다. 증식성 망막 질병의 치료에서 노마코판 또는 임의의 기능적 균등물(functional equivalent)의 효능을 확인하는 이러한 분야의 실험적 증거는 없다.

본 발명에 이르게 한 연구에서, 본 발명자들은 LTB4 수용체 및 C5a 수용체가 실험적 자가면역 포도막염 방식에 사용된 마우스의 망막 내 세포에 공존한다는 것을 보여주었고, 본 연구에서 이 질병은 망막 결합 단백질 (RBP3)의 주사에 의해 유발되었다. 이들 세포 중 적어도 일부는 LTB4 자극에 대한 반응으로 VEGF를 방출하는 망막 손상 영역으로 이동하는 것으로 공지된 M2 대식세포로 여겨진다. 또한, 유리체내로 주사될 때, 위에서 논의된 바와 같이 분자 노마코판 (LTB4에 결합하고 또한 C5에 결합하여 보체 경로를 억제함), 및 장기 작용 형태의 노마코판 및 LTB4-특이적-노마코판 (또는 "L-노마코판", LTB4에 결합하지만 C5에 결합하여 보체 경로를 억제하지 않음) (본 명세서에서 PAS-노마코판 및 PAS-L-노마코판으로 지칭됨) 둘 모두는 실험적 자가면역 포도막염 (EAU) 모델에서 임상 점수 및 종합 조직학 점수를 향상하는 것으로 나타났다. 이 분자는 또한 Th17 세포 (및 IL-17)의 집합을 감소시켰다. Th17 하위세트는 인간 포도막염에서 검출되었으며 EAU에서 질병을 매개한다. 노마코판, L-노마코판 및 장기 작용 노마코판은 또한 이러한 마우스의 임상 점수에 영향을 미쳤는데, 이는 이 분자가 각막에 침투할 수 있다고 확인되지 않았기 때문에 놀라운 것으로 고려된다.

본 발명자들은 또한 EAU의 별도의 마우스 모델에서 RBP3 (IRBP로도 알려짐)에 의한 유도가 망막 조직에서 VEGF 수준의 상당한 증가를 야기한다는 것을 발견하였다. 노마코판 유형 단백질의 유리체내 주사는 항-VEGF 항체의 유리체내 주사와 마찬가지로 VEGF 수준의 감소를 야기한다 (실시예 4 및 도 7a). 노마코판과 그 변이체가 VEGF에 직접적인 영향을 미치는 것으로 공지되어 있지 않기 때문에, 이는 적어도 위에서 언급한 M2 대식세포의 LTB4 활성화 억제를 통한 간접적인 효과라고 제안되며, 이는 이 모델에서 VEGF의 주요 원인으로 고려된다. 노마코판 유형 단백질에 의한 호중구로부터의 LTB4 소거는 또한 망막에서 말초혈로의 LTB4 농도 구배를 감소시켜 Th17 세포 (실시예 3에 나타낸 바와 같음) 및 대식세포의 염증 세포 이동을 감소시키는 효과가 있는 것으로 고려된다.

노마코판은 LTB4를 억제하는 능력이 있으므로 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 증식성 망막 질병의 예방 및 치료에 특히 유리하다. 또한 특정 이점이 있는 경우, 예를 들어 보체 경로가 질병 병리에 관여하는 경우 보체 경로를 억제 (C5 억제)할 수 있다. LTB4를 억제하지만 C5를 억제하지 않는 변형된 형태의 노마코판이 또한 유용할 수 있으며, 특히 보체 경로를 억제하는 것이 바람직하지 않을 수 있는 경우에 유용할 수 있다.

노마코판은 이전에 안구 표면 병태 (예를 들어, 아토피 각결막염, 해당 단백질의 안구 표면 투여, 예를 들어 WO2018193120 참조)에 대한 잠재적인 치료제로 개시되었지만, 분자가 각막을 투과하고, 따라서 안구 표면 병태가 아닌 안구 병태의 치료를 위해 국소 적용될 수 있음은 이전에 공지된 바 없으며, 분자가 안구내로 직접 투여될 때 효과적일 수 있다는 것 역시 이전에 공지되어 있지 않다. 예를 들어, 안구내로 직접 투여하더라도 다양한 장벽 (예를 들어, 내부 제한막 및 브루크막 (Bruch's membrane)이 존재함)으로 인해 치료 분자가 효과를 발휘해야 하는 위치에 도달하지 못할 수 있다. 실제로, 다양한 이전 보체 억제제 분자가 이전에 안구 병태에 대해 시험되었지만 효과적인 것으로 밝혀지지 않았다 (예를 들어, [26] 참조).

따라서 본 연구 이전에, 노마코판-유형 단백질이 국소 투여되거나 안구내로 직접 도입함으로써 증식성 망막 질병을 치료하는데 사용될 수 있다는 것은 공지되어 있지 않았다. 또한, 노마코판 유형 단백질이 망막 조직에서 VEGF 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다는 것은 공지되어 있지 않다.

노마코판-유형 단백질은 현재 국소 투여되거나 안구내로 직접 도입될 때 실험적 자가면역 포도막염 마우스 모델에서 임상 점수를 감소시키는 것으로 나타났다. 이는 포도막염을 치료하는데 사용되는 이러한 단백질의 능력을 나타낼뿐만 아니라, 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 증식성 망막 질병의 치료를 위한 이러한 단백질의 사용을 지원한다. 또한 노마코판은 보체 경로 (C5 억제) 및 또한 LTB4를 모두 억제하는 능력이 있으므로 또한 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 보체 성분이 있는 증식성 망막 질병의 예방 및 치료에 특히 유리하다. LTB4에는 결합하지만 C5에는 결합하지 않는 변형된 형태 (예를 들어, L-노마코판)이 보체 성분이 없는 경우 및/또는 보체 시스템을 억제하는 것이 불리할 수 있는 경우 증식성 망막 질병의 예방 및 치료에 특히 유리할 수 있도록 단백질의 이중 기능을 추가로 조작할 수 있다. 다시 말하지만 이는 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 사용할 수 있다.

실시예 1에서, 노마코판 유형 단백질의 국소 투여는 마우스 모델의 실험적 자가면역 포도막염에서 임상 점수를 감소시킨다. 후속 실시예에서 노마코판 유형 단백질의 유리체내 투여는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 포도막염의 임상 점수를 감소시킨다.

따라서, 본 발명자들은 진드기 단백질 노마코판 (또한 당업계 및 본 명세서에서 EV576 및 OmCI로 지칭되고 [24], 이전에는 "커버신 (Coversin)"으로 지칭됨) 및 이의 변이체의 투여가 자가면역 포도막염 및 다른 증식성 망막 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 입증하였다.

본 발명은 따라서 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

본 발명은 또한 대상체의 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 치료 또는 예방적 유효량의 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물을 인코딩(encoding)하는 핵산 분자인 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물을 인코딩하는 핵산 분자인 제제를 제공한다.

본 발명은 또한 대상체의 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, (a) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량 및 (b) 제2 증식성 망막 질병 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 (a) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제 및 (b) 제2 증식성 망막 질병 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 대상체의 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서 (a) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물을 인코딩하는 핵산 분자인 제제의 치료 또는 예방적 유효량 및 (b) 제2 증식성 망막 질병 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 (a) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물을 인코딩하는 핵산 분자인 제제 및 (b) 제2 증식성 망막 질병을 제공한다.

본 발명은 또한 증식성 망막 질병을 치료하는데 필요한 제2 증식성 망막 질병 치료제의 양을 감소시키거나, 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는데 필요한 제2 증식성 망막 질병 치료제의 지속기간을 감소시키거나, 상기 제2 증식성 망막 질병 치료제에 의한 연속 치료 사이의 시간을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량, 또는 상기 제제를 인코딩하는 핵산 분자, 및 상기 제2 증식성 망막 질병 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.

실시예 4는 노마코판 유형 단백질이 EAU의 마우스 모델에서 VEGF 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 노마코판 및 그 변이체는 VEGF에 직접적인 영향을 미치는 것으로 공지되어 있지 않으므로, 이는 이 모델에서 VEGF의 주요 공급원으로 생각되는 위에서 언급한 M2 대식세포의 LTB4 활성화 억제를 통한 간접적인 효과임을 시사한다.

따라서, 본 발명의 제제 및 방법은 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 망막 조직에서 VEGF 신호전달의 감소에 의해 예를 들어 망막 조직에서 VEGF 수준 감소를 통해 증식성 망막 질병을 예방하거나 치료할 수 있다. 이러한 감소의 효과는 결과적으로 예를 들어 혈관신생의 감소 및/또는 혈관 투과성의 감소를 야기한다.

본 발명의 제제 및 방법은 또한 M2 대식세포의 LTB4 활성화의 감소를 통해 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이 증식성 망막 질병을 예방하거나 치료할 수 있다.

질병

증식성 망막 질병은 망막 상의 혈관신생을 수반하는 망막 병태이다. 예를 들어, 망막 허혈로 인한 혈액 공급 감소에 대한 반응으로 혈관이 생성될 수 있다. 이 혈관신생은 일반적으로 시신경유두 또는 망막 표면에서 새로운 혈관 생성을 자극하는 성장 호르몬인 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)에 대한 반응으로 발생한다. 그러나 이러한 새로운 혈관은 특히 약하고 누출되기 쉽고 쉽게 파열되어 출혈과 중증 시력 상실을 야기할 수 있다. 가능한 증식성 망막 질병은 자가면역 포도막염, 감염성 포도막염, 습성 연령 관련 황반 변성 (맥락막 혈관신생), 건성 연령 관련 황반 변성 (지도모양 위축), 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 시신경염 (예를 들어, 녹내장 관련), 망막 정맥 폐쇄 및 미숙아 망막병증을 포함한다. 다른 증식성 망막 질병에는 스타가르트병 및 결절성 맥락막 혈관병증이 포함된다.

본 발명자들은 실험적 자가면역 포도막염의 마우스 모델에서의 실험에서 노마코판, L-노마코판, PAS-노마코판 및 PAS-L-노마코판을 시험하였다. 특정 분자는 국소 투여되었다. 특정 분자는 유리체내로 투여되었다. 노마코판-유형 단백질이 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 이 마우스 모델에서 임상 점수를 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 하기에 제시된 데이터는 또한 이들 분자가 Th-17 세포의 집합을 감소시켜 IL-17 수준을 감소시킬 수 있음을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 LTB4 수용체 (BLT1)가 이 마우스 모델에서 마우스 망막으로 침투하는 세포에서 관찰될 수 있음을 발견하였다. 또한, 이러한 노마코판 유형 분자는 LTB4에 결합하여 그 작용을 억제할 수 있다.

LTB4 신호전달을 감소시키는 시험된 분자의 능력은 망막 손상 시 M2 대식세포가 이동하여 망막의 손상된 부위에 부착된다는 관찰과 일치한다. 이러한 M2 대식세포는 LTB4 자극에 대한 반응으로 VEGF를 방출하여 새로운 혈관 생성을 자극한다[35]. 따라서 임의의 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 노마코판 유형 단백질의 투여는 VEGF 수준의 감소를 야기하는 것으로 고려되며, 이는 새로운 혈관의 생성을 감소 및/또는 방지한다. 이 이론은 실시예 4 및 도 7a의 데이터와 일치하며, 이는 EAU의 마우스 모델에서 노마코판 유형 단백질의 투여가 망막 조직에서 VEGF의 수준을 유의하게 감소시킨다는 것을 나타낸다.

따라서, 노마코판 유형 단백질은 증식성 망막 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 증식성 망막 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 증식성 망막 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

이러한 질병의 존재는 당업계에 널리 공지된 통상적인 진단에 의해 결정될 수 있다. 특정 병태의 중증도는 또한 점수화할 수 있는데, 이는 특정 치료가 효과적인지 평가하는데 유용하다.

포도막염

자가면역 포도막염은 외부 자극에 이차적인 선천적 염증 반응에 의해 유발되거나 자가항원에 대한 자가면역 반응으로 인한 포도막 성분 (홍채, 모양체 및 맥락막)의 염증 과정이다. 이는 전방, 중간, 후방 또는 확산과 같은 다양한 해부학적 형태로 존재할 수 있다. 전방 포도막염은 홍채에 영향을 미치는 홍채염 또는 모양체에 영향을 미치는 홍채모양체염으로 나타나는 가장 흔한 형태의 질병이다. 중간 포도막염 또는 유리체염은 유리체강을 침범하고 절제 (pars plan)를 포함할 수 있으며 후방 포도막염은 맥락막염 (choroiditis), 망막맥락막염 (retinochoroiditis) 및 맥락망막염 (chorioretinitis)의 세 가지 유형으로 나뉜다. 맥락망막염은 일반적으로 톡소플라스마증 (toxoplasmosis)과 같은 감염성 질병과 관련된다. 확산성 침범 또는 포도막염이 많은 부위에 영향을 미치는 경우, 이를 범포도막염이라고 한다.

포도막염의 유형은 국제 포도막염 연구 그룹 (IUSG) 분류를 사용하여 분류할 수 있고 포도막염 명칭 표준화 (SUN) 그룹을 사용하여 포도막염의 발병, 지속기간 및 경과에 대한 기준을 규정할 수 있다[27]. 포도막염은 임의의 연령에서 발병할 수 있고 심지어 소아에서도 발생할 수 있지만, 주로 20 내지 50세의 사람들에서 발병한다. 포도막염 비율은 65세 이상의 환자에서도 높다.

노마코판 유형 단백질은 실시예 1 및 3에 나타낸 바와 같이 자가면역 포도막염 (EAU)의 마우스 모델에서 임상 점수 및 조직학 점수를 감소시키는 것으로 나타났다.

또한, CD4+ T-세포 하위세트인 Th17 세포는 감염성 및 비감염성 포도막염의 다수의 형태에 관여하는 것으로 밝혀진 전염증성 사이토카인인 인터루킨 (IL)-17을 생성한다. IL-17은 IL-6, 과립구 콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구-대식세포-CSF, IL-1, TGF-β 및 종양 괴사 인자 (TNF)-α와 같은 다른 염증성 사이토카인의 생성을 유도한다[28]. 본 실시예는 또한 노마코판 유형 단백질이 IL-17을 발현하는 CD4+ 세포의 백분율을 감소시킬 수 있음을 입증한다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이들 분자는 IL-17 생성 Th17 세포의 수준을 감소시킬 수 있으며, 이는 포도막의 염증을 감소시켜 포도막염의 진행을 감소시킨다. 따라서 노마코판 유형 단백질은 자가면역 포도막염 또는 감염성 포도막염의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다.

VEGF는 혈관신생을 촉진하고 혈관 투과성을 증가시켜 염증 과정에서 중요한 역할을 한다. VEGF의 발현은 NFκB를 포함하는 염증 전달계의 다수의 주요 사이토카인과 연결되어 있다. 망막 혈관신생의 발달에서 VEGF의 중요성은 잘 확립되어 있다[29]. 노마코판-유형 단백질은 LTB4에 결합하여 LTB4의 작용을 억제할 수 있으며, 이는 M2 대식세포에 의한 VEGF 발현 수준을 감소시키는 것으로 제안된다. 이는 실시예 4 및 도 7a의 EAU 마우스 모델에서 입증되었으며, 이는 노마코판 유형 단백질이 망막 조직에서 VEGF 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 결과적으로 VEGF 수준의 감소는 새로운 혈관 생성을 방지한다. 따라서, 노마코판 유형 단백질은 자가면역 포도막염 또는 감염성 포도막염의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 자가면역 포도막염을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 자가면역 포도막염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 감염성 포도막염을 예방 또는 치료하는 방법으로서 대상체에서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 감염성 포도막염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

특정 실시양태에서, 자가면역 포도막염은 전방, 중간, 후방 또는 확산성 포도막염일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 전방 포도막염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한 대상체에서 전방 포도막염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조성물이 제공된다.

자가면역 포도막염이 발병할 위험이 있는 대상체는 자가면역 포도막염을 예방하기 위해 본 명세서에 언급된 제제의 투여로부터 이익을 얻을 수 있다. 포도막염의 위험 인자에는 흡연이 포함된다. 자가면역 포도막염의 치료 또는 예방의 관점에서 흡연자 또는 흡연자였던 대상체가 적합하다. 일부 실시양태에서 대상체는 이러한 위험 인자 중 하나 이상을 가질 수 있지만 어떠한 임상 증상도 나타내지 않을 수 있다.

치료될 대상체는 20 내지 50세의 연령일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 65세 초과이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 18세 이상이다. 다른 실시양태에서, 18세 미만의 대상체.

연령 관련 황반 변성

연령 관련 황반 변성 (AMD)은 진행성 비가역성의 중증 중심 시력 상실을 유발하는 퇴행성 망막 안구 질병이다. 이 질병은 시력이 가장 높은 부위인 황반을 손상시키며 60세 이상 미국인의 실명의 주요 원인 중 하나이다.

AMD에는 습성 및 건성 AMD의 두 가지 유형이 있다. 습성 AMD (혈관신생성 AMD라고도 함)는 급속하게 악화되는 시력 및 중증 손상과 관련된다. 습성 AMD에서는 시각 기능이 심하게 손상되고, 결국 염증과 흉터가 발병 망막에서 영구적인 시각 기능 상실을 유발한다. 습성 MD에는 '통상적인 경우' 및 '희귀한 경우'의 두 가지 하위유형이 있다. 통상적인 하위 유형에서는 혈관 조영술을 사용하여 안과 의사가 새로운 혈관을 뚜렷하게 볼 수 있으며, 희귀한 하위유형에서는 누출 혈관이 잘 보이지 않는다. 환자는 희귀한 CNV 및 통상적인 CNV 둘 모두가 조합하여 나타날 수 있다[30].

습성 AMD는 특히 다양한 자극에 대한 반응으로 신경망막 내부 및 하부의 비정상적인 혈관신생 형성을 특징으로 한다. 이러한 비정상적인 혈관 성장은 종종 출혈을 일으키는 누출 혈관의 형성으로 이어진다. 비정상적인 혈관 성장은 VEGF에 의해 활성화된다. 노마코판 유형 단백질은 VEGF를 활성화시키는 것으로 공지된 LTB4에 결합하여 이를 억제할 수 있다. 따라서 노마코판 유형 단백질은 습성 AMD 치료에 특히 효과적일 수 있다.

건성 AMD (위축성 AMD라고도 함)는 사례의 약 80%를 차지하며 일반적으로 서서히 진행되어 종종 양쪽 안구에 동시에 발병한다. 이는 일반적으로 경미한 시력 상실만을 유발한다. 건성 AMD는 망막 뒤에 지방이 침착되어 황반이 가늘어지고 건조해지는 것이 특징이다.

AMD는 STARS 설문지를 사용하여 자가 평가할 수 있다[31]. AMD는 55세 초과의 사람에서 중심와로부터 2개의 유두 직경 내에서 평가된 안저 병변을 기반으로 분류될 수 있다. 관찰 가능한 결정체 또는 색소 이상이 없는 대상체는 AMD의 징후가 없는 것으로 고려해야 한다. 소형 결정체 (63 μm 미만)을 가진 사람은 drupelets라고도 하며 임상적으로 관련이 있는 후기 AMD 발병 위험 증가 없이 정상적인 노화 변화가 이루어지는 것으로 고려되어야 한다. 중간 정도의 결정체 (63 이상 125 μm 이하)을 가지고 있지만 AMD와 관련된다고 생각되는 색소 이상이 없는 사람은 초기 AMD를 가진 것으로 고려해야 한다. 대형 결정체가 있거나 적어도 중간 정도의 결정체와 관련된 색소 이상이 있는 사람은 중등도 AMD를 갖는 것으로 고려해야 한다. 혈관신생성 AMD 또는 지도모양 위축과 관련된 병변이 있는 사람은 말기 AMD로 고려해야 한다[32].

증가된 국소 및 전신 보체 활성화가 AMD에서 관찰되었다. 다수의 보체 유전자의 다형성은 AMD의 위험을 증가시킨다[33]. 노마코판은 보체 활성화인자 C5를 억제하는 것으로 공지되어 있다. 따라서 C5에 결합하는 노마코판 유형 단백질은 보체 경로의 활성화를 억제하여 AMD를 치료하는데 효과적일 수 있다.

LTB4 수용체는 습성 유형의 AMD에 대한 마우스 모델에서 레이저 유도 맥락막 혈관신생을 촉진하는 것으로 나타났으며 VEGF mRNA의 발현은 망막 허혈의 다수의 동물 모델에서 혈관신생과 공간적 및 시간적으로 상관관계가 있었다[34,35]. 이전에 논의된 바와 같이, 노마코판 유형 단백질은 LTB4를 억제할 수 있다. 이는 새로운 혈관의 생성을 방지하는 VEGF 수준의 감소를 야기할 수 있다. 따라서 노마코판 유형 단백질은 AMD의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 습성 연령 관련 황반 변성을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 습성 연령 관련 황반 변성의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다. 습성 연령 관련 황반 변성은 희귀한 경우, 통상적인 경우 또는 이의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명은 대상체에서 건성 연령 관련 황반 변성을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 건성 연령 관련 황반 변성의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 치료될 대상체는 60세 이상이다.

AMD가 발병할 위험이 있는 대상체는 AMD를 예방하기 위해 본 명세서에 언급된 제제의 투여로부터 이익을 얻을 수 있다. AMD의 위험 인자에는 흡연, 햇빛, 인공 지방 (예를 들어, 부분 수소화 식물성 오일), 가공되고 포장된 식품이 많고 신선한 채소가 적은 식단, 조절되지 않는 고혈압 및 고콜레스테롤, 당뇨병, 노령 (60세 이상의 환자는 더 어린 환자보다 위험이 더 큼) 및 비만이 포함된다.

AMD의 치료 또는 예방의 관점에서, 이들 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 대상체가 적합하다. 일부 실시양태에서 대상체는 이러한 위험 인자 중 하나 이상을 가질 수 있지만 임상 증상을 나타내지 않을 수 있다.

당뇨병성 망막병증

당뇨병은 거의 모든 조직의 미세혈관 구조에 심각한 영향을 미친다. 당뇨병성 망막병증은 미세동맥류, 경성 삼출물, 출혈 및 정맥 이상을 특징으로 한다. 고혈당은 미세혈관 망막 변화를 유발하여 시야가 흐려지고, 어두운 반점 또는 섬광이 발생하고, 갑작스러운 시력 상실이 발생한다[36].

당뇨병성 망막병증에는 배경 망막병증, 당뇨병성 황반병증 및 증식성 망막병증의 3가지 유형이 있다. 단순 망막병증이라고도 하는 배경 망막병증은 혈관 벽에 작은 부종이 발생한다. 수포로 알려진 이것은 망막에 작은 점으로 나타나며 일반적으로 삼출물 (혈액 단백질)의 노란색 부분이 수반된다. 당뇨병성 황반병증은 황반이 어떤 형태로든 손상을 입은 경우이다. 황반 손상의 이러한 원인 중 하나는 당뇨병성 황반 부종으로 인해 황반 근처의 혈관에서 황반으로 체액 또는 단백질이 누출되는 것이다. 증식성 망막병증은 당뇨병성 망막병증의 진행 단계로 망막이 폐쇄되어 비정상적인 혈관이 성장하는 것이다. 그런 다음 이는 안구내로 출혈이 발생하여 망막이 분리되어 시력이 심각하게 손상될 수 있다. 치료하지 않고 방치하면 실명할 수 있다[36].

VEGF는 당뇨병성 망막병증의 발병에 중요한 인자이다. 노마코판 유형 단백질은 LTB4에 결합하여 이를 억제하여 VEGF 수준을 감소시킬 수 있다. 따라서, 노마코판 유형 단백질은 당뇨병성 망막병증의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 당뇨병성 망막병증을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 당뇨병성 망막병증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다. 당뇨병성 망막병증은 배경 망막병증, 당뇨병성 황반병증 또는 증식성 망막병증일 수 있다.

치료가 필요한 대상체는 1형 또는 2형 당뇨병을 가질 수 있다. 대상체가 당뇨병을 오래 앓을수록 그리고 혈당 수준이 제대로 조절되지 않으면 당뇨병성 망막병증이 발병할 확률이 높아진다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 5, 10, 20, 30 또는 40년 동안 당뇨병을 앓고 있다.

다른 위험 인자에는 고혈압, 고콜레스테롤, 임신, 담배 사용 및 아프리카계 미국인, 히스패닉계 또는 아메리카 원주민이 포함된다.

당뇨병성 망막병증이 발병할 위험이 있는 대상체는 당뇨병성 망막병증을 예방하기 위해 본 명세서에 언급된 제제의 투여로부터 이익을 얻을 수 있다. 당뇨병성 망막병증의 치료 또는 예방의 관점에서 이러한 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 대상체가 적합하다. 일부 실시양태에서 대상체는 이러한 위험 인자 중 하나 이상을 가질 수 있지만 임상 증상을 나타내지 않을 수 있다.

시신경병증

시신경병증은 시신경 손상 후에 발생한다. 시신경병증의 통상적인 임상 징후는 시야 결손, 색각이상, 및 비정상적인 유두 반응이다. 주요 증상은 시력 상실이며, 발병 안구에서 색상이 미묘하게 씻겨 나타난다. 많은 경우에 한쪽 안구에만 발병하며 의사가 건강한 안구를 가리도록 요청할 때까지 환자는 색각 상실을 인식하지 못할 수 있다.

시신경병증의 급속한 발병은 시신경염, 허혈성 시신경병증, 염증성 (비탈수초화) 및 외상성 시신경병증의 특징이다. 압축 독성/영양 시신경병증에서 증상의 점진적인 진행이 관찰된다.

다음을 포함하는 다수의 유형의 시신경병증이 있다:

(a) 허혈성 시신경병증은 시신경으로의 혈류가 충분하지 않다. 여기에는 시신경 앞부분에 발병하고 시신경 유두의 부종을 유발하는 전방 허혈성 시신경병증 및 유두 부종을 수반하지 않는 후방 허혈성 시신경병증이 포함된다;

(b) 시신경염은 시신경의 염증이며 시신경을 덮고 있는 수초의 부종 및 파괴와 관련된다. 시신경염은 단일 격리 시신경염, 재발성 격리 시신경염, 만성 재발 염증성 시신경병증, 시신경척수염 스펙트럼 장애, 다발성 경화증 관련 시신경염 및 분류된 시신경염 형태로 분류될 수 있다. 시신경염은 또한 녹내장과 관련될 수 있다;

(c) 안와 및 덜 일반적으로 시신경관 내 병변을 유발하는 종양, 감염 및 염증 과정으로 인해 발생하는 압박성 시신경병증. 병변은 시신경을 압박하여 시신경 유두 부종과 진행성 시력 상실을 야기한다. 관련된 안와 장애에는 시신경교종, 수막종, 혈관종, 림프관종, 유피 낭종, 암종, 림프종, 다발성 골수종, 염증성 안와 가종양 및 갑상선 안병증이 포함된다;

(d) 종양, 염증 및 감염을 포함하는 다양한 과정에 의해 시신경이 침윤되는 침윤성 시신경병증. 시신경을 침윤하는 가장 흔한 염증성 장애는 유육종증이다. 기회 감염성 진균, 바이러스 및 박테리아도 시신경을 침윤할 수 있다. 침윤이 신경의 근위 부분에서 발생하면 시신경이 상승할 수 있다. 검사 시 신경의 모양은 발병 신경 부분에 따라 다르다;

(e) 직접 또는 간접적인 손상에 노출될 때 시신경이 손상되는 외상성 시신경병증. 낙상도 흔한 원인이며 시신경병증은 다기관 외상 및 중증 뇌 손상과 관련된 의식 상실이 있을 때 가장 흔하게 발생한다;

(f) 미토콘드리아 시신경병증. 미토콘드리아는 높은 에너지 의존도로 인해 망막 신경절 세포의 수명 주기를 유지하는데 중심적인 역할을 한다. 미토콘드리아 DNA의 유전자 돌연변이, 비타민 고갈, 알코올 및 담배 남용, 특정 약물의 사용은 미토콘드리아의 효율적인 수송에 장애를 일으킬 수 있으며, 이는 1차 또는 2차 시신경병증을 유발할 수 있다;

(g) 환자의 식단에서 영양 부족으로 인해 발생하는 영양 시신경병증. 영양 결핍은 전신에 영향을 미치므로 팔과 다리의 통증이나 감각 상실 (말초 신경병증)은 영양 시신경병증이 있는 환자에서 흔히 볼 수 있다;

(h) 독성 시신경병증. 가장 흔한 원인은 메탄올 중독이다;

(i) 일반적으로 대칭 양측 중심 시력 상실로 나타나는 유전성 시신경병증. 가능한 유전성 시신경병증에는 Leber의 유전성 시신경병증, 우성 시신경 위축, Behr 증후군 및 Berk-Tabatznik 증후군이 포함된다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 시신경병증 병태를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 시신경병증 병태의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

일부 실시양태에서, 시신경병증 병태는 시신경이 손상된 임의의 병태를 포함한다. 시신경병증 병태는 시신경염, 허혈성 시신경병증, 압박성 시신경병증, 침윤성 시신경병증, 외상성 시신경병증, 미토콘드리아 시신경병증, 영양 시신경병증, 독성 시신경병증 및 유전성 시신경병증으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서 시신경병증 병태는 녹내장 관련 시신경염이다.

망막 정맥 폐쇄

망막 정맥 폐쇄는 망막의 혈관 장애이다. 이는 당뇨병성 망막병증에 이어 두 번째로 흔한 실명의 원인이며 60세 이상의 환자에서 주로 발생한다. 망막 정맥 폐쇄에는 세 가지 유형이 있다. 첫 번째는 4개의 망막 정맥 중 하나의 폐쇄로 인한 망막 분지 정맥 폐쇄이다. 두 번째는 주 망막 정맥 폐쇄로 인해 발생하는 중심 망막정맥폐쇄이고, 세 번째는 망막정맥의 말단 분지에서 폐쇄가 발생하는 망막 분지 정맥폐쇄이다. 중심 망막 정맥 폐쇄는 일반적으로 더 중증의 시력 상실을 야기한다. 망막정맥폐쇄는 망막모세혈관허혈의 양에 따라 다시 비허혈형과 허혈형으로 세분될 수 있다[37].

망막 정맥 폐쇄는 광간섭 단층촬영을 사용하여 진단될 수 있다. 여기에는 5 미크론의 해상도의 스캐닝 검안경을 사용하여 망막의 고화질 이미지를 촬영하는 단계가 포함된다. 이 이미지는 망막의 두께를 측정하여 부종과 수종의 존재를 결정할 수 있다. 검안경 검사와 형광 혈관 조영술은 또한 망막과 망막 혈관을 각각 검사하여 망막 정맥 폐쇄를 진단하는데 사용할 수 있다.

망막 정맥 폐쇄의 두 가지 주요 합병증은 홍채와 망막 혈관신생을 유발하는 망막 허혈 및 황반 부종이다. 신정맥이 폐쇄된 후 모세혈관에 압력이 상승하여 출혈과 체액 및 혈액 누출이 발생한다. 그 후 혈관신생, 즉 새로운 비정상적인 혈관 성장이 발생하여 혈관신생 녹내장, 유리체 출혈 및 후기 또는 중증의 경우 망막 박리가 발생할 수 있다[37]. VEGF는 허혈이 발생하는 것처럼 망막 정맥 폐쇄 발병에 주도적인 역할을 하며 VEGF가 분비되어 추가 혈관 누출 및 망막 부종이 발생한다[38].

노마코판 유형 단백질은 LTB4에 결합하여 이를 억제할 수 있으며, 이는 VEGF 수준의 감소를 야기할 수 있다. 따라서, 노마코판 유형 단백질은 당뇨병성 망막병증의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 망막 정맥 폐쇄를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 망막 정맥 폐쇄의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다. 망막 정맥 폐쇄는 망막 분지 정맥 폐쇄, 중심 망막 정맥 폐쇄 또는 반중심 망막 정맥 폐쇄일 수 있다.

일부 실시양태에서, 대상체는 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상 또는 80세 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 65세 이상이다.

미숙아 망막병증

미숙아 망막병증 (ROP)은 결국 견인 망막 박리를 야기할 수 있는 망막 혈관신생을 특징으로 하는 소아 실명의 주요 원인 중 하나이다. ROP는 조산아의 약 20%에서 발병한다. 이는 임신 32주 이전에 태어나거나 출생 시 중량이 1500 g 미만인 아기에게 주로 발생한다.

ROP는 외적인 증상이 없기 때문에 임신 32주 이전에 태어나거나 중량이 1.5 kg 미만인 모든 미숙아는 매주 또는 2주 단위로 안과 의사의 검진을 받는다. ROP의 정도와 중증도는 ROP 규정의 국제 분류에 따라 통상적으로 위치 (영역, I 내지 III), 중증도 (단계, 1 내지 5), 정도 (클럭아워 (clockhour), 1 내지 12), 혈관 확장 및 비틀림 (플러스 질병)으로 기재된다[39].

혈관은 일반적으로 임신 16 내지 36주 사이에 발생하며 VEGF는 태아의 혈관신생에 중요한 역할을 한다. 정상적인 발생 동안 VEGF는 망막 조직의 더 높은 산소 요구량에 대한 반응으로 방출되며, 이는 혈관의 발생으로 이어진다. 그러나 미숙아의 경우 VEGF의 수준이 상승하여 비정상적인 혈관 증식을 유발한다[40].

따라서, 본 발명은 대상체에서 미숙아 망막병증을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 미숙아 망막병증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

일부 실시양태에서, 대상체는 재태 기간 27주 이전에 출생하거나 재태 기간 27주 내지 32주에 출생하거나 재태 기간 32주 초과에 출생하지만 출생 중량이 1501 g 미만인 미숙아이다.

전증식성 망막 질병

대상체는 증식성 망막 질병을 갖고 있거나, 가질 것으로 예측되거나, 발병할 위험이 있을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 전증식성 망막병증을 가질 수 있다. 전증식성 망막병증은 모세혈관 폐쇄로 인한 만성 망막 허혈의 발생을 나타낸다. 전증식성 망막병증의 임상 징후에는 다발성 면화반 (cotton wool spot), 염주 정맥 및/또는 고리, 다발성 깊은 원형 및 반점 출혈, 망막내 미세혈관 이상을 포함한다.

앞서 언급한 바와 같이, 증식성 망막 질병은 VEGF에 의해 활성화되는 혈관신생을 특징으로 한다. VEGF는 혈관 투과성과 혈관신생을 촉진하여 증식성 망막 질병에서 비정상적인 혈관 생성을 유발할 수 있다. 노마코판-유형 단백질은 LTB4에 결합하여 이를 억제할 수 있으며, 이는 VEGF의 수준을 감소시킬 수 있다. 이는 예를 들어 실시예 4에 제시된다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 전증식성 망막 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 전증식성 망막 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

스타가르트병

스타가르트병은 망막 수송체 단백질을 인코딩하는 ABCA4 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 유전성 황반 이영양증이다. 이는 소아의 황반 변성의 가장 흔한 형태로서 미국에서 개인 100,000명당 대략 10 내지 12.5명의 유병률이 추정된다. 스타가르트병 환자는 생후 10 내지 20년 이내에 중증의 시력 상실이 발생하며 거의 모든 경우에 비가역적 시력 감소로 진행된다[41].

병리는 맥락막 혈관신생을 포함할 수 있으며, 이 경우 유리체내 항-VEGF 주사가 수행된다[42]. 본 발명자들은 노마코판 유형 단백질이 증식성 망막 질병에서 VEGF 수준을 감소시킬 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 스타가르트병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 스타가르트병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다.

결절성 맥락막 혈관병증

결절성 맥락막 혈관병증 (PCV)은 맥락막 혈관계의 질병이다. 이는 많은 인종의 남성과 여성 모두에게 존재하고, 색소 상피의 장액성 박리와 삼출성 변화를 특징으로 하며 이는 일반적으로 망막하 섬유증을 유발할 수 있다. PCV 증상이 있는 환자는 광역학 요법과 항-VEGF 치료를 통해 중증의 시력 상실 없이 완전한 퇴행을 나타낼 수 있음이 입증되었다[43]. 본 발명자들은 노마코판 유형 단백질이 증식성 망막 질병에서 VEGF 수준을 감소시킬 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 결절성 맥락막 혈관병증 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 결절성 맥락막 혈관병증 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 광역학 요법과 조합하여 투여된다.

투여 결과

대상체는 치료의 결과로, 증상의 발생 감소, 증상의 완화, 증상의 발생 또는 재발의 억제 또는 지연 또는 이의 조합을 나타낼 수 있다. 바람직하게는 치료는 통상적인 질병 병태 증상의 감소를 야기한다. 예를 들어, 시력은 증식성 망막 질병 치료에 대한 다수의 임상 연구에서 종료점으로 사용된다. 따라서, 본 발명에 따른 치료는 시력의 향상을 야기할 수 있다.

치료의 결과로, 대상체는 예를 들어, 특정 질병 중 하나와 관련하여 위에서 언급한 방법 중 하나를 사용하여 그의 임상 점수의 향상을 나타낼 수 있다.

또한, 치료의 결과로서 대상체는 감소된 혈관신생 또는 감소된 혈관 증식 (예를 들어, 안구내)을 나타낼 수 있다. 다른 결과에는 시력 향상, 시력 상실 감소, 시력 회복 증가, 중심 망막 두께 감소 및/또는 당뇨병성 망막병증 중증도 점수 향상이 포함될 수 있다. 또한, 치료는 유리체 출혈의 감소, 홍채 또는 각도의 혈관신생, 혈관신생 녹내장 및/또는 망막 박리를 야기할 수 있다. 활성 제제 투여 후 관찰되는 감소는 건강한 개체, 관련 증식성 망막 질병의 더 중증의 형태를 갖는 개체에서 측정되거나 활성 제제로 치료하기 전에 환자에서 관찰될 수 있다.

치료는 망막 염증의 감소, Th17 세포 수의 감소, RORgt/Tbet를 발현하는 CD4+ 세포 수의 감소 (예를 들어, 포도막염내)를 야기할 수 있다.

치료는 또한 요구되는 제2 질병 치료에 의한 치료의 양, 지속기간 또는 빈도의 감소를 야기할 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가 실시양태에서, 망막 증식 질병이 있는 대상체에서 시력 향상, 임상 점수 향상, 혈관신생 또는 혈관 증식 감소 (예를 들어, 안구내), 시력 상실 감소, 시력 회복 증가, 중심 망막 두께 감소 및/또는 당뇨병성 망막병증 중증도 점수 향상, 유리체 출혈 감소, 홍채 또는 각도의 혈관신생 감소, 혈관신생 녹내장 및/또는 망막 박리 감소, 염증 감소, Th17 세포 수 감소, 및/또는 RORgt/Tbet 발현 CD4+ 세포 수 감소 (예를 들어, 포도막염내) 방법이 제공되며, 상기 방법은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량, 또는 상기 제제를 인코딩하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 이는 단독으로 또는 제2 망막 증식성 질병 치료와 조합하여 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 망막 증식성 질병을 갖는 대상체에서 시력 향상, 임상 점수 향상, 혈관신생 또는 혈관 증식 감소 (예를 들어, 안구내), 시력 상실 감소, 시력 회복 증가, 중심 망막 두께 감소 및/또는 당뇨병성 망막병증 중증도 점수 향상, 유리체 출혈 감소, 홍채 또는 각도의 혈관신생 감소, 혈관신생 녹내장 및/또는 망막 박리 감소, 염증 감소, Th17 세포 수 감소, 및/또는 RORgt/Tbet 발현 CD4+ 세포 수 감소 (예를 들어, 포도막염내) 방법에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제, 상기 제제를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 대상체에서 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량, 또는 상기 제제를 인코딩하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제제는 예를 들어 망막 조직에서 VEGF 수준의 감소를 야기하고/거나 상기 제제는 예를 들어 망막 조직에서 VEGF 신호전달의 감소를 야기한다.

본 발명은 또한 대상체의 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제, 또는 상기 제제를 인코딩하는 핵산 분자를 제공하고, 상기 제제는 예를 들어 망막 조직에서 VEGF 수준의 감소를 야기하고/거나 상기 제제는 예를 들어 망막 조직에서 VEGF 신호전달의 감소를 야기한다.

본 발명의 제제는 상기 논의된 바와 같이 다른 망막 증식 질병 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 제제와 다른 (본 명세서에서 "제2"로 지칭됨) 망막 증식 질병 치료제의 조합은 제2 제제의 양이 본 발명의 제제에 의한 치료 없이 사용되는 양과 비교하여 감소되도록 하거나, 제2 제제의 치료 지속기간이 본 발명의 제제에 의한 치료 없이 사용되는 치료의 지속기간과 비교하여 감소되도록 하거나 투여가 필요한 제2 제제의 빈도가 감소되도록 할 수 있다. 이는 특정 공지 치료의 부작용을 고려할 때 유리하다. 따라서, 제2 치료제의 양을 감소시키거나, 제2 치료제의 투여 빈도를 감소시키거나, 제2 치료제의 지속기간을 감소시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로 상기 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

제2 망막 증식 질병 치료제가 사용되는 경우, 바람직하게는 이는 항-염증 약제, 예를 들어, 스테로이드 예컨대 코르티코스테로이드, IMT 약물 예를 들어, 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 미코페놀레이트, BRM 약물 (예를 들어, 항-TNF알파 제제, 예를 들어 TNF알파와 결합하는 항체 또는 이의 단편, 예컨대 인플릭시맙 또는 아달리무맙), 항-VEGF 치료제 예컨대 항-TNF알파 항체 또는 이의 단편 (예컨대 베바시주맙 라니비주맙 (Lucentis) 항-VEGF 앱타머 (예컨대 페갑타닙 (Macugen)), 또는 또 다른 VEGF 길항제 예컨대 아플리버셉트 (Eylea, 인간 IgG1 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인으로부터의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결합 부분으로 이루어진 재조합 융합 단백질)로부터 선택된다.

노마코판 유형 단백질 및 제2 제제를 사용하는 경우, 이는 함께 또는 별도로 투여될 수 있다. 노마코판 유형 단백질이 먼저 투여되고 제2 망막 증식 질병 치료제가 두 번째로 투여될 수 있으며, 그 반대의 경우로도 이루어질 수 있다.

따라서, 예를 들어, 상기 기재된 방법에서 본 발명의 제제가 하나 이상의 다른 망막 증식 질병 치료제와 조합 사용되는 경우, 이는 (i) 제2 망막 증식 질병 치료제에 의한 망막 증식 질병을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제 또는 (ii) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제에 의해 망막 증식 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 제2 망막 증식 질병 치료제 또는 (iii) 망막 증식 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제 및 제2 망막 증식 질병 치료제로서 기재될 수 있다. (i) 내지 (iii) 각각에서, 상기 방법은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제를 투여하는 단계 및 제2 망막 증식 질병 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제는 국소 투여되고 제2 망막 증식 질병 치료제는 예를 들어, 국소적으로 또는 안구내로, 예를 들어 유리체내로 또는 맥락막상으로 직접, 바람직하게는 안구내로, 예를 들어 유리체내로 또는 맥락막상으로 직접 투여된다.

일부 실시양태에서 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제는 안구내로, 예를 들어 유리체내로 또는 맥락막상으로 직접 투여되고, 제2 망막 증식 질병 치료제는 국소적으로 또는 안구내로, 예를 들어 유리체내로 또는 맥락막상으로 직접 투여된다.

일부 실시양태에서 제2 망막 증식 질병 치료제는 또한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제이다.

치료가 제2 망막 증식성 질병 치료의 양 또는 기간의 감소를 야기하는 경우, 감소는 본 발명의 제제의 부재 하에 사용되는 제2 치료제의 양과 비교하여 최대한 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80%일 수 있다.

치료가 제2 망막 증식성 질병 치료에 의한 치료 빈도의 감소를 야기하는 경우, 이는 제2 망막 증식성 질병 치료제의 투여 사이의 시간을 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주까지 증가시킬 수 있다.

대상체

바람직한 대상체, 제제, 투여량 등은 본 명세서에 개시된 바와 같다.

임의의 감소 또는 증가에 대한 임의의 기준은 치료 부재 하에 상기 대상체와 비교되는 질병 매개변수의 감소 또는 증가이다. 바람직하게는, 매개변수는 정량화될 수 있고 이 경우 증가 또는 감소는 바람직하게는 통계적으로 유의하다. 예를 들어, 증가 또는 감소는 치료의 부재 (예를 들어, 상기 치료가 시작되기 전) 하의 매개변수와 비교하여 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50% 이상일 수 있다.

본 발명의 실시에서 제제가 투여되는 대상체는 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 제제가 투여되는 대상체는 망막 증식 질병의 위험이 있거나 망막 증식 질병이 있다.

본 발명의 방법은 또한 본 발명의 제제의 투여 전 및/또는 후에 (i) 대상체가 망막 증식 질병의 위험이 있는지를 결정하고, (ii) 보유될 수 있는 망막 증식 질병의 중증도를 결정하는 하나 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 사용되는 제제

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 제제는 노마코판 자체 또는 이의 기능적 균등물이다. 이하에서, "노마코판 유형 단백질"이라는 용어는 "도 2에 도시된 아미노산 서열 (서열번호 2)의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이의 기능적 균등물"의 약칭으로 사용된다.

노마코판은 진드기 오르니토도로스 모우바타의 침샘으로부터 단리되었다. 노마코판은 리포칼린 패밀리의 외부 구성원이며 보체 활성화를 억제하는 것으로 나타난 최초의 리포칼린 패밀리 구성원이다. 노마코판은 C5에 결합하고 C5 전환효소에 의한 C5a 및 C5b로의 절단을 방지하여 통상적, 대체 및 렉틴 보체 경로를 억제함으로써 활성 (예를 들어, 염증 유발성) 펩타이드인 C5a의 생성과 MAC의 형성을 모두 억제한다. 노마코판은 랫트, 마우스 및 인간 혈청에서 C5에 결합하고 C5 전환효소에 의한 절단을 방지하는 것으로 입증되었으며, IC50은 약 0.02 mg/ml이다.

따라서, 노마코판 유형 단백질은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168 또는 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 168을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 도 2에 제공된 단백질 서열의 처음 18개 아미노산은 C5 결합 또는 LTB4 결합 활성에 필요하지 않은 신호 서열을 형성하므로 이는 예를 들어 재조합 단백질 생성의 효율성을 위해 선택적으로 제거될 수 있다.

노마코판의 C5 결합 특성

노마코판 단백질은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 결정된 1 nM의 Kd로 C5에 결합하는 것으로 입증되었다[44]. 노마코판-유형 펩타이드 (예를 들어, 노마코판 단백질의 기능적 균등물)는 바람직하게는 간편하게는 360 nM 미만, 더 간편하게는 300 nM 미만, 가장 간편하게는 250 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 더 바람직하게는 150 nM 미만, 가장 바람직하게는 100 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 50, 40, 30, 20 또는 10 nM 미만, 유리하게는 5 nM 미만의 Kd로 C5에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 Kd는 바람직하게는 [44]에 기재된 방법에 따라 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정된다.

노마코판은 통상적 보체 경로, 대체 보체 경로 및 렉틴 보체 경로를 억제한다. 바람직하게는, 노마코판 유형 단백질은 C5의 전체적인 입체형태를 안정화하지만 3개의 활성화 경로의 C5 전환효소에 의해 표적화되는 C5 절단 부위를 직접 차단하지 않는 방식으로 C5에 결합한다. 노마코판이 C5에 결합하면 C5의 전체적인 입체형태가 안정화되지만 전환효소 절단 부위는 차단되지 않는다. 노마코판의 기능적 균등물 또한 바람직하게는 이러한 특성을 공유한다.

C5는 C5 전환효소에 의해 절단된다 (도 1). 이 절단의 산물에는 아나필라톡신 (anaphylatoxin) C5a와 C5b, C6, C7, C8 및 C9의 복합체 형성을 촉진하는 용해 복합체 C5b (막 공격 복합체 (MAC)라고도 함)가 포함된다. C5a는 호중구 및 호산구 화학주성, 호중구 활성화, 증가된 모세관 투과성 및 호중구 아폽토시스 억제를 포함하는 많은 병리적 염증 과정에 관여하는 고도의 염증 유발성 펩타이드이다[45].

C5에 결합하고 억제하는 단일클론 항체 및 소분자는 다양한 질병, 특히 PNH, 건선, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 및 이식 거부반응을 치료하기 위해 개발되었다[46]. 그러나 이러한 단일클론 항체 중 일부는 C5 다형성이 있는 대상체의 특정 C5 단백질에 결합하지 않으므로 이러한 대상체에서는 효과가 없다[47]. 바람직하게는, 노마코판-유형 단백질은 에쿨리주맙 (eculizumab)에 의한 치료를 비효과적으로 만들거나 에쿨리주맙에 의한 치료의 효능을 감소시키는 C5 다형성을 갖는 대상체로부터의 C5뿐만 아니라, 야생형 C5에 결합하고 이의 절단을 억제한다. "C5 다형성"이라는 용어는 삽입, 결실, 아미노산 치환, 프레임 시프트 (frame-shift), 절단에 의해 변경된 임의의 형태의 C5를 포함하며, 이들 중 임의의 것은 야생형 C5와 비교하여 이러한 변경 중 하나 또는 다수 또는 하나 이상의 조합일 수 있다. 인간 대상체에서 야생형 C5는 수탁 번호가 NP_001726.2; 버전 GI:38016947의 C5 단백질로 고려된다. C5 다형성의 예는 아미노산 위치 885에서의 다형성, 예를 들어 Arg885Cys (c.2653C>T에 의해 인코딩됨) p.Arg885His (c.2654G>A에 의해 인코딩됨) 및 Arg885Ser을 포함하며, 이는 mAb 에쿨리주맙의 효과를 감소시킨다[47].

C5 다형성, 예를 들어, 에쿨리주맙에 의한 치료를 비효과적으로 만들거나 에쿨리주맙에 의한 치료의 효능을 감소시키는 C5 다형성을 갖는 대상체로부터의 C5를 포함하는 C5에 결합하는 제제의 능력은 당업계에 공지된 표준 시험관내 분석, 예를 들어 표지된 C5에 의한 겔 상의 단백질 인큐베이션 후 표면 플라즈몬 공명 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 노마코판 유형 단백질은 C5, 야생형 및/또는 C5 다형성, 예를 들어, 에쿨리주맙에 의한 치료를 비효과적으로 만들거나 에쿨리주맙에 의한 치료의 효능을 감소시키는 C5 다형성을 갖는 대상체로부터의 C5에 결합하고, Kd는 360 nM 미만, 보다 간편하게는 300 nM 미만, 가장 간편하게는 250 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 150 nM 미만, 가장 바람직하게는 100 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 50, 40, 30, 20 또는 10 nM 미만, 유리하게는 5 nM 미만이며, 상기 Kd는 바람직하게는 [44]에 기재된 방법에 따라 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정된다.

이는 야생형 C5 및 C5 다형성, 예를 들어, 에쿨리주맙에 의한 치료를 비효과적으로 만들거나 에쿨리주맙에 의한 치료의 효능을 감소시키는 C5 다형성을 갖는 대상체로부터의 C5에 대해 더 높거나 더 낮거나 동일한 친화도를 나타낼 수 있다.

보체 활성화를 억제하는 노마코판-유형 단백질의 능력은 또한 혈청에서 보체 활성화를 억제하는 제제의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 혈청에서 보체 활성은 당업계에 공지되어 있거나 본 명세서에 기재된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다.

노마코판의 LTB4 결합 특성

노마코판 유형 단백질은 또한 에이코사노이드 활성을 억제하는 기능을 갖는 것으로 규정될 수 있다. 노마코판은 또한 LTB4에 결합하는 것으로 입증되었다. 노마코판 단백질의 기능적 균등물은 또한 노마코판 단백질과 유사한 친화도로 LTB4에 결합하는 능력을 보유할 수 있다.

LTB4에 결합하는 노마코판-유형 단백질의 능력은 당업계에 공지된 표준 시험관내 분석, 예를 들어, 등온 적정 열량계 또는 형광 적정에 의해 표지된 LTB4에 결합하기 위해 경쟁하는 노마코판 및 항-LTB4 항체 간의 경쟁적 ELISA의 수단에 의해 결정될 수 있다. 형광 적정을 사용하여 획득된 데이터는 노마코판이 200 내지 300 pM의 Kd로 LTB4에 결합함을 보여준다. 예를 들어, 인산 완충 식염수 (PBS) 중 LTB4 (Caymen Chemicals, Ann Arbor, MI, USA)에 대한 결합 활성은 분광형광계, 예를 들어 LS 50 B 분광형광계 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)에서 정량화할 수 있다. 이는 다음과 같이 수행될 수 있다:

2 mL PBS 중 노마코판의 정제된 100 nM 용액을 자기 교반기가 장착된 석영 큐벳 (경로 길이 10 mm; Hellma, Muhlheim, Germany)에 적용하였다. 온도를 20℃로 조정하고, 평형에 도달한 후, 단백질 Tyr/Trp 형광을 280 nm에서 여기시켰다 (슬릿 폭: 15 nm). 형광 방출을 최대 방출에 해당하는 340 nm (슬릿 폭: 16 nm)에서 측정하였다. PBS 중 30 μM LTB4의 리간드 용액을 최대 20 μL (전체 샘플 부피의 1%)까지 단계적으로 첨가하고 30초 인큐베이션 후 정상 상태 형광을 측정하였다. KD 값의 계산을 위해 데이터를 초기 형광 강도 100%로 정규화하고 내부 필터 효과를 3μM N-아세틸-트립토판아미드 용액의 적정을 사용하여 보정하였으며 데이터를 해당 리간드 농도에 대해 도식화하였다. 그런 다음, 이분자 복합체 형성에 대한 질량 작용 법칙에 기반한 비선형 최소 자승 회귀를 사용하여 공개된 형식 (문헌[Breustedt et al., 2006])을 사용하여 Origin 소프트웨어 형태 8.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA)의 데이터를 조정하였다[48].

노마코판은 1 nM 미만, 보다 간편하게는 0.9 nM 미만, 가장 간편하게는 0.8 nM 미만, 바람직하게는 0.7 nM 미만, 더욱 바람직하게는 0.6 nM 미만, 가장 바람직하게는 0.5 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 0.4 nM 미만, 유리하게는 0.3 nM 미만의 Kd로 LTB4에 결합할 수 있으며, 상기 Kd는 바람직하게는 상기 방법에 따라 형광 적정을 사용하여 결정된다. 노마코판 유형 단백질은 바람직하게는 이러한 특성을 공유한다.

C5 및 LTB4 모두에 결합하는 분자

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 노마코판 유형 단백질은 C5 및 LTB4 둘 모두 (예를 들어, 야생형 C5 및 에쿨리주맙에 의한 치료를 비효과적으로 만들거나 에쿨리주맙 치료에 대한 효능을 감소시키는 C5 다형성을 갖는 대상체로부터의 C5 및 LTB4 둘 모두)에 결합할 수 있다.

따라서, 노마코판 유형 단백질은 C5 전환효소에 의한 보체 C5의 보체 C5a 및 보체 C5b로의 절단을 방지하고, 또한 LTB4 활성을 억제하는 작용을 할 수 있다. C5와 LTB4 모두에 결합하는 제제를 사용하는 것이 유리할 수 있다. C5와 에이코사노이드 경로는 모두 증식성 망막 질병에서 관찰된 병리에 관여할 수 있다. 따라서, 증식성 망막 질병에 관여하는 다중 경로를 억제하는 단일 제제를 사용함으로써 단일 경로만을 억제하는 제제를 사용하는 것에 비해 향상된 효과를 달성할 수 있다. 또한 단일 분자 투여와 관련된 실질적인 이점이 있다.

LTB4에 결합하지만 C5에 결합하지 않거나 감소된 결합을 나타내는 분자

C5에 결합하지 않거나 감소된 결합을 나타내지만 LTB-4-결합 활성을 보유하는 노마코판 유형 단백질은 예를 들어 WO2018/193121에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다. C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 이러한 노마코판-유형 단백질은 본 발명의 모든 양상에서 사용될 수 있다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 이러한 노마코판-유형 단백질은 하기 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:

서열번호 22 (WO2018/193121의 서열번호 5)는 변형된 노마코판의 아미노산 서열이며, 서열번호 4는 Met114에서 Gln으로, Met116에서 Gln으로, Leu117에서 Ser으로, Asp118에서 Asn으로, Ala119에서 Gly으로, Gly120에서 Ser으로, Gly121에서 Ala으로, Leu122에서 Asp으로, Glu123에서 Asp으로 및 Val124에서 Lys으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 1)

서열번호 23 (WO2018/193121의 서열번호 6)은 변형된 노마코판의 아미노산 서열이며, 서열번호 4는 Ala44에서 Asn으로, Met116에서 Gln으로, Leu117에서 Ser으로, Gly121에서 Ala으로, Leu122에서 Asp으로, Glu123에서 Ala으로 및 Asp149에서 Gly으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 2)

서열번호 24 (WO2018/193121의 서열번호 7)는 변형된 노마코판의 아미노산 서열이며, 서열번호 4는 Ala44에서 Asn으로, Met116에서 Gln으로, Leu122에서 Asp으로 및 Asp149에서 Gly으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 3)

서열번호 25 (WO2018/193121의 서열번호 8)는 변형된 노마코판의 아미노산 서열이며 서열번호 4는 Ala44에서 Asn으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 4).

변형되지 않은 노마코판 폴리펩타이드와 비교하여 C5에 결합하는 능력이 감소된 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 일부 바람직한 실시양태에서 C5에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않을 수 있다.

C5 결합은 예를 들어 서열번호 4의 비변형 노마코판 폴리펩타이드가 나타내는 결합에 비해 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 50, 100배 감소되거나 제거될 수 있다.

일부 실시양태에서 C5 결합은 서열번호 4의 변형되지 않은 노마코판 폴리펩타이드에 비해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소된다.

이러한 폴리펩타이드는 예를 들어 [49]에 기재된 방법에 따라 또는 WO2018193121의 실시예 2에 기재된 바와 같이 표면 플라즈마 공명에 의해 결정된 바와 같이 1 마이크로몰 초과의 KD로 C5에 결합하고/거나 [50]에서 수행된 것에 따르거나 이와 유사하게 수행된 CH50 용해 분석을 사용하여 전체 풀링된 정상 혈청에서 0.02 mg/mL의 농도에서 존재하는 경우 양 적혈구 세포 용해를 10% 미만으로 억제할 수 있다. C5에 결합하는 이러한 폴리펩타이드의 능력은 또한 혈청에서 보체 활성화를 억제하는 제제의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다.

특정 바람직한 실시양태에서 변이체 2가 사용된다.

이들 분자는 LTB4에 결합하는 분자의 능력을 공유하지만 C5에 결합하지 않거나 C5에 대한 결합이 감소된 노마코판의 기능적 변이체인 분자의 예이다.

따라서 노마코판의 기능적 균등물은 (i) C5에 결합하고 C5 전환효소에 의한 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 방지하는 능력을 보유하고/거나 (ii) LTB4에 결합하는 능력을 보유하는 노마코틴의 상동체 또는 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서 기능적 균등물은 특성 (i) 및 (ii)를 갖는다. 다른 실시양태에서 기능적 균등물은 특성 (ii)을 갖지만 C5에 대한 결합이 감소되거나 부재한다 (예를 들어, 노마컴판 (Nomacompan) 변이체 1 내지 4 중 하나).

일부 실시양태에서, 본 발명의 제제는 조혈성 절지동물로부터 유래된다. "조혈성 절지동물"이라는 용어는 곤충, 진드기, 이, 벼룩 및 응애와 같은 적절한 숙주로부터 혈액을 흡혈하는 모든 절지동물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 제제는 진드기, 바람직하게는 진드기 오르니토도로스 모우바타로부터 유래된다.

상동체는 예를 들어, 리피세팔루스 아펜디쿨라투스 (Rhipicephalus appendiculatus), R. 산구이네우스 (R. sanguineus), R. 부르사 (R. bursa), A. 아메리카눔 (A. americanum), A. 카젠넨세 (A. cajennense), A. 헤브라에움 (A. hebraeum), 부필루스 미크로플루스 (Boophilus microplus), B. 안눌라투스 (B. annulatus), B. 데콜로라투스 (B. decoloratus), 데르마센토르 레티쿨라투스 (Dermacentor reticulatus), D. 안데르소니 (D. andersoni), D. 마르기나투스 (D. marginatus), D. 바리아빌리스 (D. variabilis), 하에마피살리스 이네르미스 (Haemaphysalis inermis), Ha. 레아키 (Ha. leachii), Ha. 푼크타타 (Ha. punctata), 히알로마 아나톨리쿰 아나톨리쿰 (Hyalomma anatolicum anatolicum), Hy. 드로메다리 (Hy. dromedarii), Hy. 마르기나툼 마르기나툼 (Hy. marginatum marginatum), 익소데스 리시누스 (Ixodes ricinus), I. 페르술카투스 (I. persulcatus), I. 스카풀라리스 (I. scapularis), I. 헥사고누스 (I. hexagonus), 아르가스 페르시쿠스 (Argas persicus), A. 레플렉수스 (A. reflexus), 오르니토도로스 에라티쿠스 (Ornithodoros erraticus), O. 모우바타 (moubata moubata), O. m. 포르시누스 (O. m. porcinus), 및 O. 사비그나이 (O. savignyi)를 포함하는 다른 진드기 종으로부터의 노마코판 단백질 서열을 포함하여, 도 2에 명시적으로 확인되는 노마코판 서열의 파라로그 (paralogue) 및 오르소로그 (orthologue)를 포함한다.

용어 "상동체"는 또한 쿨렉스 (Culex), 아노펠레스 (Anopheles) 및 아에데스 (Aedes) 속, 특히 쿨렉스 퀸퀘파스키아투스 (Culex quinquefasciatus), 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) 및 아노펠레스 감비아에 (Anopheles gambiae)를 포함하는 모기 종; 벼룩 종, 예컨대 크테노세팔리데스 펠리스 (Ctenocephalides felis) (고양이 벼룩); 말 파리; 모래 파리; 흑파리; 체체 파리; 이; 진드기; 거머리; 및 편형동물로부터의 균등한 노마코판 단백질 서열을 포함하는 것을 의미한다. 천연 노마코판 단백질은 O. 모우바타에 약 18 kDa의 다른 세 가지 형태로 존재하는 것으로 생각되며 "상동체"라는 용어는 이러한 대체 형태의 노마코판을 포함하는 것을 의미한다.

도 2에 제공된 노마코판 서열의 상동체의 확인 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 상동체는 공개 및 비공개 서열 데이터베이스의 상동성 검색에 의해 확인될 수 있다. 간편하게는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용할 수 있지만 특히 공개 데이터베이스에 표시되지 않은 데이터가 포함된 경우 개인 또는 상업적으로 사용 가능한 데이터베이스가 동등하게 유용하다. 1차 데이터베이스는 1차 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 데이터 기탁의 사이트이며 공개적으로 또는 상업적으로 이용 가능하다. 공개적으로 사용 가능한 기본 데이터베이스의 예로는 GenBank 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EMBL 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/), DDBJ 데이터베이스 (http://www.ddbj.nig.ac.jp/), SWISS-PROT 단백질 데이터베이스 (http://expasy.hcuge.ch/), PIR (http://pir.georgetown.edu/), TrEMBL (http://www.ebi.ac.uk/), TIGR 데이터베이스 (see http://www.tigr.org/tdb/index.html), NRL-3D 데이터베이스 (http://www.nbrfa.georgetown.edu), Protein Data Base (http://www.rcsb.org/pdb),　　NRDB　데이터베이스 (ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README), 　OWL　데이터베이스　(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/) 및　 2차 데이터베이스　PROSITE　(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html), PRINTS　(http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html), Profiles　(http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html), Pfam　(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam), Identify (http://dna.stanford.edu/identify/) 및 Blocks (http://www.blocks.fhcrc.org) 데이터베이스가 포함된다. 상업적으로 이용 가능한 데이터베이스 또는 개인 데이터베이스의 예로는 PathoGenome (Genome Therapeutics Inc.) 및 PathoSeq (이전 Incyte Pharmaceuticals Inc.)가 포함된다.

통상적으로, 2개의 폴리펩타이드 사이의 30% 초과의 동일성 (바람직하게는 활성 부위와 같은 특정 영역에 걸쳐)은 기능적 균등성의 표시로 고려되고 따라서 2개의 단백질이 상동성이라는 표시로 고려된다. 바람직하게는, 상동체인 단백질은 도 2 (서열번호 2)에서 확인된 노마코판 단백질 서열과 60% 초과의 서열 동일성 정도를 갖는다. 보다 바람직한 상동체는 도 2 (서열번호 2)에 제공된 노마코판 단백질 서열과 각각 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 초과의 동일성 정도를 갖는다. 본 명세서에 언급된 백분율 동일성은 NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 매트릭스; 갭 개방 패널티=11 및 갭 확장 패널티=1]에 의해 확인된 디폴트 매개변수를 사용하여 BLAST 버전 2.1.3을 사용하여 결정되는 바와 같다. 동일성 %는 관련 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 있을 수 있다 (예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 1 내지 168 또는 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168).

노마코판-유형 단백질은 따라서, 도 2, 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168 또는 도 2, 서열번호 2의 아미노산 1 내지 168과 적어도 60%,70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질로서, 참조 서열 예를 들어, 도 2, 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168 또는 도 2, 서열번호 2의 아미노산 1 내지 168에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %에 대한 언급에 의해 기재될 수 있고, 노마코판-유형 단백질이 상기 서열을 포함하는 경우, 노마코판-유형 단백질은 융합 단백질 (예를 들어, 제2 단백질, 예를 들어, 이종 단백질과 함께)일 수 있다. 적합한 제2 단백질은 아래에서 논의된다.

본 개시내용의 다양한 양상 및 실시양태에서, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 (예를 들어, 노마코판-유형 단백질)는 서열번호 2 및 서열번호 4의 변형되지 않은 노마코판 폴리펩타이드와 1 내지 50, 2 내지 45, 3 내지 40, 4 내지 35, 5 내지 30, 6 내지 25, 7 내지 20, 8 내지 25, 9 내지 20, 10 내지 15 아미노산, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개의 아미노산만큼 상이할 수 있다. 이는 치환, 삽입 또는 결실일 수 있지만 바람직하게는 치환이다. 결실이 이루어지는 경우, 이는 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 7 또는 10개 아미노산의 결실 (예를 들어, N 또는 C 말단로부터의 결실)이다. 따라서 돌연변이에는 아미노산 치환, 예를 들어 단백질의 기능이나 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 단백질이 포함된다. 이 용어는 또한 천연 생물학적 변이체 (예를 들어, 노마코판 단백질이 유래된 종 내의 대립형질 변이체 또는 지도모양 변이체)를 포함하는 것으로 의도된다. 에쿨리주맙에 의한 치료를 비효과적으로 만들거나 에쿨리주맙) 및/또는 LTB4에 의한 치료의 효능을 감소시키는 C5 다형성을 갖는 대상체의 C5 및/또는 야생형 C5에 결합하는 능력이 향상된 돌연변이는 또한 단백질 서열의 특정 잔기의 계통 또는 지정 돌연변이를 통해 설계될 수 있다.

이러한 변형은 서열번호 2 및 서열번호 4에 제시된 바와 같이 노마코판 폴리펩타이드에 이루어질 수 있고, 상기 분자는 유용하게 유지될 것이고, 생성된 변형된 노마코판 폴리펩타이드가 (i) LTB4 결합 활성 및/또는 또한 (ii) 서열번호 2 및 서열번호 4에 제시된 노마코판 폴리펩타이드와 유사한 C5 결합을 보유하는 경우, 기능적 변이체로 고려될 것이며, 이는 예를 들어 본 명세서의 다른 부분에서 언급된 시험을 사용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 이들 중 하나 또는 둘 모두에 대한 결합은 변형되지 않은 노마코판 폴리펩타이드와 비교하여 결합의 적어도 80, 85, 90, 95%임). 본 명세서의 다른 부분에서 논의된 바와 같이, 노마코판 및 L-노마코판 모두 자가면역 포도막염의 마우스 모델의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. L-노마코판은 LTB4에 결합하지만 C5에는 결합하지 않다. 노마코판 유사 단백질은 C5에 결합하는 능력 및/또는 LTB4에 결합하는 능력에 따라 규정될 수 있다. LTB4에 결합하는 것들은 본 발명에서 특히 사용된다. LTB4 및 C5에 결합하는 것 또한 본 발명에서 특히 사용된다.

기능적 변이체가 LTB4 및 선택적으로 C5에 결합하기 위한 요건을 감안할 때, 변형이 이루어지는 경우, 특정 잔기는 변형에서 제외되어야 한다. 여기에는 보존된 시스테인 잔기가 포함된다.

다른 잔기는 변형에서 제외되어야 하거나, 치환된 경우에만 보존적 변형에 적용되어야 한다. 이는 LTB4 결합 잔기이다. 기능적 변이체가 LTB4 및 C5에 결합하는 실시양태에서, 하기에 규정된 바와 같은 C5 결합 잔기는 바람직하게는 또한 변형으로부터 제외되어야 하거나, 치환되는 경우, 바람직하게는 보존적 변형에만 적용되어야 한다. LTB4와 C5의 결합이 비교적 잘 이해되고 있다는 점을 감안할 때, 노마코판에 대해 약 65%의 동일성 백분율을 가질 수 있지만 변화가 LTB4 결합 및 선택적으로 C5 결합에 관여하지 않는 잔기에 국한된다.

LTB4 결합 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 성숙 노마코판 분자의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에서 6개의 시스테인 아미노산 각각 (예를 들어, 신호 서열을 포함하는 전장 단백질의 잔기 19 내지 168에 해당하는 서열번호 4에 제시된 바와 같음)이 유지되고 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각이 유지되거나 보존적 변형에 적용된다.

LTB4 결합 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각은 유지되거나 보존적 변형에 적용되며, 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기의 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개는 보존적 변형에 적용된다.

LTB4 결합 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각은 유지된다.

LTB4 결합 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기 각각은 유지되거나 보존적 변형에 적용된다.

LTB4 결합 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기 각각은 유지되거나 보존적 변형에 적용되고 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개의 LTB4 결합 잔기는 보존적 변형에 적용된다.

LTB4 결합 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기 각각은 유지된다.

C5 및 LTB4에 결합하는 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 성숙 노마코판 분자의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에서 6개의 시스테인 아미노산 각각 (예를 들어, 신호 서열을 포함하는 전장 단백질의 잔기 19 내지 168에 해당하는 서열번호 4에 제시된 바와 같음)이 유지되고 LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각은 유지되거나 보존적 변형에 적용되고 하기에 제시된 C5 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15 또는 20개 또는 각각은 유지되거나 보존적 변형에 적용된다.

C5 및 LTB4에 결합하는 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각 및 C5 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15 또는 20개 또는 각각은 유지되거나 보존적 변형에 적용되고, 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개의 LTB4 및 C5 결합 잔기는 보존적 변형에 적용된다.

C5 및 LTB4에 결합하는 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각 및 C5 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15 또는 20개 또는 각각은 유지된다.

C5 및 LTB4에 결합하는 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 각각의 LTB4 결합 잔기 및 각각의 C5 결합 잔기는 유지되거나 보존적 변형에 적용된다.

C5 및 LTB4에 결합하는 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 각각의 LTB4 결합 잔기 및 각각의 C5 결합 잔기는 유지되거나 보존적 변형에 적용되고, 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개의 C5 및/또는 LTB4 결합 잔기는 보존적 변형에 적용된다.

C5 및 LTB4에 결합하는 변이체의 경우, 일부 실시양태에서 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에 있는 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 하기에 제시된 각각의 LTB4 결합 잔기 및 각각의 C5 결합 잔기는 유지된다.

이러한 영역 외부에서 이루어지는 변형은 보존적이거나 비보존적일 수 있다.

이들 각각의 실시양태에서 이들 6개의 시스테인 아미노산 잔기 사이의 간격은 바람직하게는 분자의 전체 구조를 보존하기 위해 유지된다 (예를 들어, 도 2의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 168에 따른 서열의 아미노 말단에서 카복실 말단까지 배열된 바와 같이 분자는 32개 아미노산 간격, 62개 아미노산 간격, 28개 아미노산 간격, 1개 아미노산 간격 및 21개 아미노산 간격의 거리에서 서로에 대해 이격된 6개의 시스테인 잔기를 포함함).

LTB4 결합 잔기

LTB4에 대한 결합에 관여하는 것으로 생각되고 바람직하게는 비변형 형태(unmodified form)로 유지되거나 서열번호 2 또는 서열번호 4에 비해 변형된 임의의 분자의 서열에서만 보존적 변화에 적용된 잔기는 Phe18, Tyr25, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, His99, His101, Asp103, 및 Trp115이다 (서열번호 4에 따른 넘버링(numbering)).

C5 결합 잔기

C5에 대한 결합에 관여하는 것으로 생각되고 서열번호 2 또는 서열번호4에 비해 변형된 임의의 분자의 서열에서 변형되지 않은 형태로 유지될 수 있는 잔기는 Val26, Val28, Arg29, Ala44, Gly45, Gly61, Thr62, Ser97, His99, His101, Met 114, Met 116, Leu117, Asp118, Ala119, Gly120, Gly121, Leu122, Glu123, Val124, Glu125, Glu127, His146, Leu147 및 Asp 149이다 (서열번호 4에 따른 넘버링). 이들 잔기는 LTB4에 결합하지만 C5에 대한 결합이 감소되도록 변형된 노마코판 변이체에서 변형된 것들 중 하나이다.

LTB4 및/또는 C5 결합 잔기

LTB4 및 C5 결합 둘 모두에 관여하는 2개의 히스티딘 잔기 His99 및 His101이 있다. 따라서 LTB4 및/또는 C5 결합에 관여하는 잔기 목록은 Phe18, Tyr25, Val26, Val28, Arg29, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Ala44, Gly45, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Gly61, Thr62, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, Ser97, His99, His101, Asp103, Met 114, Trp115, Met 116, Leu117, Asp118, Ala119, Gly120, Gly121, Leu122, Glu123, Val124, Glu125, Glu127, His146, Leu147 및 Asp 149이다 (서열번호 4에 따른 넘버링).

LTB4에 결합하지만 C5에 대한 결합이 감소되거나 결합하지 않는 분자의 추가 예

상기 논의된 바와 같이, C5에 결합하지 않거나 감소된 결합을 나타내지만 LTB-4-결합 활성을 보유하는 노마코판 유형 단백질은 예를 들어 WO2018/193121에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다. C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 이러한 노마코판-유형 단백질은 본 발명의 모든 양상에서 사용될 수 있다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 4개의 예시적인 노마코판-유형 단백질, 구체적으로 서열번호 22 (WO2018/193121의 서열번호 5, 변이체 1), 서열번호 23 (WO2018/193121의 서열번호 6, 변이체 2), 서열번호 24 (WO2018/193121의 서열번호 7, 변이체 3) 및 서열번호 25 (WO2018/193121의 서열번호 8, 변이체 4)에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 단백질이 WO2018/193121에 개시되어 있다. 본 실시예에서 언급된 L-노마코판은 변이체 2이다.

이러한 단백질은 노마코판 유형의 단백질이고 따라서 노마코판과 기능적 균등물인 것으로 고려되지만, 이는 LTB4 결합 특성만을 공유하고 C5에 대한 결합이 감소되거나 부재한다.

WO2018/193121에 규정된 바와 같은 이러한 노마코판 유형 단백질은 하기에 보다 상세히 기재되어 있고 본 발명에서 사용될 수 있다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 이들 단백질은 하기 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:

서열번호 22 (WO2018/193121의 서열번호 5)는 변형된 노마코판의 아미노산 서열이고, 서열번호 4는 Met114에서 Gln으로, Met116에서 Gln으로, Leu117에서 Ser으로, Asp118에서 Asn으로, Ala119에서 Gly으로, Gly120에서 Ser으로, Gly121에서 Ala으로, Leu122에서 Asp으로, Glu123에서 Asp으로 및 Val124에서 Lys으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 1)

서열번호 23 (WO2018/193121의 서열번호 6)은 변형된 커버신의 아미노산 서열이고, 서열번호 4는 Ala44에서 Asn으로, Met116에서 Gln으로, Leu117에서 Ser으로, Gly121에서 Ala으로, Leu122에서 Asp으로, Glu123에서 Ala으로 및 Asp149에서 Gly으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 2)

서열번호 24 (WO2018/193121의 서열번호 7)는 변형된 커버신의 아미노산 서열이고, 서열번호 4는 Ala44에서 Asn으로, Met116에서 Gln으로, Leu122에서 Asp으로 및 Asp149에서 Gly으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 3)

서열번호 25 (WO2018/193121의 서열번호 8)는 변형된 커버신의 아미노산 서열이고 서열번호 4는 Ala44에서 Asn으로 변경되도록 변형되었다. (노마코판 변이체 4)

서열번호 26 (WO2018/193121의 서열번호 9)은 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124 (서열번호 2의 132 내지 142)에서 베타 H와 알파2 사이의 루프의 아미노산 서열이다.

서열번호 27 (WO2018/193121의 서열번호 10)은 노마코판 변이체 1 (서열번호 22)에서 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124에서 베타 H 및 알파2 사이의 루프의 아미노산 서열이다.

서열번호 28 (WO2018/193121의 서열번호 11)은 노마코판 변이체 2 (서열번호 23)에서 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124에서 베타 H 및 알파2 사이의 루프의 아미노산 서열이다.

서열번호 29 (WO2018/193121의 서열번호 12)는 노마코판 변이체 3 (서열번호 24)에서 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124에서 베타 H 및 알파2 사이의 루프의 아미노산 서열이다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 노마코판-유형 폴리펩타이드는 변형된 노마코판 폴리펩타이드 (예를 들어, 류코트리엔 또는 하이드록시에이코사노이드 결합 활성을 나타내고 C5 결합이 감소되거나 부재함)로서 기재될 수 있다. "변형된 노마코판 폴리펩타이드"에 대한 언급은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 변형된 형태, 즉 서열번호 2의 N-말단에 나타나는 18개 아미노산 신호 서열의 존재 또는 부재 하의 노마코판 폴리펩타이드에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 따라서 이는 노마코판 유형 단백질로 고려될 수 있다.

이러한 폴리펩타이드 또는 이의 단편 (여기서 변형된 노마코판 폴리펩타이드의 N 말단으로부터 최대 5개의 아미노산이 결실된다)은 류코트리엔 또는 하이드록시에이코사노이드 결합 활성을 나타내고 C5 결합이 감소되거나 부재할 수 있고 1 내지 30개의 아미노산 치환이 이루어지는 서열번호 4를 포함할 수 있고,

(i) 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환 (a) 내지 (j) 중 하나 이상이 이루어지고:

a. Met114는 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;

b. Met116은 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;

c. Leu117은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, 또는 Pro로 대체되고;

d. Asp118은 Asn, Gln, Arg, Lys, Gly, Ala, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Met Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;

e. Ala119는 Gly, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되고;

f. Gly120은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되고;

g. Gly121은 Ala, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되고;

h. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Ala, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His로 대체되고;

i. Glu123은 Asp, Ala, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;

j. Val124는 Lys, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr로 대체됨; 또는/ 및

(ii) 서열번호 4의 Ala44는 Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체된다.

본 명세서에 사용된 LK/E 결합 활성은 다음에 제한되는 것은 아니나, LTB4, B4 이소류코트리엔 및 이의 임의의 하이드록실화된 유도체, HETE, HPETE 및 EET를 포함하는 하이드록시에이코사노이드 및 류코트리엔 에 결합하는 능력을 지칭한다. LTB4 결합이 특히 중요하다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 하기 설명에 따라 변형된 서열번호 2 또는 4로 이루어질 수 있거나 또는 하기의 설명에 따라 변형된 서열번호 2 또는 4를 포함할 수 있다.

서열번호 2 및 서열번호 4의 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124 (서열번호 2의 아미노산 위치 132 내지 142)에서 베타 H와 알파2 사이의 루프를 특징으로 한다. 이 루프에는 하기에 제시된 서열을 갖는다:

-Met-Trp-Met-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Val- (서열번호 26)

첫 번째 Met는 서열번호 4의 위치 114와 서열번호 2의 위치 132에 존재한다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환 (a) 내지 (j) 중 하나 이상이 이루어지도록 변형된다:

a. Met114는 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Gln 또는 Ala로 대체되고;

b. Met116은 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Gln 또는 Ala로 대체되고;

c. Leu117은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, 또는 Pro, 바람직하게는 Ser 또는 Ala로 대체되고;

d. Asp118은 Asn, Gln, Arg, Lys, Gly, Ala, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Met Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Asn으로 대체되고;

e. Ala119는 Gly, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Gly 또는 Asn으로 대체되고;

f. Gly120은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Ser 또는 Asn으로 대체되고;

g. Gly121은 Ala, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Ala 또는 Asn으로 대체되고;

h. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Ala, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asp 또는 Ala로 대체되고;

i. Glu123은 Asp, Ala, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Asp, Ala, Gln 또는 Asn으로 대체되고;

j. Val124는 Lys, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Lys 또는 Ala로 대체된다.

a. Met114는 Gln으로 대체되고;

b. Met116은 Gln으로 대체되고;

c. Leu117은 Ser로 대체되고;

d. Asp118은 Asn으로 대체되고;

e. Ala119는 Gly로 대체되고;

f. Gly120은 Ser로 대체되고;

g. Gly121은 Ala로 대체되고;

h. Leu122는 Asp로 대체되고;

i. Glu123은 Asp, 또는 Ala로 대체되고;

j. Val124는 Lys로 대체된다.

변형된 노마코판 폴리펩타이드에는 치환 (a) 내지 (j) 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개가 존재한다. 바람직하게는 치환 (a) 내지 (j) 중 2개 이상, 5개 이상 또는 8개 이상이 존재한다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환이 존재하도록 변형될 수 있다:

a. Met114는 Gln으로 대체되고;

b. Met116은 Gln으로 대체되고;

c. Leu117은 Ser로 대체되고;

d. Asp118은 Asn으로 대체되고;

e. Ala119는 Gly로 대체되고;

f. Gly120은 Ser로 대체되고;

g. Gly121은 Ala로 대체되고;

h. Leu122는 Asp로 대체되고;

i. Glu123은 Asp로 대체되고;

j. Val124는 Lys로 대체된다.

선택적으로 상기 언급된 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 Trp115는 치환되지 않는다. 바람직한 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124에서 베타 H와 알파2 사이의 루프를 가지며, 이는 서열 Gln-Trp-Gln-Ser-Asn-Gly- Ser-Ala-Asp-Asp-Lys (서열번호 27)를 갖는다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환이 존재하도록 변형될 수 있다:

a. Met116은 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Gln으로 대체되고;

b. Leu117은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, 또는 Pro, 바람직하게는 Ser로 대체되고;

c. Gly121은 Ala, Asp, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Ala로 대체되고;

d. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asp로 대체되고;

e. Glu123은 Asp, Ala, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Asp로 대체된다.

더욱 특정한 실시양태에서;

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu117은 Ser로 대체되고;

c. Gly121은 Ala로 대체되고;

d. Leu122는 Asp로 대체되고;

e. Glu123은 Ala로 대체된다.

선택적으로 상기 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 Trp 115는 치환되지 않는다. 선택적으로 이 실시양태에서 Met114, Trp 115, Asp118, Ala119, Gly120 및 Val124는 치환되지 않거나 본 명세서의 다른 부분에서 언급된 보존적 치환으로 치환된다. C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 바람직한 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124에서 베타 H와 알파2 사이에 루프를 가지며, 이는 서열 Met-Trp-Gln-Ser-Asp-Ala-Gly-Ala-Asp-Ala-Val (서열번호 28)을 갖는다.

b. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asp로 대체되고;

더욱 특정한 실시양태에서;

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu122는 Asp로 대체된다.

선택적으로 상기 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 Trp 115는 치환되지 않는다. 선택적으로 이 실시양태에서 Met114, Trp 115, Leu117, Asp118, Ala119, Gly120, Gly121, Glu123 및 Val124는 치환되지 않는다. C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 바람직한 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124에서 베타 H와 알파2 사이에 루프를 가지며, 이는 서열 Met-Trp-Gln-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Asp-Glu-Val (서열번호 29)을 갖는다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 서열번호 4의 Ala44 (서열번호 2의 Ala62)는 Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되도록 변형될 수 있다.

바람직한 실시양태에서 서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체된다.

서열번호 4의 위치 44(또는 서열번호 2의 위치 62)에서의 이러한 치환은 본 명세서에 언급된 임의의 다른 치환과 조합하여 이루어질 수 있다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 또 다른 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환 (a) 내지 (j) 중 하나 이상이 존재하도록 변형될 수 있다:

a. Met114는 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Gln 또는 Ala, 예를 들어, Gln으로 대체되고;

b. Met116은 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Gln 또는 Ala 예를 들어, Gln으로 대체되고;

c. Leu117은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, 또는 Pro, 바람직하게는 Ser 또는 Ala, 예를 들어, Ser로 대체되고;

e. Ala119는 Gly, Asp, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Gly 또는 Asn, 예를 들어, Gly로 대체되고;

f. Gly120은 Ser, Asp, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Ser 또는 Asn, 예를 들어, Ser로 대체되고;

g. Gly121은 Ala, Asp, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His 바람직하게는 Ala 또는 Asn, 예를 들어, Ala로 대체되고;

h. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asp 또는 Ala, 예를 들어, Asp로 대체되고;

i. Glu123은 Asp, Ala, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Asp, Ala, Gln 또는 Asn, 예를 들어, Asp 또는 Ala로 대체되고;

j. Val124는 Lys, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Lys 또는 Ala, 예를 들어, Lys로 대체되고;

선택적으로 서열번호 4의 Ala44 (서열번호 2의 Ala62)는 Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asn으로 대체된다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환이 존재하도록 변형될 수 있다:

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu117은 Ser로 대체되고;

c. Gly121은 Ala로 대체되고;

d. Leu122는 Asp로 대체되고;

e. Glu123은 Ala로 대체되고;

서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체된다.

이 실시양태의 바람직한 양상에서, 서열번호 4의 위치 114 내지 124에 해당하는 아미노산 잔기는 서열번호 28에 제시된 바와 같다.

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu122는 Asp로 대체되고;

서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체된다.

이 실시양태의 바람직한 양상에서, 서열번호 4의 위치 114 내지 124에 해당하는 아미노산 잔기는 서열번호 29에 제시된 바와 같다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 커버신 폴리펩타이드는 서열번호 4의 Asp149는 Gly, Gln, Asn, Ala, Met, Arg, Lys, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr로 대체되도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 Asp149는 Gly로 대체되도록 변형된다. 서열번호 4의 위치 149 (서열번호 2의 위치 167)에서의 치환은 본 명세서에 언급된 임의의 다른 치환과 조합하여 이루어질 수 있다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환이 존재하도록 변형될 수 있다

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu117은 Ser로 대체되고;

c. Gly121은 Ala로 대체되고;

d. Leu122는 Asp로 대체되고;

e. Glu123은 Ala로 대체되고;

서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체되고 서열번호 4의 Asp149는 Gly149로 대체된다.

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu122는 Asp로 대체되고;

본 개시내용의 다양한 양상 및 실시양태에서, C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 2 및 서열번호 4의 변형되지 않은 노마코판 폴리펩타이드와 1 내지 30개의 아미노산만큼 상이하다. 생성된 변형된 노마코판 폴리펩타이드가 변형되지 않은 노마코판 폴리펩타이드와 비교하여 LK/E 결합 활성을 나타내고 C5 결합이 감소되거나 부재하는 경우, 서열번호 2 및 서열번호 4의 노마코판 폴리펩타이드에 임의의 변형이 이루어질 수 있다.

일부 실시양태에서, 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150에서 6개의 시스테인 아미노산은 본 발명의 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 유지된다.

일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 서열번호 4의 Asn60 및 Asn84는 각각 Gln으로 대체된다. 이 변형은 폴리펩타이드가 효모에서 발현될 때 N-연결된 과글리코실화를 방지하기 위해 부위 지정 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다.

일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 서열번호 4의 다음 아미노산 중 하나 이상이 LTB4에 대한 결합에 관여하는 것으로 생각되고 따라서 변형되지 않은 형태로 유지될 수 있다: Phe18, Tyr25, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, His99, His101, Asp103, 및 Trp115. 일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 이러한 아미노산 중 적어도 5, 10 또는 15개 또는 모두는 본 발명의 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 변형되지 않은 형태로 유지된다. C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 이러한 아미노산 중 하나 이상이 보존적으로 치환될 수 있다. C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서, 최대 5, 10 또는 15개 또는 이들 아미노산 모두는 본 발명의 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 보존적으로 치환된다.

서열번호 4의 다음 위치의 아미노산은 노마코판과 TSGP2 및 TSGP3 사이에 고도로 보존되어 있다: 5, 6, 11, 13 내지 15, 20 내지 21, 24 내지 27, 29 내지 32, 35 내지 41, 45, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 69 내지 81, 83, 84, 86, 90 내지 94, 97 내지 104, 112 내지 113, 115, 125 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150.

서열번호 4의 다음 위치의 아미노산은 LTB4에 대한 결합에 관여하고/거나 노마코판과 TSGP2 및 TSGP3 사이에 고도로 보존된 것으로 생각된다: 5, 6, 11, 13 내지 15, 18, 20 내지 21, 24 내지 27, 29 내지 32, 35 내지 41, 43, 45, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 67, 69 내지 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90 내지 94, 97 내지 104, 112 내지 113, 115, 125 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150.

서열번호 4의 다음 위치의 아미노산은 LTB4에 대한 결합에 관여하고/거나 노마코판과 TSGP2 및 TSGP3 사이에 고도로 보존된 것으로 생각된다: 5, 6, 11, 13 내지 15, 18, 20 내지 21, 24 내지 25, 27, 30 내지 32, 35 내지 41, 43, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 67, 69 내지 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90 내지 94, 98, 100, 102 내지 104, 112 내지 113, 115, 126, 128 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 일부 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 상기 아미노산은 변형되지 않은 형태로 유지된다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 중 적어도 5, 10 또는 15개 또는 모두는 본 발명의 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 변형되지 않은 형태로 유지된다. 일부 실시양태에서, 이들 아미노산 중 하나 이상이 보존적으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 아미노산 중 최대 5, 10 또는 15, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 모두는 본 발명의 변형된 노마코판 폴리펩타이드에서 보존적으로 치환된다.

본 명세서에 언급된 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 통상적으로 서열번호 2 또는 서열번호 4와 1 내지 30, 바람직하게는 2 내지 25, 보다 바람직하게는 3 내지 20, 훨씬 더 바람직하게는 4 내지 15개의 아미노산만큼 상이하다. 일반적으로 차이는 5 내지 12 또는 6 내지 10개의 아미노산 변화이다. 예를 들어, 1 내지 30 또는 2 내지 25, 3 내지 30, 4 내지 15, 5 내지 12 또는 6 내지 10개의 아미노산 치환이 서열번호 2 또는 서열번호 4에서 이루어질 수 있다.

서열번호 27에 제시된 바와 같은 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124 (서열번호 2의 아미노산 위치 132 내지 142)에서 베타 H와 알파2 사이에 루프를 갖는 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 이 루프의 존재의 결과로서 서열번호 4와 비교하여 10개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 언급된 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 따라서 바람직하게는 서열번호 22에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 1 내지 15, 2 내지 10, 3 내지 5 또는 최대 2, 3, 4 또는 5개의 추가 치환을 갖는다 (예를 들어, 서열번호 27의 루프).

서열번호 28에 제시된 바와 같은 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124 (서열번호 2의 아미노산 위치 132 내지 142)에서 베타 H와 알파2 사이에 루프를 갖는 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 이 루프의 존재의 결과로서 서열번호 4와 비교하여 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 언급된 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 따라서 바람직하게는 서열번호 23에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 1 내지 20, 2 내지 15, 3 내지 10 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 추가 치환을 갖는다 (예를 들어, 서열번호 28의 루프). 추가 치환은 바람직하게는 본 명세서의 다른 부분에 제시된 바와 같이 위치 44 및 149에서의 치환을 포함한다.

서열번호 29에 제시된 바와 같은 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124 (서열번호 2의 아미노산 위치 132 내지 142)에서 베타 H와 알파2 사이에 루프를 갖는 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 이 루프의 존재의 결과로서 서열번호 4와 비교하여 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 언급된 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 따라서 바람직하게는 서열번호 24에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 1 내지 25, 2 내지 12, 3 내지 15 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 추가 치환을 갖는다 (예를 들어, 서열번호 29의 루프). 추가 치환은 바람직하게는 본 명세서의 다른 부분에 제시된 바와 같이 위치 44 및 149에서의 치환을 포함한다.

본 명세서의 다른 부분에 제시된 바와 같이 서열번호 4의 위치 44에서 치환을 갖는 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 바람직하게는 서열번호 4와 비교하여 1 내지 25, 2 내지 12, 3 내지 15, 또는 최대 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 추가 치환을 갖는다.

위에서 명시적으로 언급된 것 이외의 치환은 바람직하게는 예를 들어 하기 표에 따른 보존적 치환이다. 제2 열의 동일한 블록, 바람직하게는 제3 열의 동일한 줄에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 바람직한 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 서열번호 22, 23, 24, 25 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

C5-결합 활성이 감소되거나 부재하지만 LTB-4-결합 능력을 보유하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다.

1. 류코트리엔 또는 하이드록시에이코사노이드 결합 활성을 나타내고 C5 결합이 감소되거나 부재하는 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편 (여기서 변형된 노마코판 폴리펩타이드의 N 말단으로부터 최대 5개의 아미노산이 결실된다)으로서, 상기 변형된 노마코판 폴리펩타이드는 1 내지 30개의 아미노산 치환이 이루어지는 서열번호 4를 포함하고,

여기서,

j. Val124는 Lys, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr로 대체됨; 또는/및

(ii) 서열번호 3의 Ala44는 Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체된다.

2. 제1항에 있어서,

a. Met114는 Gln으로 대체되고;

b. Met116은 Gln으로 대체되고;

c. Leu117은 Ser로 대체되고;

d. Asp118은 Asn으로 대체되고;

e. Ala119는 Gly로 대체되고;

f. Gly120은 Ser로 대체되고;

g. Gly121은 Ala로 대체되고;

h. Leu122는 Asp로 대체되고;

i. Glu123은 Asp, 또는 Ala로 대체되고;

j. Val124는 Lys로 대체됨; 또는/및

(ii) 서열번호 3의 Ala44는 Asn44로 대체되고;

또는 변형된 노마코판 폴리펩타이드의 N 말단으로부터 최대 5개의 아미노산이 결실된, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 치환 (a) 내지 (j) 중 하나 이상이 존재하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

4. 제3항에 있어서, 치환 (a) 내지 (j) 중 2개 이상이 존재하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

5. 제4항에 있어서, 치환 (a) 내지 (j) 중 5개 이상이 존재하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

6. 제5항에 있어서, 선택적으로 Trp 115가 치환되지 않은 경우, 각각의 치환 (a) 내지 (j)이 존재하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

7. 제5항에 있어서, 선택적으로 Trp 115가 치환되지 않은 경우, 제2항에 규정된 바와 같은 각각의 치환 (a) 내지 (j)이 존재하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

8. 제7항에 있어서, Glu123은 Asp로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 27에 제시된 바와 같은 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124 사이에 루프 서열을 갖고, 서열번호 22에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 1 내지 15개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

10. 제9항에 있어서, 서열번호 22에 제시된 것 외에 서열번호 27과 비교하여 2 내지 10개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 서열번호 22에 제시된 것 외에 서열번호 27과 비교하여 2 내지 10개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 22로 이루어지거나 이를 포함하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

c. Gly121은 Ala, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Ala로 대체되고;

d. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Ala, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asp로 대체되고;

e. Glu123은 Asp, Ala, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Ala 또는 Asp로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

14. 제13항에 있어서, 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서:

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu117은 Ser로 대체되고;

c. Gly121은 Ala로 대체되고;

d. Leu122는 Asp로 대체되고;

e. Glu123은 Ala로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

15. 제13항 또는 제14항에 있어서, Trp 115는 치환되지 않은, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

16. 제13항, 제14항 또는 제15항에 있어서, Met114, Trp 115, Asp118, Ala119, Gly120 및 Val124는 치환되지 않은, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

17. 제1항 내지 제5항 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 28에 제시된 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124의 루프 서열을 갖고 서열번호 23에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 1 내지 20개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

18. 제17항에 있어서, 서열번호 23에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 2 내지 15개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 서열번호 23에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 3 내지 10개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

20. 제1항 내지 제5항 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 23으로 이루어지거나 이를 포함하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

b. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Ala, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asp로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

22. 제21항에 있어서,

a. Met116은 Gln으로 대체되고;

b. Leu122는 Asp로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

23. 제21항에 있어서, 또는 제22항에 있어서, Trp 115는 치환되지 않은, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

24. 제21항, 제22항 또는 제23항에 있어서, Met114, Trp 115, Leu117, Asp118, Ala119, Gly120, Gly121, Glu123 및 Val124는 치환되지 않은, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

25. 제1항 내지 제4항 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 29에 제시된 바와 같은 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124 사이에 루프 서열을 갖고, 서열번호 24에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 1 내지 25개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

26. 제25항에 있어서, 서열번호 24에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 2 내지 12개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열번호 24에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 3 내지 15개의 추가 치환을 갖는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

28. 제1항 내지 제4항 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 24로 이루어지거나 이를 포함하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

29. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4의 Ala44는 Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

30. 제29항에 있어서, 서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

31. 제1항 내지 제11항 또는 제13항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4의 Asp149는 Gly, Gln, Asn, Ala, Met, Arg, Lys, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체되고 서열번호 4의 Asp149는 Gly로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150의 6개의 시스테인 아미노산이 비변형 형태로 유지되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

34. 제1항 내지 제11항, 제13항 내지 제19항 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Asn60 및 Asn84는 각각 Gln으로 대체되는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 아미노산 Phe18, Tyr25, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, His99, His101, Asp103, 및 Trp115 중 하나 이상은 치환되지 않은, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

36. 제35항에 있어서, 다음 아미노산 Phe18, Tyr25, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, His99, His101, Asp103, 및 Trp115 모두는 치환되지 않은, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,

a. 서열번호 4의 아미노산 5, 6, 11, 13 내지 15, 20 내지 21, 24 내지 27, 29 내지 32, 35 내지 41, 45, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 69 내지 81, 83, 84, 86, 90 내지 94, 97 내지 104, 112 내지 113, 115, 125 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150은 치환되지 않거나;

b. 서열번호 4의 아미노산 5, 6, 11, 13 내지 15, 18, 20 내지 21, 24 내지 27, 29 내지 32, 35 내지 41, 43, 45, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 67, 69 내지 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90 내지 94, 97 내지 104, 112 내지 113, 115, 125 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150은 치환되지 않거나;

c. 서열번호 4의 아미노산 5, 6, 11, 13 내지 15, 18, 20 내지 21, 24 내지 25, 27, 30 내지 32, 35 내지 41, 43, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 67, 69 내지 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90 내지 94, 98, 100, 102 내지 104, 112 내지 113, 115, 126, 128 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150은 치환되지 않은, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

38. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 서열번호 25를 포함하거나 이로 이루어진, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, LTB4에 결합하는, 변형된 노마코판 폴리펩타이드 또는 이의 단편.

단편

노마코판의 기능적 균등물은 노마코판 단백질의 단편을 포함하며, 단 이러한 단편은 (i) LTB4 및/또는 (ii) C5 (예를 들어, 에쿨리주맙에 의한 치료를 비효과적으로 만들거나 에쿨리주맙에 의한 치료의 효능을 감소시키는 C5 다형성을 갖는 대상체로부터의 C5 및/또는 야생형 C5)에 결합하는 능력을 보유한다. 바람직하게는 기능적 단편은 특성 (i) 및 (ii)를 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 기능적 단편은 특성 (i)을 갖지만 C5 결합이 감소되거나 부재한다.

단편은 예를 들어, 150개 미만의 아미노산, 145개 미만의 아미노산인 노마코판 단백질 서열 (또는 상동체)로부터 유래된 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 단, 이들 단편은 LTB4 및 선택적으로 C5에 결합하는 능력을 보유한다.

단편은 예를 들어, 적어도 150개의 아미노산, 적어도 145개의 아미노산의 노마코판 단백질 서열 (또는 상동체)로부터 유래된 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 단, 이들 단편은 LTB4 및 선택적으로 또한 C5에 결합하는 능력을 보유한다. .

임의의 기능적 균등물 또는 이의 단편은 바람직하게는 노마코판에 존재하는 시스테인 잔기의 패턴을 보유한다. 예를 들어, 상기 기능적 균등물은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 168에 따른 서열의 아미노 말단에서 카복실 말단으로 서로에 대해 32개 아미노산 간격, 62개 아미노산 간격, 28개 아미노산 간격, 1개 아미노산 간격 및 21개 아미노산 간격으로 이격되어 배열되어 있는 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. 노마코판 단백질의 예시적인 단편은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14에 개시되어 있다. 해당 단편을 인코딩하는 DNA는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13에 개시되어 있다.

이러한 단편으로서는 도 2에서 명시적으로 확인된 O. 모우바타 노마코판 단백질의 단편뿐만 아니라, 상기 기재된 바와 같이 이 단백질의 상동체 (예를 들어, 변이체)의 단편이 또한 포함된다. 이러한 상동체 단편은 일반적으로 도 2의 노마코판 단백질 서열 단편과 60% 초과의 동일성을 갖지만, 상동체의 보다 바람직한 단편은 각각 도 2의 노마코판 단백질 서열의 단편과 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 초과의 동일성 정도를 나타낼 것이다. 바람직하게는 이러한 단편은 위에서 언급한 시스테인 간격을 보유할 것이다. 물론 향상된 특성을 가진 단편은 야생형 서열의 체계적인 돌연변이 또는 단편화에 의해 합리적으로 설계된 후 적절하게 활성 분석될 수 있다. 단편은 LTB4에 대해 노마코판과 유사하거나 더 큰 친화도를 나타낼 수 있으며, 선택적으로 노마코판과 마찬가지로 C5에 대해서도 유사하거나 더 큰 친화도를 나타낼 수 있다. 이들 단편은 노마코판 단백질의 단편에 대해 위에서 기재된 크기일 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 노마코판-유형 단백질은 바람직하게는 LTB4 및 선택적으로 또한 C5에 결합한다.

보존적 치환

임의의 치환은 바람직하게는 예를 들어 하기 표에 따른 보존적 치환이다. 제2 열의 동일한 블록, 바람직하게는 제3 열의 동일한 줄에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:

융합 단백질

본 발명에 따라 사용되는 기능적 균등물은 예를 들어, 노마코판 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 클로닝함으로써 획득된 융합 단백질 또는 이종 단백질 서열에 대한 코딩 서열에 대해 프레임 내의 기능적으로 균등물일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "이종"은 노마코판 단백질 또는 이의 기능적 균등물 이외의 임의의 폴리펩타이드를 지정하는 것으로 의도된다. N- 또는 C-말단에서 가용성 융합 단백질에 포함될 수 있는 이종 서열의 예는 다음과 같다: 막 결합 단백질의 세포외 도메인, 면역글로불린 불변 영역 (Fc 영역), PAS 또는 XTEN 또는 유사한 비구조 폴리펩타이드, 다량체화 도메인, 세포외 단백질의 도메인, 신호 서열, 수송 서열 또는 친화도 크로마토그래피에 의한 정제를 가능하게 하는 서열. 이들 이종 서열 중 다수는 발현 플라스미드에서 상업적으로 이용 가능하며, 이는 이들 서열은 융합 단백질에 일반적으로 포함되어 이에 융합된 단백질의 특정 생물학적 활성을 크게 손상시키지 않으면서 추가 특성을 제공하기 때문이다[51]. 이러한 추가 특성의 예로는 체액에서 더 오래 지속되는 반감기 (예를 들어, Fc 영역 또는 PAS화[52]의 추가로 인해 발생), 세포외 국소화 또는 히스티딘, GST, FLAG, 아비딘 또는 HA 태그와 같은 태그에 의해 가능한 더 용이한 정제 절차가 있다. 융합 단백질은 링커 서열을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, 1 내지 50개 아미노산 길이로 성분이 이 링커에 의해 분리되도록 하기 위함).

따라서 융합 단백질은 노마코판-유사 단백질을 포함하는 단백질의 예이고, 특정 예로서 PAS 서열 및 노마코판-유형 단백질 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. PAS 서열는 예를 들어 [52] 및 EP2173890에 기재되어 있으며, PAS화된 노마코판 분자는 가 문헌[Kuhn et al] [53]에 기재되어 있다. PAS화®는 아미노산 Pro, Ala 및/또는 Ser으로 이루어진 무작위 입체형태의 폴리펩타이드 서열과 단백질의 유전적 융합을 기재한다. 이는 XL Protein (http://xl-protein.com/)에서 개발한 기술로 유체역학적 부피가 큰 용매화된 무작위 사슬을 융합된 단백질에 부착할 수 있는 간단한 방법을 제공한다. 폴리펩타이드 서열은 무작위 코일 구조를 채택한다. 따라서 생성된 융합 단백질의 겉보기 분자량은 융합 단백질의 실제 분자량보다 훨씬 더 크다. 이는 생물학적 시스템에서 신장 여과에 의한 제거율을 크게 감소시킨다. 적절한 PAS 서열는 [52]뿐만 아니라, EP2173890에 기재되어 있다. 임의의 적합한 PAS 서열이 융합 단백질에 사용될 수 있다. 예는 무작위 코일 입체형태를 형성하고 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 (또는 프롤린 및 알라닌 잔기로 이루어지거나 필수적으로 이루어진) 적어도 약 100개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 이는 복수의 아미노산 반복을 포함할 수 있고, 상기 반복은 Ala, Ser 및 Pro 잔기 (또는 프롤린 및 알라닌 잔기)로 이루어지거나 필수적으로 이루어지고 6개 이하의 연속적인 아미노산 잔기가 동일하다. 프롤린 잔기는 서열의 아미노산의 4% 초과 40% 미만을 구성할 수 있다. 서열은 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이들 서열의 전체 또는 일부로서의 이들 서열의 순환 재배치된 형태 또는 다량체를 포함할 수 있다:

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (서열번호 15);

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (서열번호 16);

APSSPSPSAPSSPSPASPSS (서열번호 17),

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (서열번호 18),

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (서열번호 19),

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (서열번호 20) 및

ASAAAPAAASAAASAPSAAA (서열번호 21)

예를 들어, PAS 서열, 즉 서열번호 15 내지 21 중 하나, 바람직하게는 서열번호 15에 존재하는 반복 중 하나의 5 내지 40, 10 내지 30, 15 내지 25, 18 내지 20 바람직하게는 20 내지 30 또는 30개의 카피(copy)일 수 있다. 바람직하게는 PAS 서열은 서열번호 15의 30개 카피를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게는 PAS 서열은 노마코판 유형 단백질의 N 말단에 융합된다 (직접적으로 또는 링커 서열을 통함).

특정 바람직한 실시양태에서, 노마코판-유형 단백질은 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다 (예를 들어, 융합 단백질은 (a) 서열번호 15의 30개 카피로 이루어진 PAS 서열 및 (b) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168을 포함하고, (a)는 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 (b)의 N 말단에 융합됨). 예시적인 서열은 도 2d 및 서열번호 30에 제공된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 노마코판-유형 단백질은 서열번호 22, 23, 24 또는 25를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다 (예를 들어, 융합 단백질은 (a) 서열번호 15의 30개 카피로 이루어진 PAS 서열 및 (b) 서열번호 22, 23, 24 또는 25를 포함하고, (a)는 (b)의 N 말단에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 융합됨). 바람직한 형태는 서열번호 22를 포함할 것이다. 예시적인 서열은 도 2e 및 서열번호 31에 제공된다.

융합 단백질은 링커 서열 (예를 들어, 1 내지 50, 2 내지 30, 3 내지 20, 5 내지 10, 2 내지 4, 3 내지 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 길이)을 포함하여, 성분은 이 링커에 의해 분리된다. 일 실시양태에서 링커 서열은 단일 알라닌 잔기일 수 있다.

본 발명에서 "PAS-노마코판"은 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이, PAS화된 노마코판의 기능적 균등물을 지칭하는 것으로 의도되며, PAS-L-노마코판은 LTB4에 결합하지만 C5에는 결합하지 않고 PAS화된 노마코판의 기능적 균등물을 지칭하는 것으로 의도된다. 실시예에서 시험된 PAS-노마코판 분자의 서열은 도 2d 및 서열번호 30에 제시되어 있다. 실시예에서 시험된 PAS-L-노마코판 분자의 서열은 도 2e 및 서열번호 31에 제시되어 있다. PAS-노마코판과 PAS-L-노마코판은 각각 반감기가 길어 투여 빈도가 적어 환자에게 더 간편한 이점이 있다. 따라서 PAS-노마코판은 C5 및 LTB4 의존성 경로를 모두 억제하지만 노마코판보다 투여 빈도가 더 적을 수 있어 투여 이점을 제공한다는 점에서 노마코판의 이점을 조합한다. 따라서 PAS-L-노마코판은 C5 의존성 경로를 억제하지 않고 LTB4 의존성 경로를 모두 억제하지만 L-노마코판보다 투여 빈도가 더 적을 수 있어 투여 이점을 제공한다는 점에서 L-노마코판의 이점을 조합한다.

제제의 제조

단백질 및 이의 기능적 균등물은 숙주 세포에서의 발현에 의해 재조합 형태로 제조될 수 있다. 이러한 발현 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 [54] 및 [55]로 상세히 기재되어 있다. 노마코판 단백질의 재조합 형태 및 이의 기능적 균등물은 바람직하게는 글리코실화되지 않는다. 바람직하게는 숙주 세포는 E. 콜라이이다.

노마코판 단백질 및 이의 기능적 균등물은 바람직하게는, 예를 들어 이것이 발현되는 숙주 세포 및/또는 세포 성장 배지의 적어도 하나의 성분으로부터 분리된 단리된 형태이다. 일부 실시양태에서, 노마코판 단백질 또는 이의 기능적 균등물은 예를 들어 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 측정도는 바와 같이 적어도 90%, 95% 또는 99% 순도로 정제된다. 본 발명의 단백질 및 단편은 또한 단백질 화학의 통상적인 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질 단편은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 융합 단백질의 생성 방법은 당업계의 표준이며 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 대부분의 일반 분자생물학, 미생물학 재조합 DNA 기술 및 면역학 기술은 [54] 또는 [56]에서 찾을 수 있다.

핵산 분자로서의 제제

본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 상기 제제는 노마코판 유형 단백질을 인코딩하는 핵산 분자일 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법은 생체내 또는 생체외에서 대상체의 관련 세포에 의한 노마코판 유형 단백질의 내인성 생성을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 접근법은 치료 유전자를 혈류나 근육 조직에 직접 주입하는 "네이키드 (naked) DNA"의 투여이다.

바람직하게는, 이러한 핵산 분자는 도 2 (서열번호 1)의 뉴클레오타이드 서열의 염기 55 내지 507을 포함하거나 이로 이루어진다. 이 뉴클레오타이드 서열은 신호 서열 없이 도 2의 노마코판 단백질을 인코딩한다. 도 2의 뉴클레오타이드 서열의 처음 54개 염기는 보체 억제 활성 또는 LTB4 결합 활성에 필요하지 않은 신호 서열을 인코딩한다. 대안적으로, 핵산 분자는 신호 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 도 2의 핵산 서열의 염기 1 내지 507을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

투여 방식

노마코판 유형 단백질은 안구에 직접 투여되거나 전신 투여될 수 있다. 이는 바람직하게는 안구 표면에 직접, 예를 들어 국소 (예를 들어, 점적제 또는 연고 형태) 또는 안구내로 직접 도입 (예를 들어, 공막에 의해 규정된 안구의 경계 내에 직접 투여)에 의해 투여된다. 안구의 경계 내의 직접 투여의 예는 유리체내 투여 및 맥락막상 투여를 포함한다. 유리체내 투여 (예를 들어, 유리체내 주사)는 당업계에 널리 공지되어 있다. 맥락막상 투여가 또한 수행될 수 있다.

국소 투여

본 발명자들은 노마코판-유형 단백질을 안구에 국소 투여하는 것이 실험적 UAE에 영향을 미친다는 것을 관찰했는데, 이는 이러한 단백질이 각막을 통과할 수 있는 것으로 이전에 생각되지 않았기 때문에 놀라운 것이다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, L-노마코판, 노마코판 및 PAS-노마코판은 모두 사용된 UAE 마우스 모델에서 임상 점수를 일정 정도 감소시켰다. 이는 이러한 분자가 각막을 통과하여 안구 내에서 효과를 발휘할 수 있는 것과 일치한다.

특정 실시양태에서 노마코판-유형 단백질을 사용한 국소 치료가 망막 증식 질병, 즉 병리적 영향이 안구 내에 이루어지는 질병에 영향을 미친다는 사실은 임의의 노마코판-유형 단백질이 망막 증식 질병의 치료를 위해 단독으로 사용될 수 있음을 의미한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 노마코판-유형 단백질은 예를 들어, 매일 또는 매일 2 내지 5, 3 내지 4회 국소 투여된다.

안구내로의 직접 투여

본 발명의 제제를 안구내로 직접 도입하는 것, 예를 들어 공막에 의해 규정된 바와 같은 안구의 경계 내에 직접 투여하는 것이 유리할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제제는 유리체내로 도입된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 제제는 맥락막상으로 도입된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제제는 유리체내로 도입된다. 유리체내 투여는 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 유리체내 투여는 약 4 내지 6, 4 내지 8, 4 내지 10주마다 1회 수행된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 제제는 맥락막상으로 도입된다. 맥락막위 공간 (SCS)은 안구의 후안부 둘레를 통과하는 맥락막과 공막 사이의 가능한 공간이다. SCS에 제제를 도입하면 안구의 다른 부분에서는 낮은 수준을 유지하면서 생체이용률이 높은 맥락막, 망막 색소 상피 및 망막을 표적화한다. 실제로, 3상 임상 시험은 SCS 약물 전달의 안전성과 효능을 조사하고 있다. 제제는 SCS에 예를 들어, 피하 주사바늘, 마이크로니들 (microneedle), 마이크로 스텐트 (micro-stent)로 투여될 수 있다[57]. 본 발명의 특정 실시양태에서 맥락막상 투여는 약 4 내지 6, 4 내지 8, 4 내지 10주마다 1회 수행된다.

안구내로의 직접 투여와 조합된 국소 투여

노마코판-유형 단백질은 또한 본 명세서의 다른 부분에서 논의된 바와 같이 제2 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 제제는 안구내로 직접 도입된다. 이것의 이점은 상기 제2 제제의 안구내로 직접 투여가 수행되어야 하는 빈도를 감소시킬 수 있다는 것이다. 안구내로 직접 투여하는 것은 일반적으로 안전하지만 특정 합병증의 위험이 있다 (예를 들어, 감염, 안구내로 유입되는 대동맥의 폐쇄, 망막 박리, 안구의 출혈 및 안구의 수정체 손상). 또한 환자가 병원에 입원해야 하는 의료 절차이다. 망막 증식 질병을 치료하기 위해 이러한 투여는 예를 들어, 1 내지 2개월에 1회 수행될 수 있다. 따라서 이러한 투여가 수행되는 빈도를 감소시키는 것이 유리할 것이다.

따라서, 특정 실시양태에서 대상체에서 망막 증식 질병을 치료 또는 예방하는 방법은 (i) 본 명세서에 규정된 바와 같은 노마코판-유형 단백질의 국소 투여 및 (ii) 제2 망막 증식 치료제의 대상체의 안구내로의 직접 투여를 포함한다. 제2 망막 증식 치료는 본 명세서의 다른 부분에서 규정된 바와 같을 수 있거나, 그 자체가 노마코판-유형 단백질일 수 있다 (예를 들어, 이는 국소 투여되는 노마코판-유형 단백질과 동일한 노마코판-유형 단백질일 수 있거나 제2 노마코판-유형 단백질일 수 있음).

제2 망막 증식 치료의 예는 항-VEGF 제제 (예를 들어, 항-VEGF-A 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 베바시주맙 (Avastin), 라니비주맙 (Lucentis), 항-VEGF 앱타머 (예를 들어, 페갑타닙 (Macugen)) 또는 다른 VEGF 길항제, 예를 들어 아플리버셉트 (Eylea, 인간 IgG1 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인으로부터의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결합 부분으로 이루어진 재조합 융합 단백질), 스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드), 면역조절 요법 (IMT) 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아자티오프린 또는 미코페놀레이트), 생물학적 반응 조절제 (BRM) 약물 (항-TNF알파 제제, 예를 들어 TNF알파에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 예컨대 인플릭시맙 또는 아달리무맙을 포함한다. 바람직하게는 상기 제2 제제는 항-VEGF 제제이다.

노마코판 유형 단백질이 국소 투여되고 제2 노마코판 유형 단백질이 안구내로 직접 투여되는 실시양태에서, 국소 투여되는 제제는 장기간 작용하는 단백질 (예를 들어, 배출 시간을 감소시키기 위해 설계된 서열을 포함하는 융합 단백질)일 필요는 없다. 따라서 이는 예를 들어, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제일 수 있으며, 상기 단백질은 최대 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160개의 아미노산 (바람직하게는 최대 150개의 아미노산) 길이이다. 예를 들어, 이는 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이의 기능적 균등물일 수 있으며, 상기 단백질이 기능적 균등물인 경우 이는 융합 단백질이 아니다 (예를 들어, 이는 상동체가 본 명세서의 다른 부분에서 규정된 바와 같은 상기 단백질의 상동체인 기능적 균등물, 상기 단백질의 단편 또는 상동체의 단편일 수 있음). 이러한 실시양태에서, 안구내로 직접 투여되는 제제는 본 명세서의 다른 부분에서 규정된 바와 같은 융합 단백질인 기능적 균등물일 수 있다. 예를 들어, 국소 투여되는 제제는 도 2 (서열번호 2), 서열번호 22, 23, 24, 25의 아미노산 19 내지 168, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 아미노산 19 내지 168로 이루어진 단백질일 수 있고/거나, 안구내로 직접 투여되는 제제는 (i) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열, 서열번호 22, 23, 24, 25의 아미노산 19 내지 168, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 아미노산 19 내지 168 및 (ii) 본 명세서에 규정된 바와 같은 PAS 서열, 예를 들어 서열번호15의 30개 카피로 이루어진 서열을 포함하는 융합 단백질이다.

다른 실시양태에서 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 하나의 제제는 국소 투여되고 제2 망막 증식성 질병 치료제는 안구내로 직접 투여된다. 　 제2 망막 증식성 질병 치료제는 예를 들어 항-VEGF 제제 (예를 들어, 항-VEGF-A 항체 또는 이의 단편 예컨대 베바시주맙 (Avastin), 라니비주맙 (Lucentis), 항-VEGF 앱타머 (예컨대 페갑타닙 (Macugen)), 또는 또 다른 VEGF 길항제 예컨대 아플리버셉트 (Eylea, 인간 IgG1 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결합 부분으로 이루어진 재조합 융합 단백질), 스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드), 면역조절 요법 (IMT) 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아자티오프린 또는 마이코페놀레이트), 생물학적 반응 조절제 (BRM) 약물 (항-TNF알파 제제, 예를 들어 TNF알파에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 예컨대 인플릭시맙 또는 아달리무맙)일 수 있다. 바람직하게는 상기 제2 제제는 항-VEGF 제제이다. 바람직하게는 국소 투여되는 제제는 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열, 서열번호 22, 23, 24, 25의 아미노산 19 내지 168, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 아미노산 19 내지 168로 이루어진 단백질이다.

전신 투여

다른 실시양태에서, 노마코판-유형 단백질 또는 제제는 전신적으로, 예를 들어, 피하 투여된다.

치료적 또는 예방적 유효량

상기 제제는 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여된다. "치료적 유효량"이라는 용어는 관련 병태, 예를 들어, 망막 증식성 질병을 치료하는데 필요한 제제의 양을 지칭한다. 이와 관련하여 "치료"에는 장애의 중증도를 감소시키는 것이 포함된다.

본 명세서에 사용된 용어 "예방적 유효량"은 관련 병태, 예를 들어, 망막 증식성 질병을 예방하는데 필요한 제제의 양을 지칭한다. 이와 관련하여 "예방"에는 예를 들어, 제제의 투여가 개시되기 전에 장애의 존재가 검출되지 않는 경우 장애의 중증도를 감소시키는 것이 포함된다. 장애의 중증도를 감소시키는 것은 예를 들어 시력을 향상시킬 수 있다.

감소 또는 향상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 제제 또는 투여가 없는 결과와 관련된다. 결과는 이러한 환자를 평가하는데 사용되는 표준 기준에 따라 평가된다. 이를 정량화할 수 있을 정도로 상대적인 기준에서 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%가 감소 또는 향상된다.

전신 투여의 경우, 노마코판 분자를 기준으로 계산된 투여량은 0.1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일 (환자의 질량 대비 약물의 질량), 예를 들어, 0.2 내지 5, 0.25 내지 2, 또는 0.1 내지 1 mg/kg/일이다. 융합 단백질 (예를 들어, 본 명세서에서 논의됨)이 노마코판 분자보다 더 크기 때문에 등몰량이 이러한 단백질에 사용될 수 있다. 따라서 노마코판의 기능적 균등물에 대해서는 위에서 언급한 등몰량을 사용할 수 있다. 예를 들어, 노마코판 및 약 600개 아미노산의 PAS 부분 또는 본 명세서에 규정된 바와 같은 PAS 부분, 예를 들어, PAS-노마코판을 포함하는 융합 단백질의 경우) 0.1 mg/kg/일의 등몰량은 0.4 mg/kg/일이므로 투여량은 0.4 mg/kg/일 내지 40 mg/kg/일 (환자의 질량 대비 약물의 질량), 예를 들어 0.8 내지 20, 1 내지 8 또는 0.4 내지 4 mg/kg/일일 수 있다. 대안적으로, 이들 융합 단백질의 더 긴 반감기를 설명하기 위해, 투여량당 더 많은 양이 제공될 수 있고, 투여량은 종종 예를 들어 1주의 기간 동안 40mg 내지 2g, 50mg 내지 1.5g, 75mg 내지 1g으로 더 적게 투여되며, 예를 들어 1주당 1 또는 2회 투여된다.

치료적 또는 예방적 유효량은 말단 보체의 억제 측면에서, 예를 들어 말단 보체 활성 (TCA)이 치료 부재 시 말단 보체 활성과 비교하여 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%만큼 감소하는 것을 의미하는 양으로 추가로 규정될 수 있다. 투여량 및 빈도는 적절한 수준에서 말단 보체 활성을 보유하기 위해 조정될 수 있으며, 이는 예를 들어 치료 부재 시 말단 보체 활성과 비교하여 예를 들어 10% 이하, 예를 들어 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 이하일 수 있다.

치료적 또는 예방적 유효량은 추가로 혈장 중 LTB4 수준의 감소의 측면에서, 예를 들어 LTB4 수준이 정상 수준의 특정 범위 내 (예를 들어, 정상의 90 내지 110%, 정상의 85 내지 115%)이거나, 치료 부재 시 혈장 중 LTB4 수준과 비교하여 혈장 중 LTB4 수준이 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%만큼 감소되는 것을 의미하는 양을 규정할 수 있다. 투여량 및 빈도는 혈장 중 LTB4 수준을 적절한 수준으로 유지하기 위해 조정될 수 있으며, 이는 정상 수준의 특정 범위 내 (예를 들어, 정상의 90 내지 110%, 정상의 85 내지 115%)이거나, 치료 부재 시 혈장 중 LTB4 수준과 비교하여 예를 들어 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하, 예를 들어 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 이하일 수 있다. LTB4 수준은 통상적인 방법 (예를 들어, 면역분석, 예를 들어 순차 경쟁 결합 기술을 기반으로 하는 상업적으로 이용 가능한 R&D 시스템 분석 참조[58])에 의해 결정될 수 있다.

투여량이 제공되는 경우, 이는 단백질 또는 이의 기능적 균등물인 제제의 투여량에 관한 것이다. 핵산 분자인 제제에 대한 적절한 투여량을 사용하여 이러한 수준을 증가시킬 수 있다. 투여량은 존재하는 비활성 단백질의 존재를 고려하여 다양할 수 있다 (예를 들어, 600개 아미노산 PAS 부분이 있는 PAS-노마코판은 노마코판의 약 4배 분자량을 가지므로 등몰량은 노마코판 양의 약 4배가 됨). 노마코판에 제공된 임의의 투여량의 등몰량은 추가 서열을 포함하는 임의의 노마코판 기능적 균등물에 사용될 수 있다. 등몰량은 통상적인 방법을 사용하여 계산할 수 있다.

말단 보체 활성은 당업계에 공지된 표준 분석, 예를 들어 Quidel CH50 용혈 분석 및 양 적혈구 용해 CH50 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

투여량이 투여될 필요가 있는 빈도는 관련된 제제의 반감기에 따라 다를 것이다. 노마코판 단백질 또는 이의 기능적 균등물은 예를 들어, 1일 2회 기준, 매일 기준 또는 2, 3, 4일, 5, 6 또는 7일 이상마다, 예를 들어 1일 2회 또는 매일 기준으로 투여될 수 있다. 연장된 반감기 형태, 예를 들어, PAS화된 노마코판 분자의 투여 빈도는 더 적을 수 있다 (예를 들어, 2, 3, 4일, 5, 6, 7, 10, 15 또는 20일 이상마다, 예를 들어 1일 또는 2일 이상 또는 매주 1회).

정확한 투여량 및 투여 빈도는 또한 투여 당시 환자의 상태에 따라 다를 수 있다. 투용량을 결정할 때 고려할 수 있는 인자에는 치료 또는 예방의 필요성, 환자의 질병 상태의 중증도, 환자의 일반적인 건강, 연령, 중량, 성별, 식단, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합, 반응 감응성 및 요법에 대한 환자의 내성 또는 반응이 포함된다. 정확한 양은 통상적인 실험을 통해 결정할 수 있지만 궁극적으로 임상의의 판단에 달려 있을 수 있다.

투여 요법은 또한 초기 "절제 요법"에 이어 하나 이상의 후속 투여량 (예를 들어, 유지 투여량)의 형태를 취할 수 있다. 일반적으로 절제 요법은 후속 투여량 (들)보다 더 클 것이다. 예를 들어 노마코판의 경우 이는 0.6 내지 1.2 mg/kg, 그 후 0.3 내지 0.6 mg/kg 8 내지 18, 10 내지 14, 또는 11 내지 13시간 (예를 들어, 약 12시간) 이상의 절제 요법 후, 0.45 내지 0.9 mg/kg의 유지 투여량일 수 있으며, 이는 예를 들어 1일 1회 투여될 수 있다.

PAS화된 형태 (예를 들어, PAS-노마코판, 예를 들어 본 명세서의 다른 부분에서 기재된 바와 같은 적절한 요법은 6 내지 12 mg/kg (예를 들어, 600mg), 그 후 6 내지 12 mg/kg (예를 들어, 600mg) 3 내지 10, 4 내지 8, 5 내지 7, 예를 들어, 약 7일 이상의 절제 요법 후, 4 내지 8 mg/kg (예를 들어, 400mg)의 유지 투여량일 수 있으며, 이는 예를 들어 1일 1회 투여될 수 있다.

절제 투여량 또는 투여량들은 유지 투여량보다 적어도 1.5, 2 또는 5배 더 클 수 있다. 절제 투여량은 단일 투여량 또는 특정 시간대에서 1회 이상의 투여량 (예를 들어, 2회 투여량)으로 투여될 수 있다. 통상적으로, 부하 투여량은 단일 24시간 기간 (또는 연장된 반감기 형태의 경우 1주)에 투여되는 1, 2, 3, 4 또는 5회의 투여량일 것이다. 유지 투여량은 일정한 간격으로 반복되는 더 낮은 투여량일 수 있다. 유지 투여량은 12, 24 또는 48시간마다 (또는 반감기 연장 형태의 경우 매주 또는 2주마다)와 같은 간격으로 반복될 수 있다. 정확한 요법은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있지만 궁극적으로 임상의의 판단에 달려 있을 수 있다. 유지 투여량은 초기 절제 투여량의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 또는 초기 절제 투여량의 최대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%일 수 있다.

추가 실시양태에서 동일한 투여량이 치료 과정 전체에 걸쳐 사용된다 (예를 들어, 매일 또는 매일 또는 매주 2회).

바람직하게는, 노마코판 유형 단백질의 국소 투여량은 투여량당 50 내지 500 μg, 보다 바람직하게는 투여량당 100 내지 400 μg, 가장 바람직하게는 투여량당 200 내지 300 μg이다. 대안적으로, 투여량은 투여량당 500 내지 2000, 600 내지 1500, 700 내지 1250 또는 약 1250 μg일 수 있다. 융합 단백질의 경우, 투여량은 등몰량의 활성 제제를 제공하도록 선택될 수 있으며, 예를 들어, PAS-노마코판의 경우 투여량당 양의 약 4배 (예를 들어, 투여량당 400 내지 1600 μg, 가장 바람직하게는 투여량당 800 내지 1200 μg)이다. 대안적으로, 투여량은 투여량당 2000 내지 8000, 2400 내지 6000, 2800 내지 5000 또는 약 5000 μg일 수 있다.

조성물을 국소 적용하는 경우, 일반적으로 특정 수의 방울 또는 특정 길이의 연고를 안구에 적용하는 것이 지시된다. 적용 지침을 따랐을 때 정확한 투여량이 투여되도록 하기 위해 임의의 조성물에서 노마코판 유형 단백질의 농도를 조정하는 것은 당업자에게 통상적인 문제일 것이다. 예를 들어 한 방울은 일반적으로 약 40 μl이므로 0.5%w/v 노마코판 또는 L-노마코판을 포함하는 용액 한 방울에는 200 μg의 노마코판 또는 L-노마코판이 포함된다. 마찬가지로, 2%w/v의 PAS-노마코판 또는 PAS-L-노마코판을 포함하는 용액 한 방울은 800 μg의 PAS-노마코판 또는 PAS-L-노마코판을 포함할 것이다. PAS-노마코판 또는 PAS-L-노마코판은 2%w/v의 PAS-노마코판 또는 PAS-L-노마코판을 포함하는 용액과 동일한 부피의 노마코판 또는 L-노마코판의 약 4배의 분자량을 가지므로 0.5%w/v 노마코판 또는 L-노마코판을 포함하는 용액은 단백질의 노마코판 부분과 등몰량을 제공한다. 유사한 투여량의 노마코판 유형 분자를 안구내로 직접 투여하는데 사용할 수 있다. 조성물을 안구내로 직접 적용하는 경우, 예를 들어 10 내지 50 μl를 사용할 수 있다. 정확한 투여량이 투여되도록 하기 위해 임의의 조성물에서 노마코판 유형 단백질의 농도를 조정하는 것은 당업자에게 통상적인 문제일 것이다. 예를 들어 0.5%w/v 노마코판 또는 L-노마코판을 포함하는 용액 50 μl를 사용하는 경우, 여기에는 250 μg의 노마코판 또는 L-노마코판이 포함된다. 마찬가지로, 2%w/v의 PAS-노마코판 또는 PAS-L-노마코판을 포함하는 용액 한 방울은 1000 μg의 PAS-노마코판 또는 PAS-L-노마코판을 포함할 것이다.

국소 투여 또는 안구내로의 직접 투여를 위한 조성물은 또한 이의 노마코판-유형 단백질 농도의 측면에서, 예를 들어, 0.1 내지 20%w/v, 0.2 내지 15, 0.25 내지 10, 0.5 내지 5%w/v (예를 들어, 이의 PAS화된 형태의 경우 0.4 내지 80, 0.8 내지 60, 1 내지 40, 2 내지 20%w/v)로 규정될 수 있다.

약제학적 제형

상기 제제는 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체 중에 투여될 것이다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 액체이거나 담체 자체가 약제학적 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유발하지 않거나 독성 효과를 유도하지 않는 한 다른 제제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올과 같은 액체 또는 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 따라서 사용되는 약제학적 담체는 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체에 대한 철저한 논의는 [59]에서 확인할 수 있다. 바람직한 실시양태에서 상기 제제는 예를 들어, 물 또는 PBS 용액 중 액체일 수 있는 광학적으로 허용 가능한 조성물로 투여된다.

상기 제제는 선택적으로 콜로이드성 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 나노입자 또는 마이크로입자 (예를 들어, [60]에서 논의됨))을 사용하여 전달될 수 있다. 이러한 담체 시스템의 이점은 감응성 단백질의 보호, 장기간 방출, 투여 빈도의 감소, 환자의 순응도 및 제어된 혈장 수준을 포함한다.

리포솜 (예를 들어, 합성 및/또는 천연 유래의 인지질을 포함함)은 예를 들어, 20 nm 100 또는 200 마이크로미터, 예를 들어 작은 단층 소포 (25 내지 50 nm), 큰 단층 소포 (100 내지 200 nm), 거대한 단층 소포 (1 내지 2 μm) 또는 다중층 소포 (MLV, 1 μm 내지 2 μm)일 수 있다.

나노입자 (크기가 10 내지 1000 nm 범위인 콜로이드 담체)는 지질, 중합체 또는 금속으로부터 제조될 수 있다. 중합체 나노입자는 천연 또는 합성 중합체 (예를 들어, 키토산, 알지네이트, PCL, 폴리락트산 (PLA), 폴리(글리콜리드), PLGA)로 이루어질 수 있으며 나노구체 (분자가 중합체 기재에 균일하게 분포됨) 또는 나노캡슐 (중합체 막 내에 포함된 약물 분자 운반)로 생성될 수 있다.

예를 들어, 전분, 알지네이트, 콜라겐, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA), 폴리카프로락톤 (PCL)으로 이루어진 마이크로입자를 또한 사용할 수 있다.

하이드로겔은 대안적으로 또는 추가로 존재할 수 있다.

더 큰 분자량 분자의 경우, 더 많은 양 (예를 들어, 2 내지 20 ml)을 투여하기 위해, 예를 들어 융합 단백질 추가 부형제, 예를 들어 히알루로니다제를 또한 사용할 수 있다.

치료 기간

바람직하게는 치료 과정은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6년 동안 계속된다. 치료 과정은 적어도 대상체의 증상이 감소할 때까지 계속되는 것이 바람직하다. 따라서 치료 과정은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40주 동안 상기 제제의 투여 (매일, 격일마다 또는 매주)일 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

도 1a: 보체 활성화의 통상적 및 대체 경로의 개략도. starburst에 내포된 아나필라톡신 (Anaphylatoxin).

도 1b: 에이코사노이드 경로의 개략도.

도 2a: 노마코판의 1차 서열. 신호 서열에 밑줄이 그어져 있다. 시스테인 잔기는 볼드체로 표시되어 있다. 뉴클레오타이드 및 아미노산 번호는 우측에 표시되어 있다.

도 2b: 노마코판 변이체의 예

도 2c: LTB4에 결합하지만 C5 결합이 감소되거나 부재하는 노마코판 변이체의 예.

도 2d 및 도 2e: 예시적인 PAS-노마코판 (D) 및 PAS-L-노마코판 서열 (E).

도 3: 면역화 후 21일째에 국소 치료 7일 후 개별 안구 (n=12)에 대한 안저 검사 결과를 나타낸다. 막대는 SD 또는 SEM을 나타내고 양측 비모수 t 시험이 적용되었다.

도 4: 실험적 자가면역 포도막염 (EAU) 모델에서 사용된 마우스의 망막 내 세포 상의 BLT1 (LTB4 수용체) 및 C5a 수용체를 나타낸다. 본 이미지는 유리체에서 포착된 침윤 세포를 보여준다. 핵은 청색, BLT1은 녹색, C5a 수용체는 적색으로 표시된다. 두 수용체 (황색)를 모두 발현하는 세포가 존재한다. 세포는 화살표로 표시되어 있다.

도 5: 면역화 후 15일째에 처리 전 및 면역화 후 18일째에 노마코판 유형 단백질의 유리체내 투여 후 EAU 마우스의 임상 점수를 나타낸다. 질병의 안저경 평가는 개별 안구 (n=16)에 대해 15일 (치료 전) 및 22일 (치료 후)째에 수행되었다. 15일 및 18일째에 EAU 마우스에 소정의 화합물 1 내지 2 ul를 유리체내로 처리하였다. 대표적인 안저 및 해당 조직병리 이미지가 표시되고, 처리된 마우스 (각 그룹에서 n=3)의 조직학 점수를 보여주는 그래프가 요약되어 있다 (노마코판 막대는 SD 또는 SEM을 나타내고 양측 비모수 t 시험이 적용되었다.

도 6: 세포의 유세포 분석 결과를 보여준다. (A-B) EAU 마우스의 CD4+ 침윤 세포에서의 RORgt/T.bet+ 발현 (y축의 RORgt 발현 및 x축의 Tbet 발현). (C-D) CD4+ 세포에서 단독으로 RORgt+ 발현 (x축에서 RORgt 발현, y축에서 FSC-H). (E-F) CD4+ 세포에서의 단독 T.bet 발현 (x축의 T.bet 발현, y축의 FSC-H). (G-H) CD4+ 세포에서의 IL-17A 발현 (x축의 IL-17A 발현, y축의 FSC-H). 도 6b, 도 6d, 도 6f 및 도 6h 각각에서, 각 페이지의 상단 행은 식염수 처리된 EAU 마우스에 대한 것이고, 두 번째 행은 노마코판 처리된 마우스에 대한 것이고, 세 번째 행은 PAS-노마코판 처리된 마우스에 대한 것이고, 네 번째 행은 PAS-L-노마코판 처리된 마우스에 대한 것이고, 다섯 번째 행은 덱사메타손 처리된 마우스에 대한 것이다. 도 6a, 도 6c, 도 6e, 도 6g는 각 발현 수준의 그래프를 요약한 것을 보여준다. 막대는 SEM을 나타낸다. 그래프는 각 그룹에서 8마리 마우스의 평균을 보여준다 (DEX n=6).

도 7: (A) B10.RIII 마우스를 사용한 실험적 자가면역 포도막염 (EAU)의 마우스 모델의 망막 조직에서 VEGF 수준을 나타낸다. 마우스 그룹에 노마코판 (noma), PAS-노마코판 (PAS-noma), 항-VEGF 항체 (항-VEGF) 또는 식염수를 유리체내로 처리하였다. 유도 후 21일째에 망막 조직을 수확하였다. 유도되지 않고 처리되지 않은 건강한 마우스를 수동 대조군 ("건강한 ct")으로 사용하였다. 유리체내 주사 그룹당 6마리의 마우스와 유도되지 않고 처리되지 않은 2마리의 마우스 ("건강한 ct")가 사용되었다. 망막 조직을 ELISA 분석을 사용하여 VEGF 수준에 대해 분석하였다. 모든 분석은 이중 반복 실험의 샘플에 대해 2회 수행되었다. (B) 면역화 후 15일째 처리 전 및 면역화 후 18일째에 노마코판 유형 단백질의 유리체내 투여 후 EAU 마우스의 임상 점수를 나타낸다. 평가는 15일 및 26일째에 수행되었다. (C) 누적된 임상 점수를 보여준다.

실시예

실시예 1 내지 3의 재료 및 방법

EAU 유도

미코박테리움 누버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) (Difco, Voigt Global Distribution, Lawrence, KS)가 보충된 완전 Freud 애주번트 (Adjuvant) (CFA, Sigma-Aldrich, Gillingham, U.K.)로 유화된 PBS 중 광수용체 사이 레티노이드-결합 단백질 (IRBP) 161 내지 180 펩타이드 (SGIPYIISYLHPGNTILHVD, Cambridge Peptides, Cambridge, U.K.) 300 μg으로 C57/Bl6 마우스 (암컷, 5 내지 7주령, Charles River)를 피하 면역화함으로써 [61]에 이전에 기재된 바와 같이 EAU를 유도하였다. 마우스에 또한 0.4 μg의 퍼투시스 (pertussis) (Sigma-Aldrich)를 복강내 제공하였다.

치료

이전 연구[62]에 따라 망막 염증을 14일째부터 점수 책정시까지 모니터링하였다 (14일째에 망막 안저경 검사에 의해 평가된 바와 같이 망막 염증이 검출된 경우에만 마우스가 연구에 포함됨). 마우스를 1, 2 및 5일째에 수확하였다 (그룹당 n=6).

유리체내 투여를 위해, 마우스를 면역화 후 15 및 18일째에 1 내지 2 μl 노마코판 (5 mg/ml), PAS-노마코판 (20 mg/ml), PAS-L-노마코판 (20 mg/ml), 덱사메타손 또는 식염수로 처리하였다. 국소 투여를 위해 마우스를 2 내지 5 μl의 노마코판 (5 mg/ml), PAS-노마코판 (20 mg/ml), L-노마코판 (5 mg/ml), 덱사메타손 (Maxidex; DEX) 또는 식염수로 7일간 1일 2회 처리하였다. 질병 진행을 치료 전 및 후에 망막 안저경 검사에 의해 임상적으로 등급화하고 조직학적 점수를 책정하였다.

EAU 점수화

마우스를 정기적인 안저 관찰 (예를 들어, Micron III 안저 카메라 (Phoenix Research Labs, Pleasanton, CA) 사용)에 의해 EAU의 징후에 대해 이전에 기재된 바와 같이 정기적으로 평가하였다. 임상 점수는 망막 시신경유두, 망막 혈관, 망막 조직 침윤 및 구조적 손상의 관찰을 기반으로 하였다.

각 마우스의 한쪽 안구를 실험 종료 시 수확하고 조직학적 점수화를 위해 고정 및 포매하였다 (예를 들어, 적출하여 1시간 동안 4% 글루타르알데하이드에서 고정하고 적어도 24시간 동안 10% 포름알데히드로 이동하고, 포매하여, H&E 염색을 위해 처리한 후 조직학적으로 검사함). 이전에 기재한 바와 같이 면역 세포 침윤 수준 및 망막 손상 정도를 기반으로 하여 EAU 점수의 기준에 따라 0 내지 5의 척도로 점수를 책정하였다[63]. 단핵구, 호중구 및 T 세포 침윤에 대한 면역형광 염색을 수행하여 침윤 세포 집합의 변화를 확인할 수 있다.

망막 유세포 분석을 위해, 망막 층을 수집하고, 잘게 썰고, 여과하고, 생체외 자극 (4시간)을 위한 배지에 재현탁하고, 세포 표면 및 세포내 마커에 대해 염색하였다[64].

실시예 1 노마코판 유형 단백질의 국소 투여에 의한 EAU의 치료

도 3에 나타낸 바와 같이, 노마코판 (5 mg/ml), PAS-노마코판 (20 mg/ml), L-노마코판 (5 mg/ml)의 국소 투여 후 EAU 마우스의 임상 점수는 식염수만으로 처리된 마우스에 비해 더 낮았고, 결과는 L-노마코판에 대해 통계적으로 유의하였다. 노마코판 및 PAS-노마코판 처리된 마우스에 대한 경향이 관찰되었다. L-노마코판 처리 마우스의 임상 점수는 덱사메타손 처리 마우스의 임상 점수와 일치하였다. 식염수 대조군 (10.33 ± 0.666; n=12; P=0.048) 대비 평균 점수±SEM; 8.083±0.848; n=12) 처리된 마우스에서 CD4+T 세포 수 또는 하위유형에 유의한 변화가 없었다.

이러한 결과는 시험 분자가 각막을 통과할 수 있다는 것이 이전에 알려지지 않았기 때문에 놀라운 것이다. 비PAS화된 형태과 비교하여 PAS-노마코판의 감소된 효능은 PAS화된 형태가 더 크다는 사실을 반영할 수 있다.

실시예 2 마우스 망막 세포에서 BLT1 및 C5a 수용체의 동시발현

DAPI로 대조염색된 BLT1 및 C5a 수용체를 인식하는 단일클론 항체를 사용한 UAE 마우스의 마우스 망막 절편의 공초점 현미경 (청색에서 표시된 핵까지)은 염증 세포에서 발현된 두 수용체를 모두 보여준다. 일부 개별 세포는 두 수용체를 동시에 발현하며, 많은 단일 수용체-발현 세포가 또한 관찰되었다. 세포의 적어도 일부는 LTB4 자극에 반응하여 VEGF를 방출하는 망막 손상 영역으로 이동하는 것으로 공지된 M2 대식세포인 것으로 여겨진다 (도 4, 도 7 및 실시예 4 참조).

이는 노마코판-유형 단백질이 이러한 질병 (예를 들어, LTB4 관련 및/또는 보체 경로 관련 질병)의 치료에 유용한 제제일 수 있다는 본 명세서에 제시된 다른 결과와 일치한다.

실시예 3 노마코판 유형 단백질의 유리체내 투여에 의한 EAU의 치료

도 5에 나타낸 바와 같이, 15 및 18일째에 노마코판 유형 단백질의 유리체내 투여 (노마코판 (5 mg/ml), PAS-노마코판 (20 mg/ml), PAS-L-노마코판 (20 mg/ml)를 각각 1-2 μl의 부피로 EAU 마우스에 투여한 후, 22일째에 관찰된 임상 점수는 일반적으로 대조군 (식염수 처리) 마우스보다 더 낮았고, 두 시점 (15일 및 22일) 사이의 임상 점수 증가는 대조군 (식염수 처리) 마우스보다 처리된 마우스에서 더 낮았다. PAS-노마코판은 식염수 대조군 (12.36±1.014; n=16; P= 0.0001)에 비해 임상 점수 (평균 점수±SEM; 3.813±1.014; n=16)에 의해 결정된 바와 같이 유리체내 투여 후 질병 진행을 완화시켰다.

도 5는 또한 다양한 치료에 대한 종합 조직학적 점수를 보여준다. 다시 대조군 (식염수 처리) 마우스와 비교하여 노마코판 유형 분자 각각으로 처리한 후 임상 점수가 더 낮았고, 대조군 (식염수 처리) 마우스 복합 조직학적 점수와 PAS-L-노마코판 (20 mg/ml) 처리된 마우스의 종합 조직학적 점수 사이의 차이가 통계적으로 유의하였다.

예로서, 또한 도 5에 도시된 바와 같이, 망막 접힘 (복합 조직학적 점수의 성분 중 하나)은 PAS-L-노마코판 (20 mg/ml) 처리된 마우스에서와 비교하여 대조군 (식염수 처리된) 마우스에서 시각적으로 매우 상이하다.

이들 데이터는 처음으로 노마코판-유형 단백질이 유리체내로 주사될 때 생물활성이 있음을 확인시켜준다 (즉, 이들이 맥락막 내에 존재하는 세포에 영향을 미치기 위해 Bruch 구성원 및/또는 내부 제한 막을 투과하는 능력이 있음을 보여줌). 이는 람팔리주맙 (Lampalizumab)과 같이 안과 치료용으로 시험된 다른 단백질 분자와 상이하다[65].

EAU 마우스에서 CD4+ 침윤 세포에서의 RORgt/T.bet+ 발현을 또한 유세포 분석에 의해 분석하였다 (CD4+ 세포에서 RORgt/T.bet 세포의 백분율을 나타내는 (y축은 RORgt 발현이고 x축은 Tbet 발현임) 도 6a 및 도 6b 참조). RORgt 및 Tbet은 Th17 세포 유형 및 IL-17 발현과 관련된 T 세포 마커이다. EAU 마우스의 CD4+ 침윤 세포에서 RORgt/T.bet+ 발현 세포의 백분율은 대조군 (식염수 처리) 마우스보다 노마코판 유형 단백질 처리 마우스에서 더 낮았다. PAS-노마코판 (20 mg/ml) 처리된 마우스의 수준은 가장 낮았고 이들 마우스와 대조군 (식염수 처리) 마우스의 수준 간의 차이는 통계적으로 유의하였다. 또한 2회 유리체내 처리 (15일 및 18일) 후 식염수 대조군 (21.28±3.544, n=8, P=0.003)과 비교하여 PAS-노마코판-처리 EAU 마우스에서 망막 이중 양성 Th1/Th17 (RORγt+T-bet+) 세포 (4.717±2.627; n=8)에서 유의한 감소가 관찰되었고, 다른 T 세포 하위 세트의 발현 수준에는 유의한 차이가 없었다 (데이터는 표시되지 않음).

RORgt+ 발현 단독 및 T.bet 발현 단독을 또한 이들 세포에서 분석하였다 (도 6c 내지 도 6f 참조).

IL-17A 발현을 또한 이들 세포에서 분석하였다 (도 6g 내지 도 6h 참조). 식염수 대조군 (27.47±3.461; n=8, P=0.02 및 0.0007) 대비 노마코판 및 PAS-노마코판 처리 그룹 (각각 평균%±SEM; 14.67±3.534 및 7.019±3.005, n=8)에서 Th17 (IL-17A+CD4+) 세포의 감소가 검출되었다.

실시예 4 EAU 마우스에서의 VEGF 수준 및 노마코판 유형 단백질의 유리체내 투여 치료

재료 및 방법

EAU 유도

B10.RIII 마우스 (암컷, 5 내지 7주령, 사육장내에서 사육한 집락)를 300 μg의 광수용체간 레티노이드 결합 단백질 (IRBP) 161 내지 180 펩타이드 (SGIPYIISYLHPGNTILHVD)로 피하 면역화하여 EAU를 유도하였다. EAU에 대한 적절한 프로토콜은 [61]에 설정되어 있으며, PBS 중 IRBP (Cambridge Peptides, Cambridge, U.K.)를 미코박테리움 투버쿨로시스 (Difco, Voigt Global Distribution, Lawrence, KS)가 보충된 완전 Freud 애주번트 (CFA, Sigma-Aldrich, Gillingham, U.K.)로 유화하였다. 이 프로토콜에서 또한 마우스에 퍼투시스 (Sigma-Aldrich) 0.4 μg을 복강내 제공하였다.

치료 및 VEGF 측정

초기 실험에서, VEGF 수준을 결정하기 위해 유도 후에 망막 조직을 수확하였다. 망막 조직을 ELISA 분석을 사용하여 VEGF 수준에 대해 분석하였다.

후속 실험에서, 유도 후 21일째에 망막 조직을 수확하였다. 유도 후 15일 및 18일째에 마우스 그룹에 1 내지 2 μl 노마코판 (5 mg/ml), L-노마코판 (5 mg/ml) PAS-노마코판 (20 mg/ml), PAS-L-노마코판 (20 mg/ml), 항-VEGF 항체 (50 μg/ml) BioLegend (Ultra-Leaf 정제된 항-마우스 VEGF A 항체) 또는 식염수를 유리체내로 처리하였다. 유도되지 않고 처리되지 않은 건강한 마우스를 수동 대조군 ("건강한 ct")으로 사용하였다. 유리체내 주사 그룹당 6마리의 마우스와 2마리의 비-유도되고 처리되지 않은 건강한 마우스 ("건강한 ct")를 사용하였다. R&D (Mouse Quantikine ELISA)의 마우스 VEGF에 의한 ELISA 분석을 사용하여 망막 조직을 VEGF 수준에 대해 분석하였다. 모든 분석은 이중 반복 실험 샘플에 대해 2회 수행하였다.

결과

이들 그룹의 망막 조직에서 VEGF 수준은 도 7a에 제시되어 있다. 초기 실험에서 IRBP에 의한 유도는 정상 대조군 (데이터는 표시되지 않음)과 비교하여 VEGF 수준의 유의한 증가를 초래하였다. "식염수"를 "건강한 CT"와 비교할 때 도 7a에서도 증가를 볼 수 있다.

도 7a는 PAS-노마코판이 이러한 EAU 모델에서 망막 VEGF 농도를 감소시키는데 있어서, 항-VEGF 항체만큼 효과적이라는 것을 보여준다. 노마코판 및 그 변이체가 VEGF에 임의의 직접적인 영향을 미치는 것으로 공지되어 있지 않기 때문에 VEGF 수준의 감소는 이 모델에서 VEGF의 주요 공급원으로 추정되는 M2 대식세포의 LTB4 기반 활성화를 억제하는 간접적인 효과로 생각된다[35].

L-노마코판 및 PAS-L-노마코판을 또한 시험하였으며, L 노마코판에 대한 이용가능한 결과는 결정적이지 않았다. 결정적이지 않은 결과는 실험 오류의 결과로 생각되어 본 명세서에 표시하지 않는다.

노마코판-유형 단백질에 의한 호중구로부터 LTB4의 제거는 또한 망막에서 말초혈로의 LTB4 농도 구배를 감소시켜 염증 세포 이동을 감소시키고 Th-17 세포 (실시예 3에 나타낸 바와 같음) 및 대식세포의 활성화를 억제하는 효과가 있는 것으로 생각된다. 보체 C5에 대한 노마코판 및 PAS-노마코판의 억제 효과를 통한 보체 C5a 및 막 공격 복합체의 추가 감소는 또한 C5a 농도 구배를 감소시키고 Th 세포, 호중구 및 단핵/대식세포를 포함하는 염증 세포의 활성화를 감소시킴으로써 VEGF의 제2 방출을 추가로 감소시킬 수 있다. 호중구의 이동을 감소시키면 방출에 사용할 수 있는 LTB4의 양을 또한 감소시킬 수 있다.

도 7b 및 도 7c에 나타낸 바와 같이 임상 점수를 책정하였다.

항-VEGF 항체는 이 모델에서 염증에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았으며 염증의 억제가 특정 시험 분자에서 관찰되었다.

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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nomacopan variant 1 <400> 22 Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln 1 5 10 15 Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp 20 25 30 Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln 35 40 45 Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp 50 55 60 Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala 65 70 75 80 Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln 85 90 95 Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr 100 105 110 Glu Gln Trp Gln Ser Asn Gly Ser Ala Asp Asp Lys Glu Val Glu Cys 115 120 125 Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr 130 135 140 Pro His Leu Lys Asp Cys 145 150 <210> 23 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nomacopan variant 2 <400> 23 Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln 1 5 10 15 Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp 20 25 30 Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln 35 40 45 Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp 50 55 60 Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala 65 70 75 80 Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln 85 90 95 Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr 100 105 110 Glu Met Trp Gln Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ala Val Glu Val Glu Cys 115 120 125 Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr 130 135 140 Pro His Leu Lys Gly Cys 145 150 <210> 24 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nomacopan variant 3 <400> 24 Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln 1 5 10 15 Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp 20 25 30 Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln 35 40 45 Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp 50 55 60 Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala 65 70 75 80 Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln 85 90 95 Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr 100 105 110 Glu Met Trp Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asp Glu Val Glu Val Glu Cys 115 120 125 Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr 130 135 140 Pro His Leu Lys Gly Cys 145 150 <210> 25 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nomacopan variant 4 <400> 25 Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln 1 5 10 15 Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp 20 25 30 Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln 35 40 45 Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp 50 55 60 Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala 65 70 75 80 Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln 85 90 95 Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr 100 105 110 Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys 115 120 125 Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr 130 135 140 Pro His Leu Lys Asp Cys 145 150 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence <400> 26 Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence of nomacopan variant 1 <400> 27 Gln Trp Gln Ser Asn Gly Ser Ala Asp Asp Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence of nomacopan variant 2 <400> 28 Met Trp Gln Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ala Val 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence of nomacopan variant 3 <400> 29 Met Trp Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asp Glu Val 1 5 10 <210> 30 <211> 751 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAS-nomacopan <400> 30 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 35 40 45 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 50 55 60 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 65 70 75 80 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 85 90 95 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 100 105 110 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 115 120 125 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 130 135 140 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 145 150 155 160 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 165 170 175 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 180 185 190 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 195 200 205 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 210 215 220 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 225 230 235 240 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 245 250 255 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 260 265 270 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 275 280 285 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 290 295 300 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 305 310 315 320 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 325 330 335 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 340 345 350 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 355 360 365 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 370 375 380 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 385 390 395 400 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 405 410 415 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 420 425 430 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 435 440 445 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 450 455 460 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 465 470 475 480 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 485 490 495 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 500 505 510 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 515 520 525 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 530 535 540 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 545 550 555 560 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 565 570 575 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 580 585 590 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr 595 600 605 Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu 610 615 620 Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu 625 630 635 640 Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met 645 650 655 Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe 660 665 670 Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln 675 680 685 Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp 690 695 700 Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp Ala 705 710 715 720 Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu 725 730 735 Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys 740 745 750 <210> 31 <211> 751 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAS-L-nomacopan <400> 31 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 35 40 45 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 50 55 60 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 65 70 75 80 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 85 90 95 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 100 105 110 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 115 120 125 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 130 135 140 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 145 150 155 160 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 165 170 175 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 180 185 190 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 195 200 205 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 210 215 220 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 225 230 235 240 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 245 250 255 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 260 265 270 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 275 280 285 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 290 295 300 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 305 310 315 320 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 325 330 335 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 340 345 350 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 355 360 365 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 370 375 380 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 385 390 395 400 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 405 410 415 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 420 425 430 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 435 440 445 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 450 455 460 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 465 470 475 480 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 485 490 495 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 500 505 510 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 515 520 525 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 530 535 540 Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 545 550 555 560 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 565 570 575 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 580 585 590 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr 595 600 605 Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu 610 615 620 Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu 625 630 635 640 Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met 645 650 655 Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe 660 665 670 Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln 675 680 685 Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp 690 695 700 Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Gln Ser Asp Ala 705 710 715 720 Gly Ala Asp Ala Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu 725 730 735 Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys Gly Cys 740 745 750 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP) <400> 32 Ser Gly Ile Pro Tyr Ile Ile Ser Tyr Leu His Pro Gly Asn Thr Ile 1 5 10 15 Leu His Val Asp 20

Claims

대상체의 증식성 망막 질병 (proliferative retinal disease)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물(functional equivalent)인 제제(agent)의 치료 또는 예방적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제제.
대상체의 증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물을 인코딩(encoding)하는 핵산 분자인 제제의 치료 또는 예방적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
증식성 망막 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물을 인코딩하는 핵산 분자인 제제.
제1항 또는 제3항에 있어서; 또는 제2항 또는 제4항에 있어서, 제제는 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168의 서열을 포함하는 단백질이거나 이를 인코딩하고, 최대 50개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 이루어지고,
단백질은 C5에 결합하여 전환효소에 의해 보체(complement) C5가 보체 C5a 및 보체 C5b로 절단되는 것을 방지하고 LTB4에 결합하고,
서열번호 4에 제시된 성숙 노마코판 (mature Nomacopan) 분자의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150의 6개의 시스테인 아미노산 각각이 유지되고 LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각 및 C5 결합 잔기 세트의 적어도 5, 10 또는 15 또는 20개 또는 각각이 유지되거나 보존적 변형에 적용되고,
LTB4 결합 잔기는 Phe18, Tyr25, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, His99, His101, Asp103, 및 Trp115 (서열번호 4에 따른 넘버링(numbering))이고, C5 결합 잔기는 Val26, Val28, Arg29, Ala44, Gly45, Gly61, Thr62, Ser97, His99, His101, Met 114, Met 116, Leu117, Asp118, Ala119, Gly120, Gly121, Leu122, Glu123, Val124, Glu125, Glu127, His146, Leu147 및 Asp 149 (서열번호 4에 따른 넘버링)인, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제5항에 있어서, 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개의 LTB4 및 C5 결합 잔기는 보존적 변형에 적용되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제5항 또는 제6항에 있어서, LTB4 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15개 또는 각각 및 C5 결합 잔기의 적어도 5, 10 또는 15 또는 20개 또는 각각이 유지되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 LTB4 결합 잔기 및 각각의 C5 결합 잔기가 유지되거나 보존적 변형에 적용되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 LTB4 결합 잔기 및 각각의 C5 결합 잔기가 유지되거나 보존적 변형에 적용되고, 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개의 C5 및/또는 LTB4 결합 잔기는 보존적 변형에 적용되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 LTB4 결합 잔기 및 각각의 C5 결합 잔기가 유지되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 또는 제3항에 있어서; 또는 제2항 또는 제4항에 있어서, 제제는 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168의 서열과 적어도 80% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 서열을 포함하는 단백질이거나 이를 인코딩하고,
상기 단백질은
(i) C5에 결합하여 전환효소에 의해 보체 C5가 보체 C5a 및 보체 C5b로 절단되는 것을 방지하고 LTB4에 결합하거나,
(ii) LTB4에 결합하지만, C5-결합 활성이 감소되거나 부재하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168의 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단백질이거나 이를 인코딩하고
상기 단백질은
(i) C5에 결합하여 전환효소에 의해 보체 C5가 보체 C5a 및 보체 C5b로 절단되는 것을 방지하고 LTB4에 결합하거나,
(ii) LTB4에 결합하지만, C5-결합 활성이 감소되거나 부재하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제11항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제11항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단백질이거나 이를 인코딩하고,
상기 단백질은
(i) C5에 결합하여 전환효소에 의해 보체 C5가 보체 C5a 및 보체 C5b로 절단되는 것을 방지하고 LTB4에 결합하거나,
(ii) LTB4에 결합하지만, C5-결합 활성이 감소되거나 부재하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 LTB4 결합 활성을 나타내고 C5 결합이 감소되거나 부재하는 단백질이거나 이를 인코딩하고, 상기 단백질은 1 내지 30개의 아미노산 치환이 이루어지는 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어지고,
(i) 서열번호 4의 위치 114 내지 124에서 다음 치환 (a) 내지 (j) 중 하나 이상이 이루어지고:
a. Met114는 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;
b. Met116은 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;
c. Leu117은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, 또는 Pro로 대체되고;
d. Asp118은 Asn, Gln, Arg, Lys, Gly, Ala, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Met Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;
e. Ala119는 Gly, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되고;
f. Gly120은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되고;
g. Gly121은 Ala, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되고;
h. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Ala, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His로 대체되고;
i. Glu123은 Asp, Ala, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr로 대체되고;
j. Val124는 Lys, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr로 대체되고/거나;
(ii) 서열번호 4의 Ala44는 Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항, 제11항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항, 제11항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고,
a. Met116은 Gln, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Gln으로 대체되고;
b. Leu117은 Ser, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Gly, Ala, 또는 Pro, 바람직하게는 Ser로 대체되고;
c. Gly121은 Ala, Asp, Asn, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Ala로 대체되고;
d. Leu122는 Asp, Glu, Asn, Ala, Gln, Arg, Lys, Pro, 또는 His, 바람직하게는 Asp로 대체되고;
e. Glu123은 Asp, Ala, Gln, Asn, Arg, Lys, Gly, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr, 바람직하게는 Ala 또는 Asp로 대체되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항, 제11항 또는 제14항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항, 제11항 또는 제14항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 또는 제15항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고,
서열번호 4의 위치 114 내지 124에서:
a. Met116은 Gln으로 대체되고;
b. Leu117은 Ser로 대체되고;
c. Gly121은 Ala로 대체되고;
d. Leu122는 Asp로 대체되고;
e. Glu123은 Ala로 대체되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, Trp 115는 치환되지 않은, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, Met114, Trp 115, Asp118, Ala119, Gly120 및 Val124는 치환되지 않은, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항 또는 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 서열번호 28에 제시된 서열번호 4의 아미노산 위치 114 내지 124의 루프 서열을 갖고 서열번호 23에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 1 내지 20개의 추가 치환을 갖는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 서열번호 23에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 2 내지 15개의 추가 치환을 갖는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 이는 서열번호 23에 제시된 것 외에 서열번호 4와 비교하여 3 내지 10개의 추가 치환을 갖는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 서열번호 4의 Ala44는 Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, Lys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, Pro, 또는 His로 대체되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 서열번호 4의 Asp149는 Gly, Gln, Asn, Ala, Met, Arg, Lys, Leu, Ser, Ile, Phe, Tyr, Pro, His, 또는 Thr로 대체되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 서열번호 4의 Ala44는 Asn으로 대체되고 서열번호 4의 Asp149는 Gly로 대체되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 서열번호 4의 위치 6, 38, 100, 128, 129, 150의 6개의 시스테인 아미노산이 비변형 형태(unmodified form)로 유지되는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 다음 아미노산 Phe18, Tyr25, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, His99, His101, Asp103, 및 Trp115 중 하나 이상은 치환되지 않은, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고, 다음 아미노산 Phe18, Tyr25, Arg36, Leu39, Gly41, Pro43, Leu52, Val54, Met56, Phe58, Thr67, Trp69, Phe71, Gln87, Arg89, His99, His101, Asp103, 및 Trp115 모두 치환되지 않은, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항, 제11항 또는 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질이거나 이를 인코딩하고,
a. 서열번호 4의 아미노산 5, 6, 11, 13 내지 15, 20 내지 21, 24 내지 27, 29 내지 32, 35 내지 41, 45, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 69 내지 81, 83, 84, 86, 90 내지 94, 97 내지 104, 112 내지 113, 115, 125 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150은 치환되지 않거나;
b. 서열번호 4의 아미노산 5, 6, 11, 13 내지 15, 18, 20 내지 21, 24 내지 27, 29 내지 32, 35 내지 41, 43, 45, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 67, 69 내지 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90 내지 94, 97 내지 104, 112 내지 113, 115, 125 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150은 치환되지 않거나;
c. 서열번호 4의 아미노산 5, 6, 11, 13 내지 15, 18, 20 내지 21, 24 내지 25, 27, 30 내지 32, 35 내지 41, 43, 47 내지 48, 50, 52 내지 60, 64, 66, 67, 69 내지 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90 내지 94, 98, 100, 102 내지 104, 112 내지 113, 115, 126, 128 내지 129, 132 내지 139, 145, 148, 및 150은 치환되지 않은, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 (i) 서열번호 2, (ii) 서열번호 22, (iii) 서열번호 23, (iv) 서열번호 24 또는 (v) 서열번호 25의 아미노산 19 내지 168의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이거나 이를 인코딩하고,
바람직하게는 제제는 서열번호 2, 또는 서열번호 23의 아미노산 19 내지 168의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이거나 이를 인코딩하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항, 제5항 내지 제13항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항, 제5항 내지 제13항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이거나 이를 인코딩하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제14항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 서열번호 22 (변이체 1)를 포함하거나 이로 이루어진 단백질이거나 이를 인코딩하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제14항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제14항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 서열번호 23 (변이체 2)를 포함하거나 이로 이루어진 단백질이거나 이를 인코딩하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제14항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제14항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 서열번호 24 (변이체 3)를 포함하거나 이로 이루어진 단백질이거나 이를 인코딩하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항, 제3항 또는 제14항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제2항, 제4항 또는 제14항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 서열번호 25 (변이체 4)를 포함하거나 이로 이루어진 단백질이거나 이를 인코딩하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서; 또는 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 제1항, 제2항 또는 제5항 내지 제35항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 단백질의 단편이거나 이를 인코딩하고, 단백질은
(i) C5에 결합하여 전환효소에 의해 보체 C5가 보체 C5a 및 보체 C5b로 절단되는 것을 방지하고 LTB4에 결합하거나,
(ii) LTB4에 결합하지만, C5-결합 활성이 감소되거나 부재하는, 방법; 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질의 기능적 균등물은 (a) 제5항 내지 제35항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같거나 제36항에 규정된 바와 같은 단편으로 이루어진 서열, 및 (b) 제2 서열을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 융합 단백질은
(i) C5에 결합하여 전환효소에 의해 보체 C5가 보체 C5a 및 보체 C5b로 절단되는 것을 방지하고 LTB4에 결합하거나,
(ii) LTB4에 결합하지만, C5-결합 활성이 감소되거나 부재하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제37항에 있어서, 상기 제2 서열은 PAS 서열인, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 융합 단백질은 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (서열번호 15); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (서열번호 16); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (서열번호 17), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (서열번호 18), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (서열번호19), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (서열번호 20) 및 ASAAAPAAASAAASAPSAAA (서열번호 21) 중 하나의 다수의 카피(copy), 바람직하게는 서열번호 15 내지 21 중 하나의 20 내지 30 또는 30개의 카피를 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 (a) (i) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 19 내지 168, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 아미노산 19 내지 168로 이루어진 단백질을 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제40항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 15의 30개의 카피로 이루어진 PAS 서열을 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 30을 포함하거나 이로 이루어진, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 31을 포함하거나 이로 이루어진, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 안구에 국소 투여되거나 안구내로 직접 투여되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 안구에 국소 투여되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 안구내로, 예를 들어 유리체내로 또는 맥락막상으로 직접 투여되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 망막 질병은 자가면역 포도막염 (autoimmune uveitis), 감염성 포도막염 (infective uveitis), 습성 연령 관련 황반 변성 (wet age-related macular degeneration) (맥락막 혈관신생 (choroidal neovascularisation)), 건성 연령 관련 황반 변성 (dry age-related macular degeneration ) (지도모양 위축 (geographic atrophy)), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨병성 황반 부종 (diabetic macular oedema), 시신경염 (optic neuritis) (예를 들어, 녹내장 관련 시신경염 (glaucoma associated optic neuritis)), 망막 정맥 폐쇄 (retinal vein occlusion) 및 미숙아 망막병증 (retinopathy of prematurity), 바람직하게는 자가면역 포도막염으로부터 선택되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법은 제2 증식성 망막 질병 치료의 투여를 추가로 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제49항에 있어서, 제2 증식성 망막 질병 치료제는 항-염증 약제, 면역조절 요법 (IMT) 약물, 생물학적 반응 조절제 (BRM) 약물, 항-VEGF 치료제 및 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제2 제제로부터 선택되는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제50항에 있어서,
(a) 항-염증 약제는 코르티코스테로이드 (corticosteroid)와 같은 스테로이드 (steroid)이고,
(b) IMT 약물은 메토트렉세이트, 아자티오프린 또는 미코페놀레이트로부터 선택되고,
(c) BRM 약물은 항 TNF 제제, 예를 들어 항-TNF알파 항체 또는 이의 단편, 예컨대 인플릭시맙 (infliximab) 또는 아달리무맙 (adalimumab)이고,
(d) 항-VEGF 치료제는 항-VEGF-A 항체 또는 이의 단편, 예컨대 베바시주맙 (Bevacizumab) (Avastin) 또는 라니비주맙 (ranibizumab) (Lucentis), 항-VEGF 앱타머(aptamer), 예컨대 페갑타닙 (Macugen) 또는 또 다른 항-VEGF 길항제 예컨대 아플리버셉트 (aflibercept) (Eylea)이고,
(e) 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하는 단백질 또는 이러한 단백질의 기능적 균등물인 제2 제제는 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법은 제5항 내지 제36항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 제제를 안구에 국소 투여하고, 안구 내로, 예를 들어 유리체내로 또는 맥락막상으로 제2 증식성 망막 질병 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제52항에 있어서, 제2 증식성 망막 질병 치료제는 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 융합 단백질인 제제인, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제52항 또는 제53항에 있어서, 본 방법은 제5항 내지 제31항 또는 제36항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 제제를 안구에 국소 투여하고, 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 융합 단백질인 제제인 제2 증식성 망막 질병 치료제를 안구 내로 직접 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제제 및 상기 융합 단백질은 각각 C5에 결합하여 전환효소에 의해 보체 C5가 보체 C5a 및 보체 C5b로 절단되는 것을 방지하고 LTB4에 결합하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제54항에 있어서, 본 방법은 도 2 (서열번호 2)의 아미노산 서열의 아미노산 19 내지 168을 포함하거나 이로 이루어진 단백질을 안구에 국소 투여하고, 제42항의 융합 단백질을 안구 내로 직접 투여하는 단계를 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제52항 또는 제53항에 있어서, 본 방법은 제5항 내지 제30항 또는 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 제제를 안구에 국소 투여하고 제37항 내지 제41항 또는 제43항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 융합 단백질인 제제인 제2 증식성 망막 질병 치료제를 안구 내로 직접 투여하는 단계를 포함하고 상기 제제 및 상기 융합 단백질은 각각 LTB4에 결합하지만 C5 결합 활성이 감소되거나 부재하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제56항에 있어서, 본 방법은 제32항에 규정된 바와 같은 단백질을 안구에 국소 투여하고, 제43항의 융합 단백질을 안구 내로 직접 투여하는 단계를 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제52항에 있어서, 본 방법은 제5항 내지 제30항 또는 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 제제를 안구에 국소 투여하고, 항-VEGF 치료제인 제2 증식성 망막 질병 치료제를 안구 내로 직접 투여하는 단계를 포함하는, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.
제58항에 있어서, 상기 항-VEGF 치료제는 항-VEGF-A 항체 또는 이의 단편, 예컨대 베바시주맙 (Avastin) 또는 라니비주맙 (Lucentis), 항-VEGF 앱타머 예컨대 페갑타닙 (Macugen) 또는 또 다른 항-VEGF 길항제 예컨대 아플리버셉트 (Eylea)인, 방법, 또는 사용하기 위한 제제.