CN114062676A - 一种用于防伪的抗体试剂缓冲液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于防伪的抗体试剂缓冲液及其应用，包括带有荧光基团能够进行AI判读防伪的荧光缓冲液，所述荧光缓冲液包括通用性抗体稀释液以及稀释于通用性抗体稀释液中的混合溶剂，通过所述混合溶剂与通用性抗体稀释液混合后，并经过波长为633nm的激发光激发即能获得波长为710nm且荧光信号均匀稳定的荧光基团，通过配制由四种组分混合形成的荧光缓冲液，荧光基团的荧光信号分布均匀、强度稳定、不易淬灭；本发明采用一种全新的试剂防伪方法，和软件联用可以快速、准确地判定试剂的真伪情况，减少不合格试剂对于病理诊断的影响，降低病理医生误诊率，增加荧光染色不改变可见光免疫组化的染色结果，此种防伪方法的准确度达99%以上。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断相关技术领域，具体涉及一种用于防伪的抗体试剂缓冲液及其应用。
背景技术
免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对病理组织中相应抗原进行定性、定位或定量测定的一项免疫学检测技术。通过免疫组织化学染色可确定病理组织细胞类型和形态、辨认组织细胞产物的来源、确定组织细胞的分化程度；尤其在临床病理中的应用最为重要，如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后；辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等，被誉为疾病诊断的“金标准”。
但是由于免疫组化实验原理复杂，实验步骤较多，不同等级的病理医生判读水平参差不齐，多种因素会导致病理科判读错误，误诊率偏高。目前以迪英加为主的病理AI公司积极引入AI技术辅助病理诊断。但是由于训练的AI程序和对应试剂需要完全绑定才能做出准确的诊断，在病理科实际的操作中，经常出现使用其他品牌非AI对应试剂进行免疫组化实验，染色结果使用AI判读出现错误判读的情况。由于不同品牌、不同种属来源的抗体试剂（包括一抗、二抗）在组织上的染色颜色（棕色和蓝色）完全一致，AI判读程序无法通过染色情况分辨实验中使用的试剂是否属于对应试剂。这种情况即会进一步导致病人的肿瘤诊断误诊率持续偏高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于防伪的抗体试剂缓冲液及其应用，以解决上述背景技术中提出的AI判读出现错误判读与无法通过染色情况分辨实验中使用的试剂是否属于对应试剂的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于防伪的抗体试剂缓冲液，包括带有荧光基团能够进行AI判读防伪的荧光缓冲液，所述荧光缓冲液包括通用性抗体稀释液以及稀释于通用性抗体稀释液中的混合溶剂，通过所述混合溶剂与通用性抗体稀释液混合后，并经过波长为633nm的激发光激发即能获得波长为710nm且荧光信号均匀稳定的荧光基团，所述混合溶剂包括：
抗淬灭剂，用于起到抗氧化的作用；
荧光染料710，用于在室温下和切片组织产生非特异性结合；
表面活性剂吐温80，用于充当活性剂使荧光染料710在切片组织上分布均匀；
牛血清白蛋白，用于提高抗体稳定性。
所述抗淬灭剂的终浓度为0.5-12mM。
所述荧光染料710的终浓度为0.2-2mM。
所述表面活性剂吐温80的终浓度为0.05-1.0%。
所述牛血清白蛋白的终浓度为1-20mg/ml。
一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，使用荧光缓冲液，所述荧光缓冲液的荧光信号通过显微镜中的物镜进入摄像头后，其数字化图像经过自动背景灰度校准之后，能够使红色通道通过自动的分水岭算法分割和跟踪算法进行聚类，并对于红色亮处进行平均光密度计算。
优选的，所述计算结果值达到或超过130，即判定为正确AI对应试剂体系，可以进行之后的免疫组化自动判读。
优选的，所述计算结果值低于130，则判定为不正确的AI对应试剂体系，AI判读软件即会提示问题并不进行判读。
一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，包括以下步骤：
步骤一：配制带有荧光染料的抗体试剂荧光缓冲液；
步骤二：使用AI判读防伪的抗体试剂荧光缓冲液进行免疫组化实验，同时带使用普通抗体缓冲液的试剂进行对照；
步骤三：使用带有判读防伪的AI程序进行免疫组化结果判读，同时使用一张非防伪试剂进行对照。
与现有AI辅助病理诊断技术相比，本发明提供了一种用于防伪的抗体试剂缓冲液及其应用，具备以下有益效果：
1、本发明通过配制由四种组分混合形成的荧光缓冲液，在经过波长为633nm的激发光激发后即能获得波长为710nm的荧光基团，荧光基团的荧光信号分布均匀、强度稳定、不易淬灭；
2、本发明采用一种全新的试剂防伪方法，和软件联用可以快速、准确地判定试剂的真伪情况，减少不合格试剂对于病理诊断的影响，降低病理医生误诊率；
3、本发明增加荧光染色不改变可见光免疫组化的染色结果；
4、本发明此种防伪方法的准确度达99%以上。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
图1为本发明提出的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用流程示意图；
图2为本发明提出的荧光缓冲液的配置流程示意图；
图3为本发明提出的荧光缓冲液各组分示意图；
图4为本发明提出的智能病理AI判读软件和显微镜连接成功画面图；
图5为本发明提出的使用荧光缓冲液后光密度计算值达到130的数字化图像；
图6为本发明提出的软件提示切片合格画面图；
图7为本发明提出的使用荧光缓冲液后在可见光波段的免疫组化染色图像；
图8为本发明提出的使用普通抗体缓冲液后光密度计算值小于130的数字化图像；
图9为本发明提出的软件提示切片不合格结构示意图；
图10为本发明提出的使用普通抗体缓冲液后在可见光波段的免疫组化染色图像；
图中：100、荧光缓冲液；1001、抗淬灭剂；1002、荧光染料710；1003、表面活性剂吐温80；1004、牛血清白蛋白；1005、通用性抗体稀释液。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-图10，本发明提供一种技术方案：一种用于防伪的抗体试剂缓冲液，包括带有荧光基团能够进行AI判读防伪的荧光缓冲液100，荧光缓冲液100包括通用性抗体稀释液1005以及稀释于通用性抗体稀释液1005中的混合溶剂，通过混合溶剂与通用性抗体稀释液1005混合后，并经过波长为633nm的激发光激发即能获得波长为710nm且荧光信号均匀稳定的荧光基团，混合溶剂包括：
终浓度为0.5-12mM的抗淬灭剂1001，用于起到抗氧化的作用，是一种无毒的抗氧化剂，它能提供游离的氢原子和氧化产生的游离基结合以达到抗氧化的作用，能有效防止荧光染料发生淬灭；
终浓度为0.2-2mM的荧光染料7101002，用于在室温下和切片组织产生非特异性结合，能够均匀地分布于切片组织上，且由于属于非特异性的结合，且发光波段不在可见光波段，不会影响后续免疫组化特异性的相关染色；
终浓度为0.05-1.0%的表面活性剂吐温801003，用于充当活性剂使荧光染料7101002在切片组织上分布均匀，并提高缓冲液整体稳定性；
终浓度为1-20mg/ml的牛血清白蛋白1004，用于提高抗体稳定性，较高浓度的牛血清白蛋白1004可以提高抗体的稳定性，减缓抗体降解。
一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，使用荧光缓冲液100，荧光缓冲液100的荧光信号通过显微镜中的物镜进入摄像头后，其数字化图像经过自动背景灰度校准之后，能够使红色通道通过自动的分水岭算法(Watershed)分割和跟踪算法(Mean Shift)进行聚类，并对于红色亮处（可以认为是被识别的荧光信号）进行平均光密度计算，计算结果值达到或超过130，即判定为正确AI对应试剂体系，可以进行之后的免疫组化自动判读；计算结果值低于130，则判定为不正确的AI对应试剂体系，AI判读软件即会提示问题并不进行判读。
一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，包括以下步骤：
步骤一：配制带有荧光染料的抗体试剂荧光缓冲液100；
配置荧光缓冲液100的步骤如下：
取500ml通用型抗体稀释液1005（Universal Antibody Dilution）中加入牛血清白蛋白1004（BSA）共2.5g，牛血清白蛋白1004终浓度为5mg/ml，使用漩涡混匀器充分混合5min。
再将混合好的稀释液倒入避光的棕色瓶中，加入0.424g的抗淬灭剂1001NPG粉末，终浓度为2mM，再使用漩涡混匀器充分混匀5min。
再往棕色瓶中缓慢加入100ul 荧光染料 710 1002（PerCP-eFluor）浓缩液，终浓度为0.5mM，再轻柔颠倒混匀3-5次，
最后加入1ml的吐温80 1003，终浓度为0.2%，在血液混匀仪上缓慢混匀30min，即可获得带有荧光基团能够进行AI判读防伪的抗体试剂荧光缓冲液100。
步骤二：使用AI判读防伪的抗体试剂荧光缓冲液100进行免疫组化实验，同时带使用普通抗体缓冲液的试剂进行对照；
以下实验过程以Ki-67免疫组化试剂为例，先使用Ki-67抗体浓缩液和技术方案1中配制好的荧光抗体试剂缓冲液和按1：1000的比例进行稀释，获得稀释好带有荧光的抗体工作液用于免疫组化实验。同时使用通用型抗体稀释液也按照1：1000的比例进行稀释，获得普通抗体工作液，具体方式如下：
1. 取同一来源的扁桃体组织连续切片2张，将所有切片依次置于新鲜的二甲苯中，浸泡10分钟*2次；置于无水乙醇中，浸泡3分钟*2次；置于95%乙醇中，浸泡3分钟；将切片置于85%乙醇中，浸泡3分钟。
2. 再将配好的EDTA抗原修复液（pH9.0）放入不锈钢锅中，在电磁炉上大功率加热修复液至沸腾，调小功率保持修复液在轻微沸腾状态；将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，放入不锈钢锅中，修复液能漫过切片，盖上锅盖，确保温度在95℃以上是开始计时，维持修复液温度在95-100℃之间，维持温度30分钟。
3. 将切片自然冷却15分钟以上；待温度降至65℃以下时，取出切片，依次用蒸馏水或去离子水轻柔冲洗3分钟2次；PBS缓冲液轻柔冲洗3分钟3次。
4. 除去多余的PBS缓冲液，滴加100ul内源性过氧化物酶阻断剂在切片上，将切片置于湿盒内，在室温下孵育10分钟，用PBS缓冲液轻柔冲洗3分钟3次。
5. 除去多余的PBS缓冲液，其中一张切片滴加100ul的带有荧光抗体工作液，另一张切片滴加100ul的普通抗体工作液。将切片置于湿盒内，避光室温下孵育30分钟，PBS缓冲液轻柔冲洗3分钟3次。
6. 除去多余的PBS缓冲液，滴加100ul的HRP酶标记的抗小鼠/兔IgG聚合物，将切片置于湿盒内，避光室温下孵育20分钟，PBS缓冲液轻柔冲洗3分钟3次。
7. 除去多余的PBS缓冲液，滴加100-200ul新鲜配制的DAB显色液，在室温下孵育5分钟，洗去DAB显色液，终止显色过程。
8. 用自来水轻柔冲洗切片，加100-200ul苏木素染液孵育10-30秒，然后再用自来水冲洗返蓝。
9. 将切片依次置于85%乙醇中，浸泡3分钟；置于95%乙醇中，浸泡3分钟；置于无水乙醇中，浸泡3分钟；置于二甲苯中，浸泡3分钟；然后用中性树胶和盖玻片封片；
步骤三：使用带有判读防伪的AI程序进行免疫组化结果判读，同时使用一张非防伪试剂进行对照，具体方式如下：
1.先将上述步骤二中获得的由荧光防伪试剂做的扁桃体切片放置在连接有AI判读软件模块的荧光显微镜的载物台上，打开智能病理AI判读软件，软件和显微镜连接成功后，点击“试剂验证”菜单项中的“开始处理”（见图4），荧光显微镜打开荧光光源，光源经过光栅发射出波长为633nm的激光进行激发，荧光通过载物台上的切片进入摄像头，智能病理AI判读软件对波长为710nm的荧光信号进行分析，其数字化图像的经过自动背景灰度校准之后，仅对于红色通道进行自动的分水岭(Watershed)算法分割和跟踪算法(Mean Shift)进行聚类，对于红色亮处（可以认为是被识别的荧光信号）进行平均光密度计算，如果达到130，（见图5），软件即弹出提示信息：切片合格，可用于AI判读（见图6）。即该切片使用的抗体工作液是合格的、能够进行AI判读的免疫组化试剂。
2.通过试剂验证的切片软件会自动关闭荧光光源，打开白光，进行正常可见光波段的免疫组化染色判读（见图7），根据不同的靶点需要操作人员选择不同的模块进行后续的免疫组化染色判读。
3.再将普通抗体缓冲液做的扁桃体切片放到载物台上，按如上同样的方法进行试剂验证，在633nm波长激光的激发下，采集其数字化图像的红色通道荧光信号强度的值，经过自动背景灰度校准之后处理，仅对于红色通道进行自动的分水岭(Watershed)算法分割和跟踪算法(Mean Shift)进行聚类，710nm波长对应的荧光信号平均光密度小于130（见图8），智能病理AI判读软件即弹出提示信息：切片不合格，请使用合格AI对应免疫组化抗体试剂（见图9）。后续该切片无法通过智能病理AI软件进行判读。
4.将该切片使用普通显微镜进行可见光波段的拍摄（见图10），用于和荧光防伪试剂在可见光波段染色效果进行比较。结果可以看到在可见光波段，两种不同抗体稀释液稀释后阳性染色区域和强度保持一致，性能无明显变化。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种用于防伪的抗体试剂缓冲液，包括带有荧光基团能够进行AI判读防伪的荧光缓冲液（100），其特征在于，所述荧光缓冲液（100）包括通用性抗体稀释液（1005）以及稀释于通用性抗体稀释液（1005）中的混合溶剂，通过所述混合溶剂与通用性抗体稀释液（1005）混合后，并经过波长为633nm的激发光激发即能获得波长为710nm且荧光信号均匀稳定的荧光基团，所述混合溶剂包括：
抗淬灭剂（1001），用于起到抗氧化的作用；
荧光染料710（1002），用于在室温下和切片组织产生非特异性结合；
表面活性剂吐温80（1003），用于充当活性剂使荧光染料710（1002）在切片组织上分布均匀；
牛血清白蛋白（1004），用于提高抗体稳定性。
2.根据权利要求1所述的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液，其特征在于：所述抗淬灭剂（1001）的终浓度为0.5-12mM。
3.根据权利要求1所述的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液，其特征在于：所述荧光染料710（1002）的终浓度为0.2-2mM。
4.根据权利要求1所述的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液，其特征在于：所述表面活性剂吐温80（1003）的终浓度为0.05-1.0%。
5.根据权利要求1所述的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液，其特征在于：所述牛血清白蛋白（1004）的终浓度为1-20mg/ml。
6.一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，使用权利要求1中所述的荧光缓冲液（100），其特征在于：所述荧光缓冲液（100）的荧光信号通过显微镜中的物镜进入摄像头后，其数字化图像经过自动背景灰度校准之后，能够使红色通道通过自动的分水岭算法分割和跟踪算法进行聚类，并对于红色亮处进行平均光密度计算。
7.根据权利要求6所述的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，其特征在于：所述计算结果值达到或超过130，即判定为正确AI对应试剂体系，可以进行之后的免疫组化自动判读。
8.根据权利要求6所述的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，其特征在于：所述计算结果值低于130，则判定为不正确的AI对应试剂体系，AI判读软件即会提示问题并不进行判读。
9.根据权利要求7所述的一种用于防伪的抗体试剂缓冲液的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：配制带有荧光染料的抗体试剂荧光缓冲液（100）；
步骤二：使用AI判读防伪的抗体试剂荧光缓冲液（100）进行免疫组化实验，同时带使用普通抗体缓冲液的试剂进行对照；
步骤三：使用带有判读防伪的AI程序进行免疫组化结果判读，同时使用一张非防伪试剂进行对照。
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