CN113495138A

CN113495138A - 一种组织切片抗原修复液及其使用方法

Info

Publication number: CN113495138A
Application number: CN202110693632.0A
Authority: CN
Inventors: 邵敬国
Original assignee: Nanjing Frith Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Frith Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2021-10-12

Abstract

本发明提出了一种组织切片抗原修复液及其使用方法，该抗原修复液为Tris/EDTA修复缓冲液，1L抗原修复液中包含Base Tris 1.9‑2.5g和EDTA 0.7‑1.1g，加缓冲液稀释至1L，本申请通过优化Tris/EDTA修复液中EDTA和Tris‑base的比例配方，并针对性调整修复应用过程中的加热条件，有效提高了免疫组化实验中难以修复的抗原暴露度，使难以暴露的抗原得到很好的修复，在后续的实验中能很好的和一抗抗体相结合，同时又不至于修复过度产生不必要的非特异性染色，综合修复效率显著提高，高效实用。

Description

一种组织切片抗原修复液及其使用方法

技术领域

本发明涉及免疫组化技术领域，具体的为一种组织切片抗原修复液及其使用方法。

背景技术

免疫组织化学技术是近年来病理诊断迅速发展的检测技术，作为一种重要的病理辅助诊断方法，在临床的应用中日益受到重视。随着全自动免疫组化染色仪的应用推广，对于染色质量的要求也日益提高。其中，抗原修复在整个免疫组化染色过程中有着极其重要的作用，修复条件的好坏直接决定着最终染色结果的质量。

目前同类型产品有多种不同类型的修复液，常用的有枸橼酸钠缓冲液和Tris/EDTA 缓冲液。枸橼酸钠缓冲液PH值在6左右，简称AR6，Tris/EDTA 缓冲液的PH值在9左右，简称AR9，这两类修复液广泛应用于免疫组化和荧光免疫组化实验的抗原修复过程。

枸橼酸钠缓冲液主要成分是：10 mM 柠檬酸钠，0.05% 吐温20。Tris/EDTA缓冲液的主要成分：1L缓冲液中含EDTA 0.292 g，Tris-base 6.05 g。

抗原修复液的作用原理：在固定过程中甲醛和样本中的蛋白结合产生了交联，屏蔽了抗原位点。利用化学试剂（修复液）和热的作用将这些交联打断，使抗原表位重新暴露出来，以便于后续实验样本中的抗原与抗体结合。

常用的枸橼酸钠和Tris/EDTA对大部分的蛋白修复效果都可以，但是存在少数较难暴露的蛋白抗原，如核蛋白和跨膜蛋白的中间段，比较难以暴露，对于这类难暴露的蛋白实验结果容易出现假阴性的结果，导致实验结果判断错误。此外，对于部分蛋白还会出现修复过渡导致的非特异性染色，极大影响修复质量和后续试验操作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种组织切片抗原修复液及其使用方法，通过优化Tris/EDTA修复液中EDTA 和Tris-base的比例配方，并针对性调整修复应用过程中的加热条件，有效提高了免疫组化实验中难以修复的抗原暴露度，使难以暴露的抗原得到很好的修复，在后续的实验中能很好的和一抗抗体相结合，同时又不至于修复过度产生不必要的非特异性染色，综合修复效率显著提高，高效实用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种组织切片抗原修复液，该抗原修复液为Tris/EDTA修复缓冲液，1L抗原修复液中包含Base Tris 1.9-2.5g和EDTA 0.7-1.1g，加缓冲液稀释至1L。

作为本发明进一步优选，缓冲液为1xTBST溶液，由10xTBST溶液稀释10倍后制备。

作为本发明进一步优选，10xTBST配制方法为，先称量NaCL 87.6g，倒入烧杯中，加入双蒸水800ml，Tris-HCL 100ml，加5ml吐温20，溶解后转入1000ml容量瓶中定容至1L。

作为本发明进一步优选，组织切片抗原修复液使用方法，包括以下步骤：

1）按配方配置Tris/EDTA修复缓冲液，备用；将组织切片样本拷片脱蜡，备用；

2）将步骤1）中修复缓冲液导入免疫组化染色缸中，置入微波炉中高火加热至沸腾；

3）将步骤1）中脱蜡后的样本玻片置入沸腾的修复缓冲液中继续中高火加热5分钟；

4）转中小火继续加热15分钟，取出，待自然冷却后即可，实际操作中，则进入下步操作，DAPI染色或封闭等。

作为本发明进一步优选，步骤3）中高火微波输出功率500-700W；步骤4）中小火微波输出功率100-400W，微波频率2450MHZ。

作为本发明进一步优选，步骤3）中高火加热期间补修复缓冲液1次，且满5分钟时再补修复缓冲液一次；步骤4）中小火加热期间每5分钟补修复缓冲液一次。

作为本发明进一步优选，步骤3）、步骤4）加热过程中保证修复缓冲液量足够浸没样本玻片。

本发明的有益效果在于：

本申请通过优化Tris/EDTA修复液中EDTA 和Tris-base的比例配方，并针对性调整修复应用过程中的加热条件，有效提高了免疫组化实验中难以修复的抗原暴露度，使难以暴露的抗原得到很好的修复，抗体阳性检出率提高了好几倍，且阳性强度提高，在后续的实验中能很好的和一抗抗体相结合，同时又不至于修复过度产生不必要的非特异性染色，综合修复效率显著提高，高效实用。

附图说明

图1为采购赛维尔修复液对样本修复染色图；

图2为本申请抗原修复液对样本修复染色图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

缓冲液为1xTBST溶液，由10xTBST溶液稀释10倍后制备。10xTBST配制方法为，先称量NaCL 87.6g，倒入烧杯中，加入双蒸水800ml，Tris-HCL 100ml，加5ml吐温20，溶解后转入1000ml容量瓶中定容至1L。

组织切片抗原修复液使用方法，包括以下步骤：

3）将步骤1）中脱蜡后的样本玻片置入沸腾的修复缓冲液中继续中高火加热5分钟（步骤2）中高火同理），中高火微波输出功率500-700W（微波频率2450MHZ），期间补修复缓冲液1次，且满5分钟时再补修复缓冲液一次；

4）转中小火继续加热15分钟，中小火微波输出功率100-400W（微波频率2450MHZ），期间每5分钟补修复缓冲液一次，取出，待自然冷却后即可。

其中，步骤3）、步骤4）加热过程中补液保证修复缓冲液量足够浸没样本玻片。

实施例2：

基于实施例1的组织切片抗原修复液配比范围和使用方法，进一步的，提出以下具体配比和使用步骤：

一种组织切片抗原修复液，1L抗原修复液中包含Base Tris 1.9g和EDTA 0.8g，加缓冲液稀释至1L。缓冲液为1xTBST溶液，制备方法同实施例1。

组织切片抗原修复液使用方法，包括以下步骤：

3）将步骤1）中脱蜡后的样本玻片置入沸腾的修复缓冲液中继续中高火（500W、2450MHZ）加热5分钟，期间补修复缓冲液1次，且满5分钟时再补修复缓冲液一次；

4）转中小火（150W、2450MHZ）继续加热15分钟，期间每5分钟补修复缓冲液一次，取出，待自然冷却后即可。

实施例3：

一种组织切片抗原修复液，1L抗原修复液中包含Base Tris 2.2g和EDTA 0.7g，加缓冲液稀释至1L。缓冲液为1xTBST溶液，制备方法同实施例1。

组织切片抗原修复液使用方法，包括以下步骤：

3）将步骤1）中脱蜡后的样本玻片置入沸腾的修复缓冲液中继续中高火（700W、2450MHZ）加热5分钟，期间补修复缓冲液1次，且满5分钟时再补修复缓冲液一次；

4）转中小火（100W、2450MHZ）继续加热15分钟，期间每5分钟补修复缓冲液一次，取出，待自然冷却后即可。

实施例4：

一种组织切片抗原修复液，1L抗原修复液中包含Base Tris 2.5g和EDTA 1.0g，加缓冲液稀释至1L。缓冲液为1xTBST溶液，制备方法同实施例1。

组织切片抗原修复液使用方法，包括以下步骤：

3）将步骤1）中脱蜡后的样本玻片置入沸腾的修复缓冲液中继续中高火（600W、2450MHZ）加热5分钟，期间补修复缓冲液1次，且满5分钟时再补修复缓冲液一次；

4）转中小火（200W、2450MHZ）继续加热15分钟，期间每5分钟补修复缓冲液一次，取出，待自然冷却后即可。

实施例5：

一种组织切片抗原修复液，1L抗原修复液中包含Base Tris 2.4g和EDTA 1.1g，加缓冲液稀释至1L。缓冲液为1xTBST溶液，制备方法同实施例1。

组织切片抗原修复液使用方法，包括以下步骤：

4）转中小火（400W、2450MHZ）继续加热15分钟，期间每5分钟补修复缓冲液一次，取出，待自然冷却后即可。

实施例6：

一种组织切片抗原修复液，1L抗原修复液中包含Base Tris 2.1g和EDTA 0.7g，加缓冲液稀释至1L。缓冲液为1xTBST溶液，制备方法同实施例1。

组织切片抗原修复液使用方法，包括以下步骤：

4）转中小火（300W、2450MHZ）继续加热15分钟，期间每5分钟补修复缓冲液一次，取出，待自然冷却后即可。

实施例7：

取本发明实施例2制备的抗原修复液，并以实施例2中修复液使用方法对一个样本免疫组化结果进行测试；同时，以同一样本免疫组化结果采用市售购买的修复液进行修复测试，观测结果，如图1、2所示，具体的结果对比为：染色蛋白 Syndecan4。

其中，图1使用的是市售购买的赛维尔修复液（货号G1203-250ML），染色结果为阴性，未见阳性表达。图2使用（实施例2）改良版免疫组化抗原修复液Tris/EDTA，实验结果阳性，可见明显阳性表达（棕褐色染色区域）。

由于图片要求不能附加颜色，对此，申请人对图片做出如下解释，图1中阳性表达几近为零，整个区域均为阴性染色，图2中阳性表达达90%以上，整个区域直观来看都是棕褐色，间或夹杂细小的蓝色染色阴性表达。

另外，

对本申请改良版免疫组化抗原修复液Tris/EDTA和市售赛维尔修复液的修复阳性率结果进行对比评分可得，市售组评估为“-”，而本申请抗原修复液阳性率评估是“2+/3+”。

上述评分具体为：“+”、“-”对应表示阳性细胞、阴性细胞。阳性细胞符号前面的数字表示阳性强度（染色强度），1+为浅黄色、2+为棕黄色、3+为棕褐色。

由此可见，本申请改良版的免疫组化抗原修复液对部分难以暴露的核蛋白和跨膜蛋白具有优异的抗原修复性，染色强度明显提高，有效提高了修复效率和质量，为后续实验和一抗抗体相结合提供了良好的基础保障。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种组织切片抗原修复液，其特征在于：所述抗原修复液为Tris/EDTA修复缓冲液，1L抗原修复液中包含Base Tris 1.9-2.5g和EDTA 0.7-1.1g，加缓冲液稀释至1L。

2.根据权利要求1所述的组织切片抗原修复液，其特征在于：所述缓冲液为1xTBST溶液，由10xTBST溶液稀释10倍后制备。

3.根据权利要求1所述的组织切片抗原修复液，其特征在于：所述10xTBST配制方法为，先称量NaCL 87.6g，倒入烧杯中，加入双蒸水800ml，Tris-HCL 100ml，加5ml吐温20，溶解后转入1000ml容量瓶中定容至1L。

4.一种如权利要求1所述的组织切片抗原修复液使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

4）转中小火继续加热15分钟，取出，待自然冷却后即可。

5.根据权利要求4所述的组织切片抗原修复液使用方法，其特征在于：步骤3）中高火微波输出功率500-700W；步骤4）中小火微波输出功率100-400W，微波频率2450MHZ。

6.根据权利要求4所述的组织切片抗原修复液使用方法，其特征在于：步骤3）中高火加热期间补修复缓冲液1次，且满5分钟时再补修复缓冲液一次；步骤4）中小火加热期间每5分钟补修复缓冲液一次。

7.根据权利要求6所述的组织切片抗原修复液使用方法，其特征在于：步骤3）、步骤4）加热过程中保证修复缓冲液量足够浸没样本玻片。