CN114058615A - 一种基于全自动纳米磁珠法提取唾液中核酸rna的通用试剂组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于全自动纳米磁珠法提取唾液中核酸RNA的试剂组合，包括裂解液和漂洗液。所述裂解液包括3~5mol异硫氰酸胍、0.4%~0.5%十二烷基肌氨酸钠、0.05~0.15mmolB‑巯基乙醇、20~30mmol柠檬酸钠、10~30ug糖、0.02%~0.03%叠氮钠；所述漂洗液是20~30%10mmol/L Tris‑HCL、75%无水乙醇。其中组分中额外添加了叠氮钠增加核酸提取中蛋白质的去除。本组合的漂洗液是20~30%10mmol/lL Tris‑HCL、75%无水乙醇。本发明所提供的裂解成分的改变，能够有效地促进样本中核酸的释放，提高了磁珠结合核酸的效率。洗涤液的改变，保证了结合RNA的磁珠能够稳定，获得有效的清洁，杂质的去除，并保证了核酸提取后的质量能够用于下游检测的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药行业，特别涉及一种基于全自动磁珠法提取唾液中核酸RNA的试剂。
背景技术
核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。在很多的传染性疾病或者病毒感染类的疾病体外诊断中，常常需要检测病原体的核酸RNA物质。唾液成为了检测中的一种简便、无痛，采集成本低、快捷的一种理想样本。但是由于唾液本身含有各种酶和各种口腔细菌，因此提取要在样本中获得微量的检测病原体基因，是保证下游应用的关键。
目前市面上有很多的核酸提取试剂盒，主要为酚-氯仿法、滤膜离心柱法、磁珠法等。不同的提取方法在获得核酸RNA上存在着较大的差距。而自新冠爆发以来，为了加快疫情的控制，提高检测速度，磁珠法的全自动提取获得了人们的普遍认可，磁珠法作为新的核酸提取方法,因其操作简单,不需要负压或反复离心,且易于自动化等优点受到了越来越广泛的应用。并且其全自动的提取模式，加快了检测速度，避免了交叉污染，成为了传染病检测中的有效手段。
试剂盒中最为普遍应用的裂解液成分主要为蛋白质变性剂胍盐，它能破坏细胞从而释放出唾液中核酸物质。而裂解液强度的不同往往会导致获得的RNA核酸的质量和回收率的不同。目前最为普遍应用的结合液的成分是异丙醇，选用乙醇往往在会易导致对RNA的回收效率稍差。异丙醇的终浓度控制一般在40%，不同的结合液离子成分不同，也会影响磁珠对于核酸的结合能力。
就目前几款常见的核酸磁珠法提取试剂盒来讲，仍然存在着提取的核酸质量差，提取量低，提取时间长等问题。主要原因在于不同厂家生产的磁珠在其磁珠的大小直径的稳定性和磁珠包被基团的能力的差异。而裂解液的成分和结合液的成分针对不同的试剂盒，差别较大，适应性差，因此亟需一种适应性强，提取质量高，成分稳定的适用市面上常见的磁珠的提取液组合。
发明内容
本发明解决的技术问题：提供一种能够适用市面上常见的用于核酸提取用的磁珠的一款通用核酸提取液组合，包括裂解液和漂洗液两种试剂。该提取液组合成分稳定，适用范围广，适应性强，提取质量高，可适配市面上常见的磁珠法核酸RNA提取试剂盒。
本发明提供的技术方案，所述裂解液包括3~5mol 异硫氰酸胍、0.4%~0.5%十二烷基肌氨酸钠、0.05~0.15mmolB-巯基乙醇、20~30mmol柠檬酸钠、10~30ug糖、0.02%~0.03%叠氮钠。其中组分中额外添加了叠氮钠增加核酸提取中蛋白质的去除。该裂解液主要用于提取唾液样本的核酸RNA提取，叠氮钠的使用能够限制样本中各种酶的活性，保护核酸，避免降解。该裂解液仅需在室温下作用5分钟后加入异丙醇至终浓度为40%，则可以达到磁珠进行核酸RNA吸附的最佳离子环境。裂解液能够满足市场中常见羟基和羧基修饰磁珠，而且磁珠的使用量一般为裂解液的10%-40%为最佳比例，磁珠的浓度一般为100mg/Ml-200mg/Ml。
本组合的漂洗液：取漂洗液是20~30% 10mmol/lL Tris-HCL 、75%无水乙醇。该漂洗液对分离后的磁珠进行3次清洗即可有效地去除杂质，保证核酸提取的质量。Tris-HCL的加入能够有效地保证结合有核酸的磁珠稳定，保证吸附过程中磁珠的回收效率。将漂洗回收的磁珠进行干燥，然后用无RNA酶的水进行洗脱，即可获得核酸RNA。
为了验证核酸获得的质量，可以采用超微量分光光度计进行测量，通过凝胶电泳对核酸的质量进行鉴定。为了检测核酸RNA是否可以应用于下游，采用一步法QPCR，对唾液中的细胞内参GAPDH进行引物设计，合成探针，分别取1ul的RNA样本进行QPCR检测。
本发明的有益效果是：相对于现有技术，本发明所提供的裂解成分的改变，能够有效地促进样本中核酸的释放，促进了磁珠结合核酸的效率提高，核酸的质量提高。洗涤液的改变，保证了结合RNA的磁珠能够稳定，获得有效的清洁，杂质的去除，并保证了核酸提取后的质量能够用于下游检测的应用。
附图说明
图1 不同试剂盒和磁珠提取后的唾液中核酸琼脂糖凝胶电泳图。
图2 不同样本QPCR扩增曲线图。
具体实施方式
本发明公开了一种全自动快速核酸提取唾液样本RNA的溶液组合，本领域技术人员可以借鉴本文内容进行适当的工艺参数改造，来达到应用本发明的目的。下面结合具体的实施对本发明进一步进行说明。
实验材料与仪器如表1。
表1
样本采用的唾液样本实施例：分别采用某品牌1核酸提取试剂盒、某品牌2核酸提取试剂盒、4个公司生产的的磁珠，分别标记为A、B、C、D进行本发明的试剂组合测试，具体操作如下。
（1）取200ul唾液样本保存液加入到1号孔的提取板中，并向其中加入裂解液200uL，磁珠40ul，异丙醇293ul，向2-4号孔分别加入500ul的漂洗液，向9号孔加入50ul的Elution溶液，此步骤后续可以将液体直接机器填充至96孔板中。
（2）将机器进行设定如下
（3）将9孔中的样本RNA液体吸取出来-80℃保存，并用超微量分光光度计进行测量，实验结果如表2所示，与市面上某些品牌的试剂盒提取的核酸相比，本发明适配不同的磁珠提取的核酸质量均较稳定。并取5ul提取的核酸样本进行1%琼脂糖凝胶电泳，实验结果如图1，从图中可以看出本产品提取的RNA质量合格，能够满足下游的使用要求。
表2 不同的试剂盒和磁珠提取的核酸测量结果
(4)根据样本中含有的人唾液细胞，选择GAPDH内参指标，设计引物：
F: 5'CTGATGCCCCCATGTTCGT3'
R: 5’GTTCTGGAGAGCCCCGCG3'
探针：FAM-AGATCATCAGCAATGCCTCCTGCA-BHQ1
按照One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix的说明书，添加1 ul的RNA样本，反应体系为20ul，试剂使用量终浓度 One Step PrimeScript III RT-qPCR (2X) 10μl ，Forward Primer（10 μM）0.4μl，PCR Reverse Primer（10μM）0.4μl，Probe (10 μM) 0.4μl，RNase Free H2O 7.8μl ，按照下列程序52℃ 5 min ，95℃ 10 sec ，1个循环；2–StepAmplification 95℃ 5 sec ，60℃ 30 sec，40个循环，进行QPCR实验，根据测得的循环CT值判定所提取的核酸RNA的质量，实验结果如图2，从图中可以看出，不同公司的磁珠产品在使用本产品试剂提取的RNA后，与市场上某些品牌的核酸提取的效果基本一致，能够达到使用目的。
Claims (5)
1.一种基于全自动纳米磁珠法提取唾液中核酸RNA的试剂组合，其特征在于：包括裂解液、漂洗液，
所述裂解液包括3~5mol 异硫氰酸胍、0.4%~0.5%十二烷基肌氨酸钠、0.05~0.15mmolB-巯基乙醇、20~30mmol柠檬酸钠、10~30ug糖、0.02%~0.03%叠氮钠；
所述漂洗液是20~30% 10mmol/lL Tris-HCL 、75%无水乙醇。
2.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于: 所述裂解液包括3.5~4.5mol 异硫氰酸胍、0.425%~0.475%十二烷基肌氨酸钠、0.075~ 0.125mmolB-巯基乙醇、22.5~27.5mmol柠檬酸钠、15~25ug糖、0.0225%~0.0275%叠氮钠。
3.根据权利要求2所述的裂解液，其特征在于: 所述裂解液包括3.75~4.25mol 异硫氰酸胍、0.43%~0.46%十二烷基肌氨酸钠、0.08~ 0.11mmolB-巯基乙醇、23~26mmol柠檬酸钠、17~23ug糖、0.023%~0.026%叠氮钠。
4.根据权利要求3所述的裂解液，其特征在于: 所述裂解液包括4mol 异硫氰酸胍、0.5%十二烷基肌氨酸钠、0.1mmol B-巯基乙醇、25mmol柠檬酸钠、20ug糖、0.025%叠氮钠。
5.根据权利要求1所述的漂洗液，其特征在于：所述漂洗液为25% 10mmol/lL Tris-HCL75%无水乙醇。
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