CN114051921B - 一种羊栖菜假根离体保存种质资源的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊栖菜种质资源的离体保存方法，主要涉及一种以羊栖菜假根为种质保存材料的低温、低盐度保存方法，该方法公开在温度为8‑10℃，盐度为19‑20‰的条件下对羊栖菜假根进行长时间离体保存，使得羊栖菜假根在保存期间生长速率与萌发速率受到有效抑制，本发明的保存方法操作简单，节约资源，不影响羊栖菜假根的存活和萌发，且置适宜培养条件下，羊栖菜假根可恢复正常生长、萌发和成苗，有效解决了羊栖菜室内种质资源难以保存这一关键问题，保存时间长达4个月以上，且复苏培养后假根萌发率可达400％以上，成苗率达150％以上。

Description

一种羊栖菜假根离体保存种质资源的方法

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种羊栖菜假根离体保存种质资源的方法。

背景技术

羊栖菜(Sargassum fusiforme)是一种具有较高的营养、药用、生态与经济价值的大型褐藻。我国是世界上羊栖菜养殖的主要国家之一，羊栖菜养殖具有重要的经济意义和生态意义。

在羊栖菜的整个生命周期中，除了人工有性生殖的育种期在育苗池中进行之外，其余的生命周期都在海域中完成，因此，存在极端气候条件下优良种质资源损失的风险，如台风流失和高温腐烂等；也存在因有性繁殖育种引起的遗传漂移造成优良品系性状丢失的风险。基于上述原因，羊栖菜种质资源的长时间室内离体保存，对于羊栖菜的杂交育种、优良品系选育及种质资源库建立等具有重要意义。

目前，羊栖菜的室内种质资源保存方法的研究主要包括受精卵的超低温及低温保存、生殖托与茎段的低温保存等，但尚无长时间保存的成功案例，羊栖菜的室内保种技术的瓶颈仍未突破。

发明内容

鉴于现有技术，本发明的目的在于提供一种解决羊栖菜室内长期保存的技术瓶颈问题，建立一种羊栖菜假根离体保存方法，从而有效的进行羊栖菜种质资源的离体保存。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种羊栖菜假根离体保存种质资源的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1)羊栖菜假根的筛选与清洗：

羊栖菜收获后，采取附着在苗绳上的假根，去除假根上附着的无用附着物，用经过滤和高压蒸汽灭菌后的海水冲洗羊栖菜假根3-4次，挑选健康无损的羊栖菜假根作为保存材料；

2)羊栖菜假根的预处理：

将选取的羊栖菜假根在体积分数为0.38％的NaClO和质量分数为0.5％的KI的混合溶液中浸泡3min进行消毒，然后立即用灭菌后的海水快速涮洗3-4次，再将涮洗干净的羊栖菜假根置于温度20℃、光照强度84μmol photons·m^-2·s^-1、光照周期比12L：12D以及海水盐度为29‰的条件下，恢复培养24h；

3)种质保存：

在盐度为19-20‰的灭菌海水中以每升培养基12-15个羊栖菜假根，总重量为4-6克的培养密度，在8-10℃、光照强度为32μmol photons·m^-2·s^-1、光照周期比12L：12D和充气量为2L·min^-1的条件下，连续充气保存，每7天更换培养海水一次；

4)保存后羊栖菜假根恢复生长：

取出室内离体保存的羊栖菜假根，放置在16℃，光照强度为105μmol photons·m^-2·s^-1，其余培养条件与步骤3)相同的条件下培养6天；再将羊栖菜假根放置温度为20℃，光照强度为140μmol photons·m^-2·s^-1，其余培养条件与步骤3)相同，继续培养至羊栖菜假根成苗。

本发明优点：

本发明以养殖羊栖菜收获后苗绳残留的假根为材料，进行低温、低盐度海水离体保存，具有操作简单、安全无毒、能耗低、保存量大和保存时间较长等优点，可降低人力物力并节约资源，此外，本发明在复苏培养时采用逐步恢复温度和光照强度的方法，使得假根的细胞从低温、低光条件下逐步恢复代谢活动强度，进而有利于假根恢复光合活性以及正常生长。羊栖菜假根存活率与萌发率较高，不影响假根成苗。此方法可用于解决羊栖菜的室内种质资源难以保存的问题，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为在不同温度(8℃、10℃、13℃)及不同盐度(14‰、19‰、24‰、29‰)保存过程中，羊栖菜假根光合电子传递速率的变化。

图2为在不同温度(8℃、10℃、13℃)及不同盐度(14‰、19‰、24‰、29‰)保存4个月后，羊栖菜假根的丙二醛(MDA)含量的变化。

图3为在不同温度(8℃、10℃、13℃)及不同盐度(14‰、19‰、24‰、29‰)保存过程中，羊栖菜假根的形态变化。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合实施例对本发明进行进一步的详细描述。

根据对羊栖菜假根进行研究得出羊栖菜假根的组织结构致密，抗性较强，并且在适宜条件下可通过无性生殖再生成苗。因此，我们提出科学假设，基于其较强的抗性，调控环境因子，降低假根的活性，可延长羊栖菜假根的室内离体保存时间；恢复适宜培养条件，假根可萌发并发育成苗。此外，在研究过程中也发现，温度与盐度是影响大型海藻生长的重要因素，通过调控温度与盐度可改变羊栖菜假根的生长与萌发速率。但是，温度与盐度过低或过高都会对羊栖菜假根造成损伤，或加速假根生长与萌发，导致幼孢子体过早成熟，难以保存羊栖菜的种质资源。前期研究结果表明，在室温(19-22℃)和海水(盐度为27-29‰)下培养，羊栖菜假根可保存一个月左右。

基于上述，我们提出了实施例1：

一种羊栖菜假根保存种质资源的方法，其特征包括如下步骤：

(1)羊栖菜假根的筛选与清洗：

羊栖菜收获后，采取附着在苗绳上的假根，去除假根上附着的杂藻、软体动物及污泥等附着物，用经过滤和高压蒸汽灭菌后的海水冲洗3-4次，选择健康无损的羊栖菜假根作为保存材料。

(2)羊栖菜假根的预处理：

将选取的羊栖菜假根在体积分数为0.38％的NaClO和质量分数为0.5％的KI的溶液中浸泡3min进行消毒，然后立即用灭菌后的海水快速涮洗3-4次。将羊栖菜假根放置在温度为20℃、光照强度为84μmol photons·m^-2·s^-1、光暗周期比为12L:12D和海水盐度为29‰的条件下，恢复培养24h。

(3)种质保存条件：

在容积为500mL的三角烧瓶中装入300mL盐度为19-20‰的灭菌海水，每瓶内放置4个羊栖菜假根，在8-10℃、光照强度为32μmol photons·m^-2·s^-1、光周期比为12L：12D和充气量为2L·min^-1的条件下，连续充气保存。每隔7天更换一次培养海水。

(4)保存后羊栖菜假根恢复生长的培养方法为：取出室内离体保存4个月的羊栖菜假根，放置在16℃，光照强度为105μmol photons·m^-2·s^-1，其余培养条件与前期相同的条件下培养6天。再将羊栖菜假根放置温度为20℃，光照强度为140μmol photons·m^-2·s^-1，其余培养条件与前期相同，继续培养至羊栖菜假根成苗。

进一步的，保存期间，每隔7天评估一次羊栖菜假根的萌发率和相对生长速率，每隔一个月通过分析叶绿素荧光活性评估羊栖菜假根的生长状态；保存结束后，通过比较丙二醛(MDA)含量判断羊栖菜假根的损伤情况。羊栖菜假根萌发率的计算方法为：(羊栖菜假根幼芽/羊栖菜假根的根丝数)*100％。羊栖菜假根的相对生长速率(RGR)计算方法为：ln(Wt/W0)/t*100％；式中Wt为培养t天后的重量(g)，W0为假根初始重量(g)。

恢复培养后，评估羊栖菜假根成苗率和假根质量。羊栖菜假根成苗率的计算方法为：(羊栖菜假根成苗数/羊栖菜假根总数)*100％。

不同温度和盐度对羊栖菜假根保存效果的影响如表1、图1、图2和图3所示，测定的指标包括假根的相对生长速率(RGR)、相对电子传递速率(ETRm)、丙二醛(MDA)含量和假根形态。

本发明以羊栖菜假根作为种质保存材料，有效解决了羊栖菜室内种质资源难以保存的关键问题。由于羊栖菜假根对于低温、盐度等环境变化的耐受性较羊栖菜藻体本身更强，因此羊栖菜假根在相对较低温度条件下仍可保持生理代谢活性，大幅度提升了低温保存的存活率。同时，出于对低温低盐度下导致羊栖菜假根代谢活动减弱的考量，降低光照强度可降低假根保存过程中的生理代谢，同时避免高光照强度对假根造成的光损伤。基于此，我们进行了温度、盐度和光照强度的多个梯度的对比保存培养，最终得到技术方案中的19-20‰的灭菌海水，在8-10℃、光照强度为32μmol photons·m^-2·s^-1、光周期比为12L：12D和充气量为2L·min^-1的条件下，进行种质资源保存的数据(详见下表和图)。

表1.不同温度与不同盐度下羊栖菜假根离体保存后的生理和生长状况变化

由表1可知，与正常室温下培养的假根相比，本发明所提出的方法可长时间保存羊栖菜假根，保存期间假根的生长与萌发率均有所降低，萌发时间明显延长(滞后一周左右)，但不影响假根的生长状态与光合活性，保存结束后测定的MDA含量也表明在此条件下假根受到的损伤较小。此外，本发明还提供了：采用逐步恢复温度与光照强度的方法，使得假根的细胞从低温、低光条件下逐步恢复代谢活动强度，进而有利于假根恢复光合活性以及正常生长，采用16℃，光照强度为105μmol photons·m^-2·s^-1，培养6天后，假根的光合活性及生长均已恢复至一个稳定的状态，随后可恢复至正常培养条件培养至假根成苗。在恢复培养时参考羊栖菜的实际生长环境，盐度均已恢复至正常海水盐度。通过上述方案进行的保存和恢复培养，不影响假根的正常生长与成苗。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.一种羊栖菜假根离体保存种质资源的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1）羊栖菜假根的筛选与清洗：

羊栖菜收获后，采取附着在苗绳上的假根，去除假根上附着的无用附着物，用经过滤和高压蒸汽灭菌后的海水冲洗羊栖菜假根3-4次，挑选健康无损的羊栖菜假根作为保存材料；

2）羊栖菜假根的预处理：

将选取的羊栖菜假根在体积分数为0.38%的NaClO和质量分数为0.5%的KI的混合溶液中浸泡3 min进行消毒，然后立即用灭菌后的海水快速涮洗3-4次，然后，将涮洗干净的羊栖菜假根置于温度20℃、光照强度84µmol photons·m⁻²·s⁻¹、光照周期比12L：12D以及海水盐度为29‰的条件下，恢复培养24h；

3）种质保存：

在盐度为19-20‰的灭菌海水中以每升灭菌海水12-15个羊栖菜假根、总重量为4-6克的培养密度，在8-10℃、光照强度为32 µmol photons·m⁻²·s⁻¹、光照周期比12L：12D和充气量为2 L·min^-1的条件下，连续充气保存，每7天更换灭菌海水一次；

4）保存后羊栖菜假根恢复生长：

取出室内离体保存的羊栖菜假根，放置在16℃，光照强度为105 µmol photons·m⁻²·s⁻¹，其余培养条件与步骤3）相同的条件下培养6天；再将羊栖菜假根放置在温度为20℃，光照强度为140 mol photons·m⁻²·s⁻¹，其余培养条件与步骤3）相同，继续培养至羊栖菜假根成苗。

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