CN114047336A - 一种用于辅助诊断复发性流产的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于辅助诊断复发性流产的生物标志物及其应用，属于生物技术领域。本发明首次发现岩藻糖基转移酶4(FUT4)催化合成的α1，3连接岩藻糖基化，促进滋养层细胞迁移侵袭和增殖能力，可以作为辅助诊断复发性流产的生物学标志物。本发明证明了FUT4与其催化合成的α1，3连接岩藻糖基化对滋养层细胞的迁移侵袭、增殖能力的影响，这将有助于复发性流产的预测和诊断，并深入理解胚胎植入机理，也可为临床上以糖为靶点的复发性流产的治疗提供新的理论依据。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于辅助诊断复发性流产的生物标志物及其应用。
背景技术
在女性早期妊娠(≤20周)，不足500g妊娠物的自然丢失称为自然流产(Spontaneous Abortion),是妇产科一种常见的不良结局。然而，在早期妊娠连续发生两次或两次以上的自然流产即为复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)。复发性流产的病因很复杂，常见的有免疫因素、内分泌因素、遗传因素、血栓性疾病和感染等，除去上述病因有50％以上的RSA患者病因不详，此为不明原因复发性流产(unexplainedrecurrent spontaneous abortion,URSA)。目前临床还没有方法诊断和预防URSA，因此在新的领域寻找复发性流产的可能发病机制是生殖的热点之一。现在的研究表明，URSA的发病机制是多种因素共同作用的结果，其中滋养层细胞功能异常被认为是其发病的中心环节。
成功的妊娠需要胚胎和子宫内膜二者功能同步。发育成熟的胚胎定置、黏附和侵入子宫内膜，完成胚胎植入。胚胎由内细胞团和外部的滋养层细胞组成，其中滋养层细胞对胚胎起到“driver”和“feeder”的作用。胚胎滋养层细胞包括滋养层细胞(cytotrophoblast,CTB)以及合体滋养层细胞(syncytiotrophoblast，STB),其中CTB可以转化为间充质样的绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast，EVT)。
尽管目前许多研究致力于阐明RSA的病因，并在RSA出现前预测甚至是预防该疾病。但是RSA的发病机制尚不明确。目前RSA只能通过排除法进行诊断包括：询问相关病史、完善体格检查以及相关的辅助检查来寻找病因。尽管如此，还有50％以上的RSA患者病因不详。而这一部分不明原因复发性流产患者只能通过主动免疫和被动免疫治疗。因此对RSA的发病机制和诊断指标的研究尤为重要。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供了一种辅助诊断复发性流产的生物标志物及其应用。蛋白质糖基化修饰是一个重要的翻译后加工修饰步骤，包括N-糖基化和O-糖基化，蛋白质糖基化是由特异的糖基转移酶催化完成，其中，岩藻糖基化转移酶有13种岩藻糖基转移酶家族成员，主要包括N-岩藻糖基转移酶家族(FUT1-11)和O-岩藻糖基转移酶家族(poFUT1-2)。发明人前期发现翅荚百脉根凝集素(Lotus tetragonolobus lectin，LTL)所识别的糖型结构α1，3连接岩藻糖基化在复发性流产患者绒毛组织较正常绒毛组织中低表达。岩藻糖基化转移酶FUT4可催化合成α1，3连接岩藻糖基化，FUT4及绒毛组织蛋白质的α1，3岩藻糖基化可作为一种辅助诊断复发性流产的生物标志物。
本发明目的是通过以下方式实现：
本发明提供一种辅助诊断复发性流产的生物标志物，所述生物标志物为岩藻糖基转移酶FUT4和/或绒毛组织蛋白质的α1，3岩藻糖基化。
本发明另一方面提供岩藻糖基转移酶FUT4和/或绒毛组织蛋白质的α1，3岩藻糖基化在制备辅助诊断复发性流产的试剂或试剂盒中的用途。
进一步的，所述试剂或试剂盒的检测的方法包括免疫组织化学法、凝集素印记法、蛋白质免疫印迹法和免疫荧光法。
进一步的，绒毛组织蛋白质的α1，3岩藻糖基化能够被翅荚百脉根凝集素特异性识别，通过凝集素印记进行检测。
进一步的，所述岩藻糖基转移酶FUT4通过免疫组织化学法、蛋白质免疫印迹法进行检测。
进一步的，所述检测的病理样本为绒毛组织。
进一步的，所述绒毛组织包括滋养层细胞、合体滋养层细胞和绒毛外滋养层细胞。
进一步的，FUT4低表达时，抑制滋养层细胞的增殖能力和迁移侵袭能力，导致复发性流产。
进一步的，绒毛组织蛋白质的α1，3岩藻糖基化减少时，抑制滋养层细胞的增殖能力和迁移侵袭能力，导致复发性流产。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.发明人前期发现翅荚百脉根凝集素(Lotus tetragonolobus lectin，LTL)所识别的糖型结构α1，3连接岩藻糖基化在复发性流产绒毛组织较正常绒毛组织中低表达，岩藻糖基化转移酶FUT4可催化合成α1，3连接岩藻糖基化，FUT4及α1，3岩藻糖可作为一种辅助诊断复发性流产的生物标志物，这将有助于复发性流产的预测和诊断，并深入理解胚胎植入机理，也可为临床上以糖为靶点的复发性流产的治疗提供新的理论依据。
2.本发明发现FUT4高表达促进α1，3连接岩藻糖的合成，促进滋养层细胞迁移侵袭和增殖能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为通过免疫组织荧光(A)、蛋白质免疫印迹实验(B)、凝集素印记(C)检测正常妇女与复发性流产患者的绒毛组织中FUT4与α1，3岩藻糖表达对比图，其中，Normal是正常妇女，Miscarriage是复发性流产患者。
图2为通过凝集素印记(A)、蛋白质免疫印迹实验(B)、凝集素印记(C)、EdU增殖实验(D)、人绒毛体外迁移实验(E)和Transwell迁移侵袭实验检测滋养层细胞(F)在不同实验组(Scramble对照组、转染FUT4 siRNA组、同时转染FUT4 siRNA和FUT4 cDNA组)中FUT4与α1，3岩藻糖的表达情况以及对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
检测正常妇女与复发性流产患者绒毛组织中FUT4与α1，3岩藻糖的表达，绒毛组织通过石蜡包埋处理。
1、免疫组织荧光法检测绒毛组织中FUT4与α1，3岩藻糖的定位和表达
(1)脱腊：将准备好的石蜡切片依次放入下列溶液中：二甲苯I浸泡10min，然后用二甲苯II浸泡10min，100％乙醇I浸泡5min，100％乙醇II浸泡5min，95％乙醇浸泡5min，85％乙醇浸泡5min，70％乙醇浸泡5min；然后缓速水流冲洗10min，勿直冲切片。PBS浸洗3次，每次5min。
(2)抗原修复：将切片放入枸橼酸盐缓冲液中，盖上盖子，微波炉解冻档20min。取出自然冷却至室温。
(3)PBS浸洗3次，每次5min；将切片擦干置于棕色盒中滴加3％过氧化氢，室温避光孵育20min。
(4)山羊血清封闭：PBS浸洗3次，每次5min；擦干滴上山羊血清，棕色盒中封闭1h。
(5)一抗孵育：滤纸吸干多余液体，一抗4℃过夜(兔抗人FUT4 1:150；凝集素LTL1:300)。
(6)复温：第二天取出，室温放置1h。
(7)PBS洗3次，每次10min，之后甩去PBS，吸干背面与正面的液体，加入荧光二抗(FITC标记羊抗兔IgG 1:100，TEXAS RED AVIDIN D 1:200)室温孵育1h。
(8)PBS洗3次每次5min。
(9)封片：荧光封片液覆盖在载玻片上，确定样品无气泡。晾干后正置荧光显微镜镜下观察拍照。
2、Western blot和凝集素印记实验检测FUT4与α1，3岩藻糖的表达
(1)细胞总蛋白的提取
将细胞从培养箱中取出，弃去上清液，用PBS洗2次
然后根据细胞量加入适当的细胞裂解液，冰上孵育10分钟。
用蛋白刮刮取细胞，置于1.5mLEP管中，封口膜封口，置于沸水中煮15分钟。-20℃保存备用。
组织蛋白的提取
从-80℃冰箱中取出组织，置于冰上剪取适当的组织放入EP管中，加入组织蛋白裂解液，按100：1加入蛋白酶抑制剂，置于冰上研磨。
置于4℃孵育4-6h,每隔30min涡旋振荡器震荡15秒。组织蛋白裂解物于4℃离心10000g离心10min，收集上清液于新的EP管。
使用BCA蛋白质定量试剂盒对蛋白质进行定量，加入loading buffer煮沸变性15min。
SDS-PAGE电泳
制胶：玻璃板对齐放在制胶架上拧至1.0的档位，并确保不漏。配置10％分离胶和6％浓缩胶，充分摇匀。先将分离胶沿玻璃板的内面缓缓加入，后用无水乙醇液封，室温凝固30min。弃去乙醇，擦去残留的乙醇，然后加入浓缩胶，插入梳子，室温凝固30min，待胶体凝固后，小心拔出梳子，放于电泳液中备用。
上样：根据蛋白质定量的结果计算样本的上样体积，上样量为25-40μg
电泳：电泳过程中保持冰浴，用100V的电压进行电泳，待蛋白样品从浓缩胶进入分离胶后，将电压改为120V，实时观察蛋白Maker的位置，终止电泳。
转膜：小心拆开玻璃板根据目的分子量大小切取胶块，根据所切胶大小裁滤纸和醋酸纤维素膜(NC膜)。按照海绵垫、滤纸、膜、胶、滤纸、海绵垫的顺序，注意不要气泡，将其放入装有转膜液的转膜槽中。在电压为150V、电流为250mA转膜适当时间，转膜结束后可用丽春红染色，确认转膜的情况。
一抗孵育：配制一抗(兔抗人FUT4 1:1000；兔抗人IgM LTL 1:1000；兔抗人GAPDH1:2000)，4℃过夜孵育，次日捞出，TBST洗膜洗4次，每次10min。
二抗孵育：HRP标记的二抗(羊抗兔IgG 1:3000；羊抗兔IgM 1:3000)室温孵育1h。TBST洗膜洗4次，每次10min。
发光显影：将发光液A液、B液以1：1混匀，避光放置。NC膜用滤纸擦干，覆上发光液，置于Bio-Rad成像仪进行显色，Image Lab分析条带。
由图1可知，复发性流产患者的胎盘组织中FUT4与α1，3岩藻糖比正常妇女的胎盘组织中的FUT4与α1，3岩藻糖均明显减少，证明了FUT4与α1，3岩藻糖在复发性流产患者胎盘组织中异常低表达。
实施例2：
1、细胞免疫荧光检测不同实验组(Scramble对照组、转染FUT4 siRNA组、同时转染FUT4 siRNA和FUT4 cDNA组)的滋养层细胞中FUT4和α1，3岩藻糖的表达
爬片：细胞经胰酶消化后，800rpm，离心4min，新鲜培养基重悬，将细胞悬液放入带有爬片的培养皿中，让细胞长在爬片上。
收片：去除培养皿中的培养基，PBS洗3次、每次3min。
固定：向培养皿中倾斜加入4％的多聚甲醛，固定20min。
弃去多聚甲醛，PBS洗3次、每次3min。
封闭：挑选爬片放入湿盒，加入免疫染色封闭液封闭1h。
一抗孵育：从封闭液中夹出片子，滤纸吸干，孵上一抗，4℃过夜(兔抗人FUT4 1:150；兔抗人LTL 1:300)。
次日将爬片从冰箱湿盒中取出放在瓷孔板中，PBS洗6次、每次5min。
滴加荧光标记的二抗(FITC标记羊抗兔IgG 1:100，TEXAS RED AVIDIN D 1:200)，室温孵育1h，PBS洗6次、每次5min。
DAPI染核：爬片滴加DAPI室温染色10min(DAPI 1:4000)。
封片：PBS洗3次、每次3min；抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察拍照。
由图2A-C可知，转染FUT4 siRNA可以抑制滋养细胞中LTL的表达，而同时转染FUT4siRNA和FUT4 cDNA可以促进LTL的合成。
实施例3：
早孕绒毛外植体外迁移实验
(1)铺胶：将matrigel放于4℃冰箱中融化、用无血清培养基DMEM/F-12按1:2的比例稀释matrigel,轻轻吹打混匀，向96孔板中每孔加入50μL matrigel，尽量不要产生气泡，置于37℃培养箱中。
(2)从因非医学原因在附属医院妇产科手术室行人工流产的健康妇女获得妊娠早期绒毛组织，立即用预冷无菌PBS漂洗干净血块。
(3)在无菌的操作台中，将绒毛组织放入含有PBS的大皿中，剪成2-5mm的片段。
(4)小心的转移到96孔板的matrigel中，使其锚定在matrigel的中央。
(5)锚定4-6h后，加入完全培养基，倒置显微镜下观察形态并拍照记为0h。
(6)弃培养基，按照分组(Scramble组、FUT4 siRNA组和同时转染FUT4 siRNA和FUT4 cDNA组)进行转染，分别加入对应的无血清培养基。
(7)转染6h后，加入含有10％FBS的DMEM/F-12完全培养基，终止转染。
(8)在转染后第24h取出孔板动态观察并拍照，用Photoshop CS6软件测量EVTs自绒毛末端的外生性迁移的距离。
由图2E可知，与Scramble对照组相比，转染FUT4 siRNA组的绒毛细胞外生迁移的距离明显缩短，同时转染FUT4 siRNA和FUT4 cDNA组的绒毛细胞外生迁移的距离有所增长，证明了FUT4通过促进滋养层细胞α1，3岩藻糖的合成促进滋养层细胞迁移能力。
实施例4：
Transwell迁移侵袭实验
1)小室铺胶：将matrigel放于4℃冰箱中融化，用无血清培养基DMEM/F-12按1:9的比例稀释matrigel，轻轻吹打混匀，向Transwell小室中加入50μLmatrigel，尽量不要产生气泡，将小室放于24孔板中置于37℃培养箱。
(2)细胞计数：培养箱中取出不同组(Scramble组、FUT4 siRNA组和同时转染FUT4siRNA和FUT4 cDNA组)的细胞，经胰酶消化后，800rpm，离心4min用无血清培养基重悬，计数板计数3次，调节细胞浓度为2x105个/mL
(3)向24孔板加入700μL含10％FBS的DMEM/F-12培养基后轻轻放入Transwell小室，从细胞悬液中吸取200μL细胞悬液加入上室置于37℃培养箱中继续培养数小时。
(4)活细胞染料染色：像小室里面添加活细胞染料(Cell-Tracker Green CMGDA活细胞示踪探针)(1：1000)，甲醇固定15min，PBS漂洗小室2次，每次5min；用棉签轻轻擦掉小室内侧的细胞；倒置显微镜下随机选择3个不同的视野照相并计算细胞数；实验重复三次，统计结果。
由图2F可知，Transwell迁移侵袭实验证明了FUT4通过促进滋养层细胞α1，3岩藻糖的合成促进滋养层细胞的迁移侵袭能力。
实施例5：EdU增殖实验实验
(1)细胞培养：取对数生长期细胞，每孔5×103个细胞接种于96孔板中。
(2)EdU标记：待细胞贴壁后，用新鲜的DMEM/F-12完全培养基按照1000:1的比例稀释EdU溶液，制备50μM EdU培养基，每孔加入100μL置于37℃培养箱中孵育2小时，弃培养基。PBS清洗细胞2次，每次5min。
(3)细胞固定：每孔加入50μL 4％多聚甲醛室温孵育30min，弃去固定液；每孔加入50μL 2mg/mL的甘氨酸溶液，摇床孵育5min；弃甘氨酸溶液，加入PBS摇床清洗5min；弃PBS，加入100μL 0.1％Triton X-100摇床孵育10min；PBS清洗1次，5min。
(4)Apollo染色：每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液，室温避光摇床孵育30min；弃染色液每孔加入100μL 0.1％Triton X-100摇床清洗3次，每次10min，弃渗透剂。
(5)活细胞标记：用去离子水按照100:1的比例配置1×Hoechest33342反应液，每孔加入100μL，室温避光摇床孵育30min后弃反应染色液，加入100μL PBS清洗2次，倒置显微镜下观测拍照。
由图2D可知，EdU增殖实验证明了FUT4通过促进滋养层细胞α1，3岩藻糖的合成促进滋养层细胞的增殖能力。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种辅助诊断复发性流产的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为岩藻糖基转移酶FUT4和/或蛋白质的α1，3岩藻糖基化。
2.权利要求1所述的岩藻糖基转移酶FUT4和/或蛋白质的α1，3岩藻糖基化在制备辅助诊断复发性流产的试剂或试剂盒中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒的检测的方法包括免疫组织化学法、凝集素印记法、蛋白质免疫印迹法和免疫荧光法。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，蛋白质的α1，3岩藻糖基化能够被翅荚百脉根凝集素特异性识别，通过凝集素印记进行检测。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶FUT4通过免疫组织化学法、蛋白质免疫印迹法进行检测。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述检测的病理样本为绒毛组织。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述绒毛组织包括滋养层细胞、合体滋养层细胞和绒毛外滋养层细胞。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，FUT4低表达时，抑制滋养层细胞的增殖能力和迁移侵袭能力，导致复发性流产。
9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，蛋白质的α1，3岩藻糖基化减少时，抑制滋养层细胞的增殖能力和迁移侵袭能力，导致复发性流产。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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