CN109833469A - poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用。本发明将poFUT1作为RhoA信号通路激活剂，证明了其对滋养层细胞的增殖、迁移能力和胎盘血管生成能力的影响以及其作用机制，这将有助于深入理解胚胎植入机理的研究，并为临床上以糖为靶点的流产等妊娠相关疾病的诊断和治疗提供新的理论依据。

Description

poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物 中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用。

背景技术

胚胎着床是一个复杂的生物学过程，需要成熟的胚胎和接受态的子宫内膜同时建立。在胚胎植入的过程中，胚泡表面的滋养层介导胚胎和子宫内膜之间的识别，进而促进胚胎的植入、胎盘发育以及维持成功的妊娠。滋养细胞具有高侵袭性和增殖特性，在胚胎植入过程中发挥重要作用。在正常妊娠过程中，滋养层细胞能够降解细胞外基质、侵入母体内膜及血管，建立母胎之间的连接。胎盘血管网络的形成及发育包括通过形成新的血管和扩大原有血管以增加血流，保证妊娠期间有足够的血液灌注，是妊娠期间母体和胎儿之间的呼吸气体、营养物质和废物的交换的基础[1]。胎盘血管发育异常会导致各种妊娠并发症，如胎儿生长受限、子痫前期、胚亡或流产[2-4]。

胎盘血管网络的建立包括血管发生、血管形成和滋养层细胞介导的螺旋动脉的重塑。血管形成是指孕早期通过分支或拉长原先存在的血管以建立新的血管网络的过程。胎盘血管的生成与重塑主要是由血管内皮细胞和滋养层细胞相互作用，共同完成的。胚泡植入后，胎盘表面的细胞滋养层细胞(Cytotrophoblast,CTBs)，可以分化为绒毛外滋养细胞(Extravillous cytotrophoblasts,EVTs)负责建立植入部位，或分化为合体滋养细胞(Syncytiotrophoblast,STB)覆盖在胎盘表面，调节母胎界面分子交换[5]。本研究，我们主要探讨EVTs在螺旋动脉重塑过程中发挥的作用。在孕早期，绒毛外滋养层细胞附着于子宫内膜上皮以后可以形成两个不同的细胞群，间质滋养细胞(iCTB) 和血管内滋养细胞(eCTB)，二者均参与母体螺旋小动脉的重塑，促进胎盘血管形成[6,7]。

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，在许多生理和病理过程中均有着重要的作用，包括炎症、胚胎植入、肿瘤转移。蛋白质糖基化是一种酶促反应，可在糖链和蛋白质之间产生糖苷键。蛋白质O-岩藻糖基化主要由两种糖基转移酶催化合成，蛋白质O-岩藻糖基转移酶1(poFUT1)和蛋白质O-岩藻糖基转移酶2(poFUT2)。poFUT1定位于内质网(ER)，可催化类表皮生长因子(EGF)结构域的底物，将L- 岩藻糖直接以糖苷键的形式连接到蛋白质的丝氨酸/苏氨酸残基上。已有报道表明， Notch受体EGF重复上的O-岩藻糖残基对其功能必不可少[8]，裸鼠胚胎的表型证明 poFUT1与Notch信号传导途径有关[9,10]。O-岩藻糖基化的异常可能影响胚胎的正常发育，导致胚胎致死[11]。实验室前期研究表明，poFUT1促进滋养层细胞在母胎界面的迁移和侵袭[12]，也促进滋养细胞增殖[13]。然而，poFUT1在胚胎血管生成中的作用及其具体机制尚不明确。

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发明内容

本发明提供了一种RhoA信号通路激活剂poFUT1，及其在制备血管生成药物中的应用。证明了其对滋养层细胞的增殖、迁移能力和血管生成能力的影响以及其作用机制，这将有助于深入理解胚胎植入机理的研究，并为临床上以糖为靶点的流产等妊娠相关疾病的诊断和治疗提供新的理论依据。

本发明提供poFUT1在制备血管生成药物中的应用。所述血管优选为胎盘血管。

进一步地在上述发明内容中，本发明提供了poFUT1在制备RhoA信号通路激活剂中的应用。所述激活剂包括含有poFUT1基因的质粒或含有poFUT1基因的蛋白。

本发明通过Real-time PCR、Western blot、Transwell和基质胶成管实验证明了poFUT1可以促进滋养层细胞的血管的形成。

本发明通过O-Fucose试剂盒检测滋养细胞总O-岩藻糖的表达，从而证明转染poFUT1 siRNA，滋养细胞中总O-岩藻糖表达降低，而在此基础上转染poFUT1 cDNA 可以回调O-岩藻糖的合成。

本发明通过细胞周期蛋白的Western blot、Transwell、基质胶成管实验和RhoA信号通路的Western blot实验证明了poFUT1通过增加滋养层细胞O-岩藻糖基化的合成促进其增殖、迁移和血管形成。

本发明通过对鸡胚绒毛尿囊膜实验证明了与PBS组相比，加绒毛组织处理组尿囊膜上毛细血管分布和充血状态显著增加。而绒毛组织经poFUT1 siRNA处理后，与未经处理绒毛组相比，血管分支减少，充血状态降低。

发明有益效果

1.poFUT1可以促进滋养层细胞的增殖、迁移，同时可以促进滋养细胞的血管生成。

2.poFUT1可以促进滋养层细胞O-岩藻糖的生物合成，进而影响血管生成。

3.poFUT1通过激活RhoA信号通路，进一步提高血管生成能力。

附图说明

图1为poFUT1促进滋养层细胞的血管形成(图1A为Real-time PCR检测poFUT1cDNA和poFUT1 siRNA的转染效率结果；图1B为Western blot检测poFUT1 cDNA 和poFUT1siRNA的转染效率结果；图1C为Transwell实验结果；图1D为Western blot 检测血管生成相关蛋白表达结果；图1E为基质胶成管实验结果)；

图2为O-Fucose试剂盒检测滋养细胞表面总O-岩藻糖的表达；

图3为poFUT1通过增加滋养层细胞O-岩藻糖基化的合成促进其增殖、迁移和血管形成(图3A为周期蛋白的Western blot结果；图3B为Transwell实验结果；图3C为基质胶成管实验结果；图3D为RhoA信号通路的Western blot结果；)；

图4为鸡胚绒毛尿囊膜体内验证。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均由商业途径获得，或者由常规方法制备。

使用GraphPad Prism 6.0对数据进行整理和分析，每个数据代表多个独立实验的方法和结果，结果以均数±标准差或对照组的％来呈现，t检验计算显著性。以 *p<0.05为有显著性差异，**p<0.01为有较大显著差异，***p<0.001为有极显著差异。

1.动物模型

受精蛋(种蛋)购自于北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

2.细胞

人绒毛膜滋养细胞(HTR-8/SVneo)购自于ATCC细胞库(CRL-3271^TM)。

3.试剂

RT-PCR试剂盒(AHE3187A，TaKaRa)；RNAiso Plus试剂(910819109，TaKaRa)；引物(GAPDH，DLD17371，TaKaRa；poFUT1，HG1705189045，invitrogen)；ECL 化学发光试剂盒(180129-22，Advansta)；poFUT siRNA(69253，Gene pharma)；poFUT1 cDNA(GenePharma)；poFUT1 mutant(GenePharma)；质粒提取试剂盒(D6948-02， OMEGA bio-tek)；O-Fucose检测试剂盒(4351379，Thermo Fiser Scientific)； CellTracker^TM Green CMFDA(1888285，Life Sciences)；BD基质胶(356234，Corning)；小牛血清白蛋白(BSA)(V900933，Sigma公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒 (MK164230，Thermo Fiser Scientific)；考马斯亮蓝G-250(27815，Sigma)；RhoA 抑制剂(S7719，Selleck)。抗体：poFUT1(14929-1-AP，Proteintech)；GAPDH (10494-1-AP，Proteintech)；CD31(11265-1-AP，Proteintech)；CD34(ab81289，abcam)；VEGFR2(ab11939，abcam)；VE-cadherin(H2217，Santa Cruz Biotechnology)；CDK2(AF1063，Beyotime)；CDK6(AF2536，Beyotime)；Cyclin D1(AF0126，Beyotime)；CyclinE2(AF2494，Beyotime)；p21(AP021-1，Beyotime)；p27(AP027-1， Beyotime)，PCNA(24036-1-AP，Proteintech)；RhoA(phospho-ser188)(AF8020， Affinity)；RhoA(ESAP15784，Elabscience)；LIMK1(ENT2563，Elabscience)； phospho-LIMK1(ENP0161，Elabscience)；confilin(ENT1006，Elabscience)； phospho-confilin(ENP0070，Elabscience)。

实施例1人绒毛膜滋养层细胞转染实验

1.细胞培养：

将人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)维持在含10％FBS、100U/m青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中，置于37℃、5％CO₂、90％的湿度条件下培养，生长培养基每2～3天更新一次。当融合度达到80％～90％时，使用0.25％的胰酶消化，进行传代培养或其他处理。

2.质粒的提取

(一)质粒转化

(1)LB固体培养基的制备：分别称取10克蛋白胨(Tryptone)、5克酵母提取物(Yeast extract)和10克NaCl溶于800毫升三蒸水中，充分混匀。滴加NaOH，调pH至7.0，加三蒸水定容至1000毫升，加入15g琼脂粉(Agar)，高压蒸汽灭菌后冷却至60℃左右，铺制平板，4℃保存。

(2)取2μL质粒(poFUT1 cDNA，poFUT1 mutant，均为GenePharma购买)加入到 50μL的感受态细胞E.coli DH5α中，轻轻混匀后缠上封口膜，放置冰上30～40分钟，其中poFUT1cDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示，poFUT1 mutant的基因序列如 SEQ ID NO.2所示，构建质粒的载体为pEX-3(pGCMV/MCS/Neo)。

(3)将装有质粒及感受态细胞的EP管放入42℃的水浴锅中45s～90s。

(4)迅速将EP管放回冰上冷却2分钟后，往EP管中加800μL的LB液体培养基，37℃，250rpm/min，摇荡培养1小时，使菌体生长。

(5)取体积不同的转化细菌平铺于事先准备好的LB固体琼脂平板上，在室温放置20 分钟后，转移至37℃恒温培养箱中倒置培养12～16小时，直到菌落长出。

(二)菌液的制备

(1)LB液体培养基：分别称取10克蛋白胨(Tryptone)、5克酵母提取物(Yeastextract) 和10克NaCl溶于800毫升三蒸水中，充分混匀后用三蒸水定容至1000毫升，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

(2)将已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液(50mg/ml的Kanamycin以1：1000的比例加入到培养基中)中，于37℃，150rpm/min的恒温摇箱中震荡摇菌 12～16小时。

(三)使用质粒提取试剂盒进行质粒提取

(1)取1.5～5mL菌液于离心管中，室温10000g/min离心2min收集沉淀。

(2)吸弃培养基，向细菌团块中加250μL solutionⅠ，重悬浮沉淀。

(3)加入250μL solutionⅡ，轻轻混匀，上下颠倒4～6次，避免剧烈振荡，冰上静置2min。

(4)加入125μL冰上预冷的Buffer N3，颠倒数次，直至出现白色絮状沉淀，12000g/min 离心10分钟。

(5)小心吸取上清，转移至干净的1.5mL离心管，加入0.1倍体积的ETR Buffersolution (冰上保存)，冰预10min，期间颠倒数次。

(6)42℃孵育5min，室温12000g/min离心4～5min。

(7)移取上清至另一个1.5mL离心管，加入0.5倍体积无水乙醇，轻轻混匀，室温孵育1～2min。

(8)将HiBind DNA mini column放置在2mL收集管中，移取上清700μL至此收集管中，10000g/min离心2min。

(9)重复步骤(8)两次。

(10)用500μL Buffer HBC冲洗上述柱，10000g/min离心1min洗去残余蛋白。

(11)弃去冲洗液，用乙醇稀释的DNA Wash Buffer 700μL冲洗上述柱，10000g/min离心2min。

(12)重复步骤(11)反离心。

(13)空转13000g/min离心2min。

(14)弃去冲洗液，将柱至于另一个1.5mL的离心管，加入30～50μLEncbtoxin-freeElution Buffer至柱上，13000g/min离心2min洗提DNA，最后弃去蓝柱。

(15)微量核酸定量仪测定DNA浓度：

poFUT1 cDNA:1457ng/μL；260/280＝1.91；poFUT1 mutant:1136ng/μL； 260/280＝1.90。

3.细胞转染：

①当细胞融合度达60～70％左右时，弃去培养基，用PBS洗两遍，开始转染。

②A液：将4μg poFUT1 cDNA、4μg poFUT1 mutant、100pmol/L poFUT1 siRNA 分别溶于250μL无血清的DMEM/F12中，轻轻混匀，静置5min。

③B液：取3μL Lipo2000溶于250μL无血清的DMEM/F12中，轻轻混匀，静置 5min。

④将A、B液体轻轻混匀，混匀后静置20min，形成DNA和脂质体复合物。

⑤将④中形成的复合物轻轻混匀，分别加入不同的处理组，置于恒温培养箱中培养6～8h。

⑥弃去皿中原有的培养基，换成含有10％FBS的DMEM/F12培养基，继续培养36～48h用于其他处理。

实施例2 poFUT1促进滋养层细胞的血管形成

1.RT-PCR检测poFUT1 cDNA、poFUT1 siRNA的转染效率实验

(1)使用RNAiso Plus试剂盒进行总RNA的提取

①将实施例1转染处理好的细胞从恒温培养箱中取出，弃去培养基，用高压过的PBS洗1～2遍，吸干余液。

②加1mL Trizol，反复吹打，然后置于冰上，静置5min，使其完全裂解。

③将溶液转至EP管中，加入200μL氯仿，剧烈震荡20s，然后置于冰上，静置 10min。

④这时EP管中液体已分层，将分层的液体在4℃以12000rpm/min离心10min。

⑤将上层水相转移至一新的EP管中，加入0.5mL预冷的异丙醇，上下颠倒使其均匀混合，-20℃静置2h。

⑥将溶液于4℃，12000g离心15min，倒掉上清液，加入1mL 75％的乙醇，充分混合。

⑦4℃，12000rpm/min离心5min，倒掉上清，用滤纸小心吸尽内壁液体，室温放置，待RNA沉淀干燥。

⑧加20～30μL的去离子水于EP管中，轻轻吹打沉淀，使RNA充分溶解，室温孵育3～5min。微量核酸定量仪测定RNA的浓度及纯度为：Control:931.2ng/μL， 260/280＝2.0；Vector:948.2ng/μL，260/280＝1.94；poFUT1 cDNA:1032.1ng/μL， 260/280＝1.92；Scramble RNA:874ng/μL，260/280＝2.0；poFUT1 siRNA-1:968.2ng/μL， 260/280＝2.0；poFUT1 siRNA-2:938.7ng/μL，260/280＝1.98；poFUT1 siRNA-3: 984.1ng/μL，260/280＝1.99。-20℃一周内使用，-80℃长期保存。

(2)RNA反转录生成cDNA

①RNA提前取出，4℃解冻。RNA模板50ng～5μg，加入1μL oligo dT(50μmol/L)，然后用DEPC水补齐至8μL体系，轻轻混匀，冰上静置。

②使用RT-PCR试剂盒，反应体系按下面顺序加入：

轻轻混匀，离心10s。按下列条件反应：25℃10min，42℃30min，85℃5s，4℃ 10min。

(3)PCR反应

2*Trans Start Mix	10μL
		Forward	0.5μL
Reverse	0.5μL
		cDNA(DEPC水稀释)	2μL
ddH<sub>2</sub>O	补齐至20μL

冰上操作，离心10s。按下列条件反应：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火30s，扩增40个循环。

上述PCR扩增引物序列如下表所示：

实验结果如图1A所示，结果表明转染poFUT1 cDNA组，poFUT1的表达显著增加，而转染poFUT1 siRNA组，poFUT1的表达降低。

2.Western blot检测poFUT1 cDNA、poFUT1 siRNA的转染效率实验

(1)总蛋白提取：取出处理后的细胞，弃上清，将细胞用PBS洗2次，然后根据细胞量加入适当的细胞裂解液，冰上孵育10分钟。用蛋白刮刮取细胞，置于1.5mL EP管中，封口膜封口，置于沸水中煮15分钟。细胞裂解物通过在9000g离心15分钟澄清，收集上清液。使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准，用G-250测定蛋白质浓度， -20℃保存备用。

(2)BCA蛋白定量

①取7个EP管标号1～7，管2～6分别加入30μL去离子水，管6加入2μg/μL的 BSA 30μL，充分混匀，从管6中取30μL加入到管5，管5混匀后取30μL到管4，依次稀释到管2，管1直接加入30μL去离子水，管7加入30μL BSA。

②将待测样品稀释适当倍数(稀释5倍，5μL样品+20μL去离子水)。

③使用BCA蛋白含量检测试剂盒，工作液以A液：B液＝50：1配置，准备新的 EP管，每个EP管加200μL工作液。

④标准品从①管1～7顺序依次取20μL加于③200μL工作液中，稀释好的样品取 20μL加于200μL工作液中。

⑤将④每管取200μL加于96孔板中，将微孔板密封，37℃孵育30min，用酶标仪上测定598nm的吸光值。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，将样品的OD值代入计算样品的浓度。

(3)SDS-PAGE电泳

①装板：清洗玻璃板，对齐夹紧，垂直卡在胶架上，加入去离子水，静置10min，检查玻璃板是否漏水。倒掉水，擦干玻璃板待用。

②灌胶：按下表配置分离胶和浓缩胶，充分摇匀。先将分离胶沿玻璃板的内面缓缓加入，小心不要产生气泡，留出2cm左右的空间。加入无水乙醇封胶，室温放置30～40min。弃去乙醇，擦去残留的水分，缓慢加入浓缩胶，迅速插入梳子，室温放置 30～40min，待胶体凝固，小心拔出梳子，放于电泳液(电泳缓冲液：分别称量甘氨酸 14.11g，Tris 3g，SDS 1g，加入去离子水充分搅拌溶解，定容至1L)中备用。

分离胶和浓缩胶配方：

	12％分离胶(mL)	6％浓缩胶(mL)
			蒸馏水	3.3	2.25
30％聚丙烯酰胺溶液	4	1
			浓缩胶缓冲液	-	1.25
分离胶缓冲液	2.5	-
			10％SDS溶液	0.1	0.05
10％AP溶液	0.1	0.05
			TEMED	0.006	0.004

③电泳：将胶固定于电泳槽内，加入电泳液，用针管冲洗孔道。根据蛋白浓度，用微量加样器加样，每个孔道加40μg的蛋白样品。盖好上盖，连接电泳仪开始电泳。先将电压控制在80～100V，30min后将电压调至130V，电泳过程中需保持电压稳定。为保证电泳过程中温度不至于过高，需冰浴。根据目的条带分子量要求，适时终止电泳。

④转膜：小心将板拆离，根据分子量要求切胶。根据所切胶大小裁滤纸和醋酸纤维素膜(NC)。按电转移的方法将蛋白转移至NC膜上。丽春红染色，观察转膜情况。

⑤封闭：将NC膜放于5％的脱脂奶粉，室温放置2h。

⑥抗体孵育：配置一抗(兔抗人poFUT1 1：1000；兔抗人GAPDH 1：2000)，4℃过夜孵育，次日，TBST洗膜，15min洗3次。然后用HRP标记的二抗(羊抗兔IgG 1： 3000；羊抗鼠IgG1：2000)室温孵育1h。TBST洗膜，15min洗3次。

⑦HRP-ECL显色法：发光液A液、B液以1：1的混匀，避光放置。将NC膜用滤纸擦干，添加发光液，置于Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System进行显色，用 Imaging Lab分析条带。

结果：实验结果如图1B所示，结论与上述RT-PCR检测poFUT1 cDNA、poFUT1 siRNA的转染效率实验所得结论一致。

3.Transwell实验

(1)制备细胞悬液：分别将转染poFUT1 cDNA和poFUT1 siRNA的细胞用0.25％的胰酶消化处理，低速离心3～5min，用PBS洗1～2遍，用无血清培养基重悬细胞。用计数板测悬液细胞密度，计数不少于3次。

(2)接种细胞：将5×10⁵个细胞加入到Transwell上室中，24孔板下室一般加入600μl含FBS的培养基，过程中尽量避免气泡的产生，置于培养箱中培养12～24h。

(3)结果统计：取出transwell小室，弃去小室中的培养基，PBS洗两遍，小室中加1mL甲醇固定10min，弃去甲醇，0.1％结晶紫染色20min，PBS洗2遍，用棉签小心擦去上室中未迁移过去的细胞，显微镜观察计数。

结果如图1C所示，与对照组相比，转染poFUT1 cDNA的滋养细胞迁移能力明显增强，转染poFUT1 siRNA组滋养细胞迁移能力降低。

4.Western blot检测血管生成相关蛋白的表达实验

方法：具体步骤如上述Western blot检测poFUT1 cDNA、poFUTI siRNA的转染效率实验步骤，区别在于一抗使用(鼠抗人CD31 1：1000；兔抗人CD34 1：1000；兔抗人VEGFR2 1：1000；兔抗人VE-cadherin 1：1000)。

结果：如图1D所示，转染poFUT1 cDNA组，血管相关标志物CD31、CD34和血管生成相关蛋白(VE-cadherin、VEGFR2)的表达显著增加，滋养细胞的成管能力显著增强。

5.小管形成实验

(1)预先将基质胶置于4℃下解冻，并对实验所需的枪头进行预冷。

(2)用预冷的枪头，将基质胶与PBS以1：1轻柔混匀，尽量减少气泡的产生，迅速将基质胶置于96孔板中，并在细胞培养箱中孵育1h。

(3)将实施例1转染处理后的细胞更换为含有CellTracker^TM Green CMFDA染料的培养基，在培养箱中培养15～30min。

(4)用PBS洗涤3次，用0.25％胰蛋白酶消化，以800rpm/min离心5～8min，弃去上清液。

(5)细胞悬浮于无血清培养基中，使细胞密度约为5×10⁴/mL，将细胞置于固化的基质胶上并置于培养箱中。孵育3h后，在显微镜下观察小管形成。

实验结果如图1E所示，结论与上述Western blot检测血管生成相关蛋白的表达实验结果一致。

实施例3 O-Fucose试剂盒检测滋养细胞表面总O-岩藻糖的表达实验

(1)将实施例1转染处理的细胞培养液弃掉，更换为25～50μM浓度炔烃/叠氮化合标记物的培养液，继续培养24～48h。

(2)将细胞从培养箱中取出，PBS洗3次，每次5min。

(3)加裂解液(1％SDS，50mM Tris-HCl，pH8.0)200μL，反复吹打，冰上孵育 15～30min，放于1.5mL的EP管中，超声1～2s，涡旋5min。

(4)4℃，13000～18000g/min，离心5min，将上清移至新的EP管中，BCA测定蛋白浓度，-20℃备用。

(5)按下表加入各成分，涡旋5s。

(6)加入Copper(II)sulfate(CuSO4)(Component B)10μL，涡旋5s。

(7)加入reaction buffer additive 1(Component C)10μL，涡旋5s，室温静置2～3min。

(8)加入reaction buffer additive 2(Component D)20μL，涡旋5s，此时发现液体变为橙色，继续涡旋25min。

(9)加入甲醇600μL，混匀，简短震荡。

(10)加入氯仿150μL，简短震荡。

(11)加入去离子水400μL，简短震荡。

(12)4℃，13000～18000g/min离心5min，小心将上清移至一新的EP管，橙色部分收集保存。

(13)上清中加甲醇450μL，混匀，简短震荡。然后以4℃，13000～18000g/min 离心5min，弃上清。

(14)重复步骤(13)一次，去掉残余反应成分。

(15)得到的沉淀溶于20μL的蛋白裂解液中，通过实施例3Western blot实验检测HTR-8/SVneo表面O-Fucose的表达。

结果：如图2所示，poFUT1是蛋白质O-岩藻糖基转移酶，转染poFUT1 siRNA，滋养细胞中总O-岩藻糖表达降低，而在此基础上转染poFUT1 cDNA可以回调O-岩藻糖的合成。

实施例4 poFUT1通过增加滋养层细胞O-岩藻糖基化的合成促进其增殖、迁移和血管形成

1.细胞周期蛋白的Western blot实验

方法；实验步骤同实施例2中Western blot实验步骤，区别点在于一抗使用(鼠抗人p21 1:500；鼠抗人p27 1:500；兔抗人CDK2 1:1000；兔抗人CDK6 1:1000；兔抗人cyclinD1 1:1000；兔抗人cyclinE2 1:1000；兔抗人PCNA 1：1000)。

结果：细胞周期蛋白的Western blot实验结果如图3A所示，转染poFUT1 cDNA 可以促进滋养层细胞的增殖。

2.Transwell实验

方法；实验步骤同实施例2中Transwell实验步骤，区别点在于此实验中细胞分别转染poFUT1 cDNA和poFUT1 mutant处理。

结果：Transwell实验结果如图3B所示，转染poFUT1 cDNA，滋养层细胞的迁移能力明显增强，而转染poFUT1 mutant组，滋养细胞的迁移能力降低。

3.小管形成实验

方法；实验步骤同实施例2中小管形成实验步骤，区别点在于此实验中细胞分别转染poFUT1 cDNA和poFUT1 mutant处理。

结果：小管形成实验结果如图3C所示，转染poFUT1 cDNA，滋养层细胞的成管能力明显增强，而转染poFUT1 mutant组，滋养层细胞的成管能力明显低于poFUT1 cDNA组。

4.RhoA信号通路的Western blot实验

方法；实验步骤同实施例2中Western blot实验步骤，区别点在于一抗使用(兔抗人LIMK 1：1000；兔抗人p-LIMK 1：1000；兔抗人cofilin 1：1000；兔抗人p-cofilin 1：1000；兔抗人RhoA 1：500；兔抗人p-RhoA 1：2000)。二抗仅用HRP标记的二抗(羊抗兔IgG 1：3000)。

结果：RhoA信号通路的Western blot实验结果如图3D所示，转染poFUT1 cDNA，RhoA-GTP、p-LIMK和p-cofilin表达增强。而加RhoA信号通路抑制剂(C3 transferase)，上述蛋白的磷酸化水平显著降低。

实施例5鸡胚绒毛尿囊膜实验

(1)受精蛋购买于北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。置于温度为37.8℃，湿度为70％～75％的生物孵化箱中孵化培养。

(2)取8日胚龄的鸡胚，在检卵灯下观察血管的发育情况，并用铅笔标明气室的位置。

(3)用70％的酒精消毒气室的顶部及四周，并用磨卵器在气室顶部磨一个方形裂痕，除去蛋壳造成“蛋窗”。

(4)轻轻将“蛋窗”处的壳膜撕掉，勿伤及下面的绒毛尿囊膜，将消毒处理过的硅胶环(直径＝0.5cm，高＝0.2cm)置于毛细血管分布密集且避开大血管处，将PBS、人绒毛组织或经poFUT1 siRNA(5nM)处理的人绒毛组织分别置于硅胶环内。

(5)用无菌胶布封口，将胚胎置于敷箱中继续培养。

(6)孵育72小时后，用无菌镊子扩大开口处，用数码相机拍摄硅胶环及其周围的区域，并在image J分析血管数量。

实验结果如图4所示，与PBS处理组相比，加绒毛组织处理组尿囊膜上毛细血管分布和充血状显著增强。而绒毛组织经poFUT1 siRNA处理后，与未经处理绒毛组相比，血管分支减少，充血状态降低。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学

<120> poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用

<130> 2019

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 583

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgggcgccg ccgcgtgggc acggccgctg agcgtgtctt tcctgctgct gcttctgccg 60

ctcccgggga tgcctgcggg ctcctgggac ccggccggtt acctgctcta ctgcccctgc 120

atggggcgct ttgggaacca ggccgatcac ttcttgggct ctctggcatt tgcaaagctg 180

ctaaaccgta ccttggctgt ccctccttgg attgagtacc agcatcacaa gcctcctttc 240

accaacctcc atgtgtccta ccagaagtac ttcaagctgg agcccctcca ggcttaccat 300

cgggtcatca gcttggagga tttcatggag aagctggcac ccacccactg gccccctgag 360

aagcgggtgg catactgctt tgaggtggca gcccagcgaa gcccagataa gaagacgtgc 420

cccatgaagg aaggaaaccc ctttggccca ttctgggatc agtttcatgt gagtttcaac 480

aagtcggagc tttttacagg catttccttc agtgcttcct acagagaaca atggagccag 540

aggcgtgaga atcactcctg tgttacctta ctcttcccaa ggt 583

<210> 2

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

atgggcgccg ccgcgtgggc acggccgctg agcgtgtctt tcctgctgct gcttctgccg 60

ctcccgggga tgcctgcggg ctcctgggac ccggccggtt acctgctcta ctgcccctgc 120

atggggcgct ttgggaacca ggccgatcac ttcttgggct ctctggcatt tgcaaagctg 180

ctaaaccgta ccttggctgt ccctccttgg attgagtacc agcatcacaa gcctcctttc 240

accaacctcc atgtgtccta ccagaagtac ttcaagctgg agcccctcca ggcttaccat 300

cgggtcatca gcttggagga tttcatggag aagctggcac ccacccactg gccccctgag 360

aagcgggtgg catactgctt tgaggtggca gcccagcgaa gcccagataa gaagacgtgc 420

cccatgaagg aaggaaaccc ctttggccca ttctgggatc agtttcatgt gagtttcaac 480

aagtcggagc tttttacagg catttccttc agtgcttcct acagagaaca atggagccag 540

agattttctc caaaggaaca tccggtgctt gccctgccag gagccccagc ccagttcccc 600

gtcctagagg aacacaggcc actacagaag tacatggtat ggtcagacga aatggtgaag 660

acgggagagg cccagattca tgcccacctt gtccggccct atgtgggcat tcatctggcc 720

attggctctg actggaagaa cgcctgtgcc atgctgaagg acgggactgc aggctcgcac 780

ttcatggcct ctccgcagtg tgtgggctac agccgcagca cagcggcccc cctcacgatg 840

actatgtgcc tgcctgacct gaaggagatc cagagggctg tgaagctctg ggtgaggtcg 900

ctggatgccc agtcggtcta cgttgctact gattccgaga gttatgtgcc tgagctccaa 960

cagctcttca aagggaaggt gaaggtggtg agcctgaagc ctgaggtggc ccaggtcgac 1020

ctgtacatcc tcggccaagc cgaccacttt attggcaact gtgtctcctc cttcactgcc 1080

tttgtgaagc gggagcggga cctccagggg aggccgtctt ctttcttcgg catggacagg 1140

ccccctaagc tgcgggacga gttctga 1167

Claims (4)

1.poFUT1在制备血管生成药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血管为胎盘血管。

3.poFUT1在制备RhoA信号通路激活剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述激活剂包括含有poFUT1基因的质粒或含有poFUT1基因的蛋白。