CN109925509A - 一种治疗绒毛膜癌的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗绒毛膜癌的药物，属于生物医药技术领域。本发明将uPAR N‑糖基化修饰蛋白作为一个新靶点，证明了此靶点突变后可以抑制滋养层细胞的增殖迁移能力，为绒毛膜癌的治疗以及胚胎植入干预提供新的理论依据。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗绒毛膜癌的药物。
背景技术
胚胎着床是建立成功妊娠的基础，具有侵入性的成熟的胚胎进入子宫腔内，识别并粘附在处于接受态的子宫内膜上，穿透子宫内膜上皮并定植到基质这一系列过程。其中，胚胎的滋养层细胞是胚胎侵入子宫内膜的真正执行者。上皮间充质转化(EMT)即上皮细胞向间充质细胞的转化，广泛发生于胚胎植入、肿瘤转移、组织重建等生理及病理过程。细胞在此过程中除了会发生形态上的变化，从紧密排列，相互连接的状态变为结构松散，鲜有连接的状态，同时在分子水平上，一些标记分子也会发生相应的改变，如E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达量下降，N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)等表达量上升。在胚胎植入过程，滋养层细胞发送EMT的变化，滋养层细胞从紧密排列的状态变成带有伪足的长梭形，迁移侵袭能力增强，有助于滋养层细胞植入到子宫基质中。
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)，是由GPI锚定的细胞膜受体，分子量为55～60KDa，它是一种高糖基化的蛋白质，其去糖基化形式的分子量约为35KDa。根据糖基化位点预测，uPAR有5个糖基化位点，分别是Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255。uPAR含有三个同源结构域(DI，DII，DIII)，每个结构域含有大约90个氨基酸，其中DI结构域具有与uPA的ATF区结合的能力。uPAR含有5个N连接糖链，DI区有1个N连接糖链(Asn74)，DII(Asn184，Asn194)和DIII(Asn222，Asn255)分别有2个N连接糖链。uPAR过度表达可以导致绒毛膜癌，而uPAR表达降低可以导致胚胎植入不全甚至流产。对uPAR的晶体结构进行研究发现，uPA的受体结合模块与uPAR的中心腔结合，从而使外部的受体表面可以结合其他蛋白质分子，如整合素(integrin)和玻连蛋白(vitronectin)。uPAR结合并激活uPA，将无活性的纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，同时将细胞外基质成分降解，并且激活了基质金属蛋白激酶，从而促进细胞的迁移侵袭。EMT是一个十分复杂的过程，其包含细胞骨架的动态重组和与细胞基质的粘附关系。uPAR在许多细胞中都参与了细胞运动的过程，除了能与uPA结合后，降解胞外基质促使细胞迁移，uPA与uPAR形成的复合体再与其他跨膜蛋白如EGFR，VEGFR，integrin等结合，进而引起细胞内一系列信号通路，促进细胞迁移。肿瘤细胞中的uPAR高表达，提示着其具有增强细胞转移与侵袭的能力，且它的存在多表明预后不良。
糖基化是蛋白质翻译后加工修饰的一种，分为N-糖基化和O-糖基化，其可以对细胞内的许多生理功能进行调控，包括细胞与细胞间，细胞与细胞质基质间的联系，细胞增殖、存活以及免疫系统反应等。许多研究表明，异常的N-糖基化与不孕等具有十分密切的联系。
整合素(integrin)是一种跨膜受体，参与细胞通讯以及细胞的运动。由于uPAR缺乏胞浆及跨膜部分的结构，所以uPAR与整合素之间的相互作用对于其胞内信号的传递是很有必要的。本实验中，我们选择了FAK-p130Cas-DOCK-Rac信号通路，来证明uPAR N-糖基化在细胞迁移过程中的作用。
发明内容
本发明的目的如下：
本发明提供了尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)N-糖基化在细胞上皮-间充质转化(EMT)过程中的应用，并提供了一个治疗绒毛膜癌药物的新靶点。
uPAR的糖基化位点DI(Asn74)，DII(Asn184，Asn194)和DIII(Asn222，Asn255)中，M1(Asn74)突变和M5(Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255)突变均可抑制uPAR导致细胞EMT的作用。
uPAR N-糖基化位点的突变减弱影响其与uPA的结合能力，减少MMPs的分泌，从而降低滋养层细胞的迁移侵袭能力。
uPAR N-糖基化位点的突变抑制其与整合素β-1的结合，通过抑制下游FAK信号通路的激活进而抑制滋养层细胞的迁移能力。
技术方案：
本发明提供了一种治疗绒毛膜癌的药物，所述药物对uPAR N-糖基化修饰蛋白的Asn74位点或Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255位点进行突变。
进一步地，将上述Asn74位点碱基AAC突变为CAA，将Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255位点碱基AAC突变为CAA。
进一步地，编码Asn74突变位点蛋白的基因序列为SEQ ID NO.1，编码Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255突变位点蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2。
具体的，上述药物为siRNA或糖苷酶。
本发明利用Real-time PCR和Western blot检测转染uPAR过表达(uPAR-cDNA)及MUT1、MUT5突变质粒(uPAR-MUT1，uPAR-MUT5)后人滋养层细胞(JAR)细胞中uPAR的表达水平。通过Western blot，细胞免疫荧光，Transwell等方法检测uPAR N-糖基化修饰对于JAR细胞EMT的影响。
本发明利用免疫共沉淀，细胞免疫荧光和明胶酶谱，检测转入uPAR过表达(uPAR-cDNA)以及突变质粒(uPAR-MUT1，uPAR-MUT5)后对uPAR与uPA的结合能力的影响。
本发明利用Western blot，细胞免疫荧光观察转染uPAR过表达(uPAR-cDNA)以及突变质粒(uPAR-MUT1，uPAR-MUT5)后对其与整合素(integrinβ-1)相互作用能力的影响及其所介导的FAK信号通路的激活情况，利用细胞免疫荧光对转染uPAR过表达(uPAR-cDNA)以及突变质粒(uPAR-MUT1，uPAR-MUT5)的JAR细胞中对其细胞骨架形成的影响。
有益效果：
通过改变uPAR上N-糖基化修饰可以改变细胞EMT过程，影响细胞迁移和侵袭能力。深入了解uPAR上N-糖基化的作用机制，提供了一个研发药物的靶点。
附图说明
图1：uPAR及uPAR突变在胚胎滋养层细胞(JAR)上皮-间充质转化(EMT)中的作用(图1A为Real-time PCR检测结果；图1B和1C为Western blot检测结果；图1D和1E为免疫荧光结果；图1F为细胞形态；图1G为Transwell细胞体外迁移侵袭实验结果；图1H为图1F和图1G的统计学结果)；
图2：uPAR过表达及突变影响其与uPA的结合能力(图2A为免疫荧光结果；图2B为免疫共沉淀结果；图2C为明胶酶谱实验结果)；
图3：uPAR N-糖基化突变通过抑制与integrinβ-1的结合进而抑制FAK信号通路影响细胞EMT(图3A为免疫共沉淀结果；图3B为免疫荧光结果；图3C为Western blot检测FAK信号通路中的下游信号分子的表达结果；图3D为细胞骨架实验结果)。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
每次实验重复三次以上，结果以均数标准差(±SD)表示。组间差异运用SPSS 13.0中的单因素方差和t检验进行分析。以*P＜0.05有显著性差异，***P＜0.001有极显著差异。
实施例1人滋养层细胞瞬时转染实验
1.细胞培养：人滋养层细胞(JAR细胞)(HTB-144TM)在含有10％FBS的DMEM/F-12培养液，并于培养箱(37℃，5％CO2)中培养。隔天换液。待细胞生长至对数生长期之后，用0.25％的胰酶进行消化。
2.瞬时转染：将处于对数生长期的细胞JAR以6×104/mL的种植密度接种于6孔板中，待细胞密度达到90％时进行转染。首先将4μg质粒(分别为uPAR-cDNA，uPAR-mutant1，uPAR-mutant5，所用载体为pcDNA3.1his，由Takara公司合成)和3μL脂质体Lipofectamine2000(invitrogen公司)分别溶于300μL无血清培养基中，静置5min，随后将二者混合，静置20min，形成DNA和脂质体复合物。将待转染的细胞用PBS或无血清培养基轻柔的清洗，将混合好的含有质粒和脂质体的溶液加入6孔板中，培养箱培养6h后加入适量的含有10％血清的培养基培养48h。
uPAR-mutant1：将过表达质粒的Asn74位点的碱基AAC突变为CAA；uPAR-mutant5：将过表达质粒的Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255位点的碱基AAC突变为CAA。
具体的，上述质粒uPAR-mutant1序列如SEQ ID NO.1所示，uPAR-mutant5序列如SEQ ID NO.2所示，uPAR-cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2uPAR促进胚胎滋养层细胞(JAR)EMT
1.实时定量PCR实验
(1)JAR细胞RNA的提取
1)取实施例1中转染后的细胞，弃掉培养基，用高压过的PBS轻轻洗涤细胞3次，然后加入500μL RNAiso Plus试剂(Takara公司)，充分吹打细胞，冰上静置5min。
2)将细胞溶液转移至高压过的1.5mL的Eppendorf管中，加入100μL氯仿，在振荡器上充分震荡30s，之后冰上静置5min。
3)4℃，12000g，离心10min，离心后将上清液转入新的Eppendorf管中，注意不要吸中间白色的蛋白质层，之后加入250μL异丙醇，上下颠倒数次，充分混匀后于-20℃过夜保存。
4)次日，溶液于4℃，12000g，离心10min，弃掉上清液，用高压过的滤纸条将管壁残余液体擦干，每个EP管中加入1mL 70％的乙醇(无水乙醇用DEPC水配制而成)，4℃，12000g，离心5min，弃掉乙醇，用marker笔标出沉淀的位置，在空气中自然干燥沉淀，待沉淀变为透明，加入适量的DEPC水溶解。
5)微量核酸定量仪测定RNA的浓度与纯度，并将RNA放入-80℃保存备用。
(2)mRNA反转录(反转录试剂盒Takara公司)
1)
| 5×gDNA Eraser Buffer | 2μL |
| gDNA Eraser | 1μL |
| Total RNA | 1μg |
| RNase Free dH<sub>2</sub>O up to | 10μL |
上述混合溶液(A液)放置PCR仪中42℃，2min，并于4℃保存。2)
| 5×PrimerScrip Buffer | 4μL |
| PrimerScrip RT Enzyme MixⅠ | 1μL |
| RT Primer Mix | 1μL |
| A液 | 10μL |
| PNase Free dH<sub>2</sub>O up to | 20μL |
将上述混合溶液放置于PCR仪中，37℃15min，85℃5s，并于4℃保存，此步得到的溶液即为cDNA溶液，-20℃保存备用。
(3)实时定量PCR(SYBR Premix Ex Taq II Kit)(TaKaRa公司)
按照下述配制比例配制：
| SYBR Premix Ex Taq(2*) | 10μL |
| 上游引物(10μM) | 0.4μL |
| 下游引物(10μM) | 0.4μL |
| ROX Reference DyeⅡ | 0.4μL |
| cDNA模板 | 2μL |
| DEPC水 | 6.8μL |
| 总体积 | 20μL |
PCR引物如下：
uPAR:5-AGGACCCTGAGCTATCGGACTG-3’(forward)
5’-TGCATTCGAGGTAACGGCTTC-3’(reverse)
GAPDH:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(forward)
5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(reverse)
条件如下：95℃30s，95℃5s，60℃30s，按照这个条件重复30个循环。实时定量PCR结果如图1A所示，与未转染组相比较，转染uPAR过表达及突变质粒后，uPAR表达量显著升高。
2.蛋白免疫印迹：
本发明采用Western blot检测滋养层细胞(JAR细胞)中uPAR的表达。
(1)JAR细胞中总蛋白的提取
取实施例1中转染后的细胞，弃细胞培养液，PBS轻柔的清洗3次，加入适量的loading buffer进行裂解，用细胞刮将细胞刮下并收集于1.5mL的Eppendorf管中，放入沸水10min后迅速置于碎冰中3min，4℃，12000rpm，离心5min，弃沉淀，上清即为所需蛋白。将上清转移至新的Eppendorf管中，缠上封口膜，-80℃保存备用。
(2)考马斯亮蓝法蛋白定量，计算上样量。
①取6只试管，分别加入4mL考马斯亮蓝G-250染液(sigma)，再依次加入1mg/mL牛血清白蛋白0μL、25μL、50μL、75μL、100μL和125μL，生理盐水1000μL、975μL、950μL、925μL、900μL、875μL。
②混匀后静置5min，721分光光度仪测光密度值，以第一只管为空白对照，595nm比色，以各管光密度值为纵坐标，以每管中的蛋白含量为横坐标，绘出蛋白标准曲线。
③另取两个试管，分别加入4mL考马斯亮蓝G-250，再依次加入提取的各细胞蛋白10μL，生理盐水各980μL，混匀静置5min后，以同上的空白对照管调零，595nm室温比色，根据分光光度值，运用标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。
(3)SDS-PAGE凝胶电泳
根据配方配制分离胶(称量Tris 18.17g，加去离子水充分搅拌溶解，调pH至8.8，定容至100mL，4℃储存)，充分混匀后用枪加入胶板中(注意不要有气泡)，在距顶端1cm左右加入乙醇封口，30min后待分离胶凝固后加入浓缩胶(称量Tris 12.1g，加去离子水充分搅拌溶解，调pH至6.8，定容至100mL，4℃储存)，并按照需要小心的插入梳子，避免产生气泡。待浓缩胶凝固后，慢慢拔掉梳子，并依次每个孔道中加入相同浓度的蛋白样品(40μg)与Marker(2μL)。并按照浓缩胶80V，分离胶120V进行电泳。Marker到达胶底部停止电泳。
(4)转膜与染色
电泳结束后，小心地将胶板卸下，切掉浓缩胶部分，并按照所需对分离胶进行截取，记录好尺寸，裁取与分离胶大小相同的NC膜(硝酸纤维素膜)与8张滤纸，提前在转膜液中浸泡。随后从夹板的正极开始依次放上4层滤纸、NC膜、胶、4层滤纸。一定要确保胶与膜之间没有气泡，放入电转移槽中进行转膜。转膜结束后，立春红染膜，确定转膜效率。
(5)封闭
将膜置于5％脱脂奶粉(TBST配制)中，静置1-2小时。
(6)孵育一抗：按照需要配置一抗(兔抗人uPAR IgG抗体，兔抗人E-cadherin IgG抗体,兔抗人N-cadherin IgG抗体,兔抗人Vimentin IgG抗体,武汉三鹰生物技术有限公司)，4℃孵育过夜。次日，TBST洗三次膜，每次10min。接着室温孵育HRP标记的二抗(HRP标记鼠抗兔IgG，武汉三鹰生物技术有限公司)1h，TBST洗三次膜，每次10min。
(7)显影
将ECL发光液(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)均匀的铺在膜表面，放入凝胶成像仪中，保存结果，对蛋白条带进行后续分析。
(8)Western Blot检测结果
如图1B所示，转染后，uPAR在蛋白水平也显著升高，uPAR-mutant1因为突变一个糖基化位点，所以表观分子量与uPAR-cDNA组相比较有所降低，而uPAR-mutant5突变了5个糖基化位点，表观分子量更为降低。如图1C所示，过表达组的EMT标志物E-cadherin表达量较未处理组表达量下降，N-cadherin、Vimentin表达量上升，而突变组的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达量较与未处理组相比没有明显差异。
3.细胞免疫荧光
(1)利用实施例1中转染后的细胞制备细胞爬片，弃去培养液，PBS轻柔的洗三次，每次5min。
(2)4％的多聚甲醛溶液固定20min，之后PBS洗三次，每次5min。
(3)用滤纸吸干或甩干爬片上残余的液体(注意不要接触到爬片上的细胞)，山羊血清封闭爬片1h。
(4)滤纸吸干爬片背面多余的液体(注意不要用滤纸擦拭爬片带有细胞的一面)，爬片上滴加一抗(兔抗人E-cadherin IgG抗体,兔抗人N-cadherin IgG抗体)，放入湿盒内4℃孵育过夜。
(5)次日，取出爬片，PBS轻柔的洗三次，每次5min。滤纸吸干爬片背面多余的液体，滴加带有荧光标记的二抗(FITC标记抗兔IgG二抗)，室温孵育1h，注意避光。
(6)PBS洗三次，每次10min，之后加入DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，1:500)室温避光孵育5min，再用PBS洗三次。
(7)在爬片上滴加抗荧光淬灭剂进行封片，荧光显微镜下观察并拍照。拍照结果如图1D、图1E所示，实验结果与上述Western Blot所得结果一致。
4.Transwell细胞体外迁移侵袭实验
(1)细胞迁移实验
1)将实施例1中转染后的细胞用0.25％的胰酶消化下来，离心后弃掉培养基，用PBS洗一遍，之后用不含血清的培养基重悬细胞。将细胞调整为1×105/mL的密度。
2)取混匀的细胞100μL加入到上室中，加样时注意加样枪要与小室的下平面垂直，下室加入600-800μL的含有10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基(操作过程中注意下层培养基与上层小室间不要产生气泡，若产生气泡，小心的将小室抬起除去气泡)。将细胞置于培养箱内培养24h。
3)24h后，取出培养板，弃下层培养基，另取24孔板，将小室轻轻放于其中，向小室中加甲醇，使膜完全浸没在甲醇中，固定20min。之后用PBS轻柔的清洗小室，并用棉签小心擦拭上室中的细胞。
4)将小室浸没在0.1％的结晶紫溶液中，染色30min。之后用PBS将结晶紫洗脱下来，棉签轻轻擦拭，将小室置于显微镜下拍照记录，并随机选取10个视野计数细胞，每组实验重复三次，并统计结果。
(2)细胞侵袭实验
1)Matrigel胶4℃过夜溶解，次日将溶解的基质胶以1:9稀释，使最后的浓度为1mg/mL，每个小室内加入50μL，均匀的平铺在小室底部膜的上室面，培养箱中培养6h。
2)剩下步骤同细胞迁移实验1)-4)。
如图1G所示，Transwell细胞体外迁移和侵袭实验结果表明，uPAR过表达可以促进滋养层细胞的迁移侵袭能力，促进滋养层细胞EMT过程的发生，而突变组对于滋养层细胞EMT过程的发生未起到明显作用。
实施例3uPAR过表达及突变影响其与uPA的结合能力研究
1.细胞免疫荧光
方法：按照实施例2中免疫荧光实验步骤进行，本实验所用一抗为：兔抗人uPA IgG抗体，二抗为：FITC标记抗兔IgG二抗。
结果：如图2A免疫荧光结果显示，uPAR过表达可以促进其与uPA的结合能力，而突变组的两组则会降低其与uPA的结合能力。
2.蛋白质免疫共沉淀实验(co-IP)
(1)细胞总蛋白的提取
1)当实施例1中转染后的细胞培养皿中单层细胞长至80％-90％或细胞数达到2-5×107个，加入1mL预冷的IP裂解液(包括蛋白酶抑制剂(1:50)和PMSF(1:100)，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂(1:100)，注意抑制剂要现加现用)至培养皿中，4℃裂解细胞20min(时间可根据实验需要适当延长)，之后用枪反复吹打贴壁细胞，然后将细胞转移至2mL的离心管中。
2)10000g，4℃离心细胞裂解悬浮液10min，弃沉淀，将上清转移至新的2mL离心管中，之后置于冰上，然后采用BCA法测定蛋白浓度(取少量细胞裂解液变性后用于WB检测两种相互作用的蛋白质，即input实验)。
(2)磁珠抗体结合
1)将磁珠混匀，用枪轻轻的吹匀或摇床翻滚5min。
2)抽出50μL磁珠于Eppendorf管中并置于磁力架上，移除上清。
3)将Eppendorf管从磁力架取下，重悬磁珠于200μL含有兔抗人uPAR抗体10μL的AbBinding washing buffer中。
4)常温摇床翻滚孵育10min
5)将Eppendorf管置于磁力架上，移除上清。
6)将Eppendorf管从磁力架上取下，取200μL Ab Binding washing buffer，轻轻重悬磁珠-抗体混合物并混匀。
(3)抗原免疫反应
1)将Eppendorf管置于磁力架上并移除上清。
2)将含有抗原的样本(100-1000μL)加到磁珠-抗体混合物中，并轻柔的吹匀。
3)常温摇床翻滚混匀10min。
4)将Eppendorf管置于磁力架上，将上清转移至另一Eppendorf管中。
5)用200μL Washing buffer洗3次磁珠-抗原-抗体复合物，并轻柔的吹匀。
6)将磁珠-抗原-抗体复合物用100μL Washing buffer重悬，并将此悬液转移至一新的Eppendorf管中，随后置于磁力架上并移除上清。
(4)洗脱抗原抗体复合物
轻柔的将磁珠-抗原-抗体复合物重悬于20μL的Elution Buffer中，加入10μLloading buffer充分混匀，并于70℃孵育10min。
(5)图2B免疫共沉淀结果(IP：鼠抗人uPAR抗体，IB：兔抗人uPA抗体)与免疫荧光结果相一致，随着uPAR的表达量升高，其与uPA的结合能力增强，而突变组与uPA的结合能力与未处理组相比并未看出有明显差异。
3.明胶酶谱实验
(1)将处于对数生长期不同处理组(未处理组，vector转染组，uPAR cDNA转染组，uPAR-M1转染组，uPAR-M5转染组)的JAR细胞在无血清培养基中培养24h。
(2)24h后收集上清液至1.5mL Eppendorf管中，12000rpm，10min，弃去沉淀，将上清液转移至一新的Eppendorf管中，-80℃储存备用。
(3)将不同处理组的细胞上清液按照蛋白定量的结果，保证每个泳道中的蛋白质总量一致，将样品和2×上样缓冲液(取浓缩胶缓冲液(pH6.8)5mL，20％SDS 4mL，β-巯基乙醇1mL，50％甘油5mL，加入6mL去离子水充分溶解后，分装)充分混合进行上样。
(4)配制分离胶(含有浓度1mg/ml的明胶)和浓缩胶，进行SDS-PAGE。
(5)电泳结束后切除浓缩胶部分，先用蒸馏水轻轻冲洗胶的表面，而后将分离胶置于Renaturing缓冲液震荡洗脱1h(去除SDS对MMPS的抑制作用)，然后放入漂洗液中37℃孵育14-16h。
(6)次日，蒸馏水轻轻清洗胶的表面，放入考马斯亮蓝(R-250)中染色，之后用脱色液进行脱色，直至在MMP-9(92kDa)和MMP-2(72kDa)位置出现白色条带，之后用凝胶图像分析系统成像，保存图像。结果如图2C所示，过表达组的MMP-2，MMP-9表达量较未处理组明显升高，而突变组MMP-2，MMP-9的表达量较过表达组略有下降，说明突变组会减弱uPAR与uPA的结合，进而减弱其激活基质金属蛋白激酶的能力，从而降低滋养层细胞的迁移侵袭能力。
实施例4uPAR N-糖基化突变通过抑制与整合素(integrinβ-1)的结合进而抑制FAK信号通路影响细胞EMT
1.蛋白质免疫共沉淀实验(co-IP)
方法：具体步骤如实施例3中蛋白质免疫共沉淀实验所示，本实施例所用抗体为：IP:兔抗人uPAR抗体，IB：integrinβ-1抗体。
结果：如图3A免疫共沉淀结果可以看出，转入uPAR过表达质粒的滋养层细胞较未处理组的滋养层细胞其与integrinβ-1的结合增强，转入uPAR-mutant1的滋养层细胞与integrinβ-1的结合能力较过表达组明显减弱，而转入uPAR-mutant5的滋养层细胞由于将uPAR的5个糖基化位点全部敲除，导致其与integrinβ-1的结合能力显著抑制。
2.细胞免疫荧光实验
方法：具体步骤如实施例2中免疫荧光实验步骤进行，区别点为本实验所用一抗(兔抗人uPAR IgG抗体，鼠抗人Integrinbeβ-1IgG抗体，兔抗人F-actin IgG抗体，武汉三鹰生物有限公司)，二抗(FITC标记抗兔IgG二抗，TRITC标记抗鼠IgG二抗，武汉三鹰生物有限公司)。
结果：如图3B免疫荧光结果与免疫共沉淀结果相一致。uPAR与integrinβ-1结合后可以激活FAK信号通路，进而促进滋养层细胞的迁移。
3.蛋白免疫印迹
方法：具体步骤如实施例2中蛋白免疫印迹实验步骤进行，所用抗体：兔抗人FAK，兔抗人p-FAK、兔抗人p130Cas、兔抗人p-p130Cas、兔抗人DOCK180(Affinity Biologicals)
结果：如图3C运用Western blot技术检测FAK信号通路中的下游信号分子的表达，uPAR过表达组的p-FAK、p-p130Cas、DOCK以及Rac的表达量较未处理组的表达量明显上升，说明uPAR表达量升高可以激活FAK信号通路，而突变组的磷酸化蛋白的表达量较过表达组的表达量略有下降，表明uPAR的表达量升高可以通过激活FAK信号通路进而增强滋养层细胞的迁移侵袭能力。
4.细胞骨架实验
(1)弃培养基，PBS轻柔的洗两次。
(2)4％多聚甲醛室温下固定细胞10min。
(3)PBS洗涤3遍。
(4)含0.1％TritonX-100的PBS洗涤3-5min。
(5)PBS洗涤2遍。
(6)5μl甲醇原液加入200μl的PBS中预染每张爬片。
(7)染色液室温浸泡爬片20min，盖上盖子以防水分蒸发。
(8)PBS洗2次，3min/次。(若长期保存，细胞应在空气中晾干，加盖在一个永久的封片剂，避光2-8℃保存。)
(9)制备含有15μl的荧光素鬼笔环肽溶液200μl，染色液没过细胞爬片，37℃孵育1h。
(10)PBS洗3次，之后DAPI染色10min，再用PBS洗3次。
(11)免疫荧光封片剂封片，镜下观察。
结果：如图3D细胞骨架实验结果显示，过表达组的细胞出现了伪足，且细胞间的连接明显减弱，进一步确定了uPAR过表达可以促进滋养层细胞的迁移能力，突变组的形态变化则介于野生型组与过表达组之间，也进一步验证与uPAR-cDNA组相比较，uPAR N-糖基化突变会减弱滋养层细胞的迁移能力，这与之前的实验结果相吻合。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连医科大学
<120> 一种治疗绒毛膜癌的药物
<130> 2019
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 967
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atgggtcacc cgccgctgct gccgctgctg ctgctgctcc acacctgcgt cccagcctct 60
tggggcctgc ggtgcatgca gtgtaagacc aacggggatt gccgtgtgga agagtgcgcc 120
ctgggacagg acctctgcag gaccacgatc gtgcgcttgt gggaagaagg agaagagctg 180
gagctggtgg agaaaagctg tacccactca gagaagaccc aaaggaccct gagctatcgg 240
actggcttga agatcaccag ccttaccgag gttgtgtgtg ggttagactt gtgcaaccag 300
ggcaactctg gccgggctgt cacctattcc cgaagccgtt acctcgaatg catttcctgt 360
ggctcatcag acatgagctg tgagaggggc cggcaccaga gcctgcagtg ccgcagccct 420
gaagaacagt gcctggatgt ggtgacccac tggatccagg aaggtgaaga agggcgtcca 480
aaggatgacc gccacctccg tggctgtggc taccttcccg gctgcccggg ctccaatggt 540
ttccacaaca acgacacctt ccacttcctg aaatgctgca acaccaccaa atgcaacgag 600
ggcccaatcc tggagcttga aaatctgccg cagaatggcc gccagtgtta cagctgcaag 660
gggaacagca cccatggatg ctcctctgaa gagactttcc tcatagactg ccgaggcccc 720
atgaatcaat gtctggtagc caccgacact cacggaccga aaaaccaaag ctatatggta 780
agaggctgtg caaccgcctc aatgtgccaa catgcccacc tgggtgacgc cttcagcatg 840
aaccacattg atgtctcctg ctgtactaaa agtggctgta accacccaga cctggatgtc 900
cagtaccgca gtggggctgc tcctcagcct ggccctgccc atctcagcct caccatcacc 960
ctgctaa 967
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ctgctaa 967
Claims (4)
1.一种治疗绒毛膜癌的药物，其特征在于，所述药物对uPAR N-糖基化修饰蛋白的Asn74位点或Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255位点进行突变。
2.根据权利要求1所述的治疗绒毛膜癌的药物，其特征在于，将Asn74位点碱基AAC突变为CAA，将Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255位点碱基AAC突变为CAA。
3.根据权利要求2所述的治疗绒毛膜癌的药物，其特征在于，编码Asn74突变位点蛋白的基因序列为SEQ ID NO.1，编码Asn74，Asn184，Asn194，Asn222，Asn255突变位点蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2。
4.根据权利要求1所述的治疗绒毛膜癌的药物，其特征在于，所述药物为siRNA或糖苷酶。
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2019
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