CN114015496B - 一种食用安全的樟树籽仁油的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种食用安全的樟树籽仁油的提取方法，先由采用齿棍挤压破樟树籽皮肉，分离皮肉和核，利用毛棍摩擦和循环水冲洗，除去皮肉和核表面上的樟树精油，干燥；采用装有筛网孔径3.5～9mm、级间孔径差0.05～0.25mm的多级震动筛将樟树籽核分级；采用微间距比樟树籽核直径小0.05～0.1mm双棍或双磨盘挤压破壳、然后同步采用震动分离和气流分离技术和色泽识别，使壳、仁分离；采用水循环冲洗和水蒸气蒸馏，进一步除去樟树籽仁表面附着的樟树精油，得到不含樟树精油的樟树籽仁；采用水/酶提取法等方法，提取得到不含精油的樟树籽仁油，其色泽金黄、无异味、含中链脂肪酸高于95％、安全无毒副作用，为天然辛酸癸酸系中链油。
Description
技术领域
本发明属于食用油脂技术领域。
背景技术
樟树属樟科植物，其树干、树枝、树叶、果实皆含有樟树精油，樟树精油中含有龙脑、樟脑、1，8-桉叶油素、左旋芳樟醇、右旋芳樟醇、柠檬醛、异橙花叔醇、黄樟油素(黄樟素)、金合欢醇、甲基丁香酚等，是香精、香料、化工及药用原料。但樟树精油中的黄樟油素、樟脑、龙脑具有毒副作用。黄樟油素具有致癌毒性，在小鼠饲料中添加0.04％-1.00％的黄樟素，喂饲150天至2年可诱导小鼠产生肝癌。樟脑具有毒性，口服可引起眩晕、精神错乱、惊厥、呼吸衰竭而死亡，其小鼠经口食用的急性毒性LD50值为1213mg/kg。龙脑是一种中药，已经列入国家药典。但龙脑在体内可转化为有毒性的樟脑，使用不当存在一定的安全隐患。龙脑对小鼠、大鼠、家兔均存在急性毒性反应，其小鼠经口食用的急性毒性LD50值为2720mg/kg。
为了制备樟树籽(仁)油，国内外油脂研究人员相继研发出多种樟树籽(仁)油提取或制备方法，主要有以下几种：
CN201910856147.3公开了一种响应面法优化的樟树籽油超临界CO2提取工艺，包括如下步骤：将樟树籽恒温干燥，粉碎过筛；将粉碎过筛后的樟树籽装入萃取釜中，调节萃取温度、萃取压力、萃取时间及CO2流量至设定值，进行萃取，萃取结束后计算出油率；该工艺条件下樟树籽油的出油率可达38.89％，并且条件温和，操作简单，适用于樟树籽油的生产提取。但是该提取方法直接利用樟树籽萃取樟树籽油，忽视了樟树籽皮肉和壳中所含的精油成分。
CN201410502537.8公开了一种水乳化萃取与冻熔破乳化释放法提取樟树籽仁油方法，这是利用水为提取剂，经水乳化萃取、冻熔破乳化释放、离心分离过程，从樟树籽仁中提取樟树籽仁油。该提取方法虽然以脱去了皮肉及壳的樟树籽仁为原料，但是没有考虑脱除樟树籽核壳过程中壳与仁接触会使得壳中的精油成分附着在樟树籽仁表面，精油与油脂的极强互溶性会导致精油最终混入并残留在樟树籽仁油中而严重影响樟树籽仁油食用安全性的问题。
CN201510280502.9公开了一种水酶法提取樟树籽仁油方法，包括解淀粉芽孢杆菌发酵酶液的制备，樟树籽仁湿法粉碎，酶解处理，离心分离，变温处理破乳化释放樟树籽仁油等步骤，从樟树籽仁中提取樟树籽仁油。该方法虽然以脱去了皮肉及壳的樟树籽仁，但是没有考虑脱除樟树籽核壳过程中壳与仁接触会使得壳中的精油成分附着在樟树籽仁表面，精油与油脂的极强互溶性会导致精油最终残留在樟树籽仁油中而严重影响樟树籽仁油食用安全性的问题。
本项目组研究发现，樟树籽皮、肉和壳中含有精油，但樟树籽仁中不含精油。但现有公开的樟树籽(仁)油提取技术及工艺提取出来的樟树籽(仁)油皆含有黄樟油素、樟脑、龙脑等樟树精油成分，这不仅给樟树籽(仁)油带来异味，还使樟树籽仁油含有黄樟油素、樟脑、龙脑等毒副作用成分而无法食用。这些技术和工艺均未考虑樟树籽皮、肉及壳中含樟树精油的问题，如何大大减少甚至避免樟树精油混入樟树籽仁油中的问题，如何除去混入樟树籽仁中樟树精油的问题。因此，提取出不含樟树精油、食用安全的樟树籽仁油，可使国内年产量达400多万吨、至今未得到开发利用的樟树籽资源变废为宝，其科学意义和应用价值非常重大，技术和产品市场前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以大大减少樟树精油混入和除去樟树籽仁中混入的樟树精油而提取出不含樟树精油、食用安全的樟树籽仁油的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明所述的一种食用安全的樟树籽仁油的提取方法，包括以下步骤：
(1)采用齿棍挤压破樟树籽皮肉，使得樟树籽的果皮果肉与樟树籽核分离；樟树籽皮肉和核彻底分离后，利用毛棍摩擦和循环水冲洗设备，除去樟树籽皮肉和樟树籽核表面上的樟树精油，得到湿樟树籽核；再经干燥脱水，得到重量百分比含水量<5％的干樟树籽核；
(2)根据干樟树籽核直径差异、采用装有筛网孔径范围为3.5～9mm、级间孔径差为0.05～0.25mm的多级震动筛将樟树籽核分级，然后分别存储备用；
(3)采用微间距比樟树籽核直径小0.05～0.1mm双棍或双磨盘挤压破壳、然后同步采用震动分离和气流分离技术，初步分离干樟树籽核壳和仁；分别收集初步分离的樟树籽壳和樟树籽仁；
(4)同时采用色泽识别和气流分选技术，对步骤(3)初步分离的樟树籽壳和樟树籽仁再分别进行壳、仁分离，收集樟树籽壳，用于提取樟树精油、制备活性炭；收集樟树籽仁，用于提取樟树籽仁油。
(5)采用35℃～65℃水循环冲洗步骤(4)收集到的樟树籽仁，除去樟树籽仁表面粘附的樟树籽壳粉末和樟树精油；
(6)采用水蒸气蒸馏步骤(5)得到的樟树籽核仁30～240min，进一步除去樟树籽仁表面附着的樟树精油，得到不含樟树精油的樟树籽仁；
(7)采用水/酶提取法，从不含樟树精油的樟树籽仁中提取出樟树籽仁毛油；或对不含樟树精油的樟树籽仁进行干燥脱水、使樟树籽仁重量百分比含水量<5％，然后采用压榨法或溶剂萃取法或超临界CO2提取法或压榨-萃取组合法，从樟树籽仁中提取出不含樟树精油的樟树籽仁毛油；
(8)经脱酸、脱色、脱臭等油脂精炼过程，得到不含樟树精油的樟树籽仁油。
测定分析本发明制备的不含樟树精油的樟树籽仁油的组成结构和理化性质。本发明所得的樟树籽仁油色泽金黄、无异味、含中链脂肪酸>95％(w/w)、不含樟树精油、无毒副作用、食用安全。通过比较分析发现，樟树籽仁油符合国家一级大豆油和一级粗棕榈仁油的标准要求。
依据食品安全国家标准GB15193-2014/2015，评价本发明制备的不含樟树精油的樟树籽仁油的食用安全性。樟树籽仁油的急性经口毒性试验表明：樟树籽仁油对不同性别小鼠经口毒性LD50(半数致死剂量)均≥21.5g/kgBW，在14天的观察期内动物未见明显中毒症状和死亡现象，依据食品急性毒性剂量分级标准判定，樟树籽仁油属实际无毒。樟树籽仁油的哺乳动物红细胞微核试验结果为阴性和体外哺乳类细胞L5178Y的TK基因突变试验结果为阴性，表明樟树籽仁油没有显性致突变作用和致基因突变作用；樟树籽仁油的细菌回复突变试验结果为阴性，表明：樟树籽仁油对TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535五株试验菌株(在加与不加体外代谢活化系统S9混合物条件下)均没有致突变作用。90天经口毒性试验结果表明：食用樟树籽仁油不会引起机体其他不适生理反应和主要脏器的组织学和病理学变化，樟树籽仁油的NOAEL(未观察到有害作用剂量)大于4mL/kg BW/天。食用安全性评价证明本发明提取的樟树籽仁油为无毒副作用、安全食用的癸酸月桂酸系中链油。
本发明是基于项目组研究发现，樟树籽皮、肉和壳中含有精油，但樟树籽仁中不含精油。
本发明制备的樟树籽仁油的组成结构和理化性质测定分析、食用安全性评价结果表明，本发明所得的樟树籽仁油色泽金黄、无异味、含中链脂肪酸高于95％(w/w)、不含樟树精油、无毒副作用、食用安全，为食用安全的天然辛酸癸酸系中链油。
附图说明
图1为工艺流程图。
图2为现有樟树籽(仁)油提取和制备技术制得的樟树籽(仁)油中的挥发性物质质谱图。
图3为本发明本发明制得的樟树籽(仁)油中的挥发性物质质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比例、比率、或百分数按照质量计算。
除非特别说明，实施例中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明中。实施例中所述的较佳实施方法与材料仅做示范之用。
在本发明的下述实施例中。
脂肪酸含量测定方法参考GB 5009.168-2016。
Sn-2位脂肪酸含量测定方法参考国标GB/T 24894-2010、GB 5009.168-2016。
相对密度参考采用GB/T 5526-1985《植物油脂检验比重测定法》的方法。
水分及挥发物参考采用GB 5009.236-2016《食品安全国家标准动植物油脂水分及挥发物的测定》的方法。
折光指数参考采用GB/T 5527-2010《动植物油脂折光指数的测定》的方法。
酸值参考采用GB 5009.229-2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》的方法。
碘值参考采用GB/T 5532-2008《动植物油脂碘值的测定》的方法。
皂化值参考采用GB/T 5534-2008《动植物油脂皂化值的测定》的方法。
过氧化值参考采用GB 5009.227-2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》的方法。
不皂化物参考采用GB/T 5535.1-2008《动植物油脂不皂化物测定第1部分：乙醚提取法》的方法。
不溶性杂质采用GB/T 15688-2008《动植物油脂不溶性杂质含量的测定》的方法。
GC型号：Agilent7890B色谱柱：DB-23熔融石英毛细管柱(30m*0.25mm*0.25μm)。
HPLC型号：Agilent1260色谱柱：C18柱(5μm*4.6mm*200mm)。
急性经口毒性试验依据GB 15193.3-2014《食品安全国家标准急性经口毒性试验》进行。
哺乳动物红细胞微核试验依据GB 15193.5-2014《食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验》进行。
体外哺乳类细胞TK基因突变试验依据GB 15193.20-2014《食品安全国家标准体外哺乳类细胞TK基因突变试验》进行。
细菌回复突变试验依据GB 15193.4-2014《食品安全国家标准细菌回复突变试验》进行。
90天经口毒性试验依据GB 15193.13-2015《食品安全国家标准90天经口毒性试验》进行。
实施例1。
制备不含樟树精油的樟树籽仁。
(1)采用齿棍挤压破樟树籽皮肉，使得樟树籽的果皮果肉与樟树籽核分离；樟树籽皮肉和核彻底分离后，利用毛棍摩擦和循环水冲洗设备，除去樟树籽皮肉和樟树籽核表面上的樟树精油，得到湿樟树籽核；再经干燥脱水，得到重量百分比含水量<5％的干樟树籽核；
(2)根据干樟树籽核直径差异、采用装有筛网孔径范围为3.5～9mm、级间孔径差为0.2mm孔径筛网的多级震动筛，由小到大将樟树籽核分级，然后分别存储备用；
(3)采用微间距比樟树籽核直径小0.1mm的双棍或双磨盘挤压破壳，采用、震动分离和气流分离组合技术和设备初步分离干樟树籽核核壳和核仁；分别收集樟树籽核壳为主部分、和核樟树籽仁为主部分，备用；
(4)采用色泽识别和气流分选技术和设备将樟树籽核壳和核樟树籽仁彻底分离，得到樟树籽仁。收集核樟树籽壳，备用于提取樟树精油、制备活性炭；收集樟树籽仁，备用于提取樟树籽仁油。
(5)采用45℃水循环冲洗樟树籽仁，除去樟树籽仁表面粘附的樟树籽壳粉末和部分樟树精油；
(6)采用水蒸气蒸馏樟树籽核仁180min，除去樟树籽仁表面附着的樟树精油，得到不含樟树精油的樟树籽仁。
实施例2。
制备不含樟树精油的樟树籽仁。
(1)采用齿棍挤压破樟树籽皮肉，使得樟树籽的果皮果肉与樟树籽核分离。樟树籽皮肉和核彻底分离后，利用毛棍摩擦和循环水冲洗设备，除去樟树籽皮肉和樟树籽核表面上的樟树精油，得到湿樟树籽核；再经干燥脱水，得到重量百分比含水量<5％的干樟树籽核；
(2)根据干樟树籽核直径差异、采用装有筛网孔径范围为3.5～9mm、级间孔径差为0.15mm孔径筛网的多级震动筛，由小到大将樟树籽核分级，然后分别存储备用；
(3)采用微间距比樟树籽核直径小0.05mm的双棍或双磨盘挤压破壳，采用、震动分离和气流分离组合技术和设备初步分离干樟树籽核核壳和核仁；分别收集樟树籽核壳为主部分、和核樟树籽仁为主部分，备用；
(4)采用色泽识别和气流分选技术和设备将樟树籽核壳和核樟树籽仁彻底分离，得到樟树籽仁。收集核樟树籽壳，备用于提取樟树精油、制备活性炭；收集樟树籽仁，备用于提取樟树籽仁油。
(5)采用50℃水循环冲洗樟树籽仁，除去樟树籽仁表面粘附的樟树籽壳粉末和部分樟树精油；
(6)采用水蒸气蒸馏樟树籽核仁120min，除去樟树籽仁表面附着的樟树精油，得到不含樟树精油的樟树籽仁。
实施例3。
提取不含樟树精油的樟树籽仁油。
取实施例1和2中制备得到的樟树籽仁，利用现有植物油提取技术制得樟树籽仁毛油。对樟树籽仁毛油进行精炼后得到樟树籽仁油产品。采用固相微萃取技术分离纯化出此方法制得的樟树籽仁油产品与现有樟树籽(仁)油提取和制备技术制得的樟树籽(仁)油中的挥发性物质，挥发性物质气相图谱详见图2、图3。
比较分析图2、图3可以看出，现有樟树籽(仁)油提取和制备技术制得的樟树籽(仁)油，含有黄樟素和樟脑等有毒精油成分，而本发明方法制得的樟树籽仁油不含黄樟素和樟脑等有毒精油成分、只含有微量无毒性、食用安全的风味成分。
实施例4。
樟树籽仁油产品的理化性质和感官指标测定分析。
对实施例3中制得的樟树籽仁油产品的理化性质和感官指标测定分析，樟树籽仁油的理化性质测定均参考国家食品标准中相关理化性质的测定方法，并与一级粗棕榈仁油的国家标准限值(GBT18009-1999)进行比较分析。测定分析结果列于表2中。
樟树籽仁油的相对密度(20℃/20℃)为0.931，略高于一级大豆油和一级粗棕榈仁油的相对密度；水分及挥发物为0.16％，低于一级大豆油和一级粗棕榈仁油(0.10％)；酸值为0.295mg KOH/g，符合一级大豆油和一级粗棕榈仁油的国家标准；折光指数和碘值(5.05g/100g)都低于一级大豆油(124～139g/100g)和一级粗棕榈仁油(13～24g/100g)，表明樟树籽仁油中不饱和脂肪酸含量很低；过氧化值(1.665mmol/kg)和不皂化物(0.32±0.04)g/kg，这两项指标远低于一级大豆油和一级粗棕榈仁油，可表明樟树籽仁油本身就具有很好的抗氧化性。通过比较分析发现樟树籽仁油满足国家一级大豆油和一级粗棕榈仁油的标准要求，具有开发利用其作为食用油的价值。
对现有技术制备的樟树籽仁油和本发明方法制备的樟树籽仁油的透明度以及气味进行感官评价。结果见表1。
表1现有技术和本发明制备的樟树籽仁油的感官评价
表2樟树籽仁油的理化性质与大豆油(一级)、粗棕榈仁油(一级)的对比
| 项目 | 樟树籽仁油 | 大豆油(一级) | 粗棕榈仁油(一级) |
| 相对密度(20/20℃) | 0.931±0.002 | 0.919～0.925 | 0.897～0.912 |
| 水分及挥发物(％) | 0.06±0.03 | ≤0.10 | ≤0.10 |
| 折光指数(20℃) | 1.450±0.004 | 1.466～1.470 | 1.448～1.452 |
| 酸值(mg KOH/g) | 0.295±0.145 | ≤0.5 | ≤2.0 |
| 碘值(g/100g) | 5.05±1.64 | 124～139 | 13～23 |
| 皂化值(mg/g) | 285±2.82 | 189～195 | 230～254 |
| 过氧化值(mmol/kg) | 1.665±0.573 | ≤5.0 | ≤10 |
| 不皂化物(g/kg) | 0.32±0.03 | ≤15 | ≤1 |
| 不溶性杂质(％) | 0.03±0.01 | ≤0.05 | ≤0.1 |
| 色泽 | R0.0，Y0.2～1.6 | 淡黄色至浅黄色 | R5,Y30 |
对樟树籽仁油的脂肪酸组成和分布进行测定分析，分析测定结果列于表3中。
表3樟树籽仁油的脂肪酸组成和分布
对樟树籽仁油的甘油三酯结构进行测定分析，测定分析结果列于表4中。
表4樟树籽仁油的甘油三酯结构
| 组成 | 甘油三酯种类 | 百分含量(％) |
| ECN＝30 | CCC | 3.23±0.38 |
| ECN＝32 | CCLa/CLaC | 86.97±0.87 |
| ECN＝34 | CLaLa/MCC/LaCLa | 9.80±1.05 |
实施例4。
评价实施例3中制得的不含樟树精油的樟树籽仁油产品的食用安全性。
一、急性经口毒性试验：
(一)样品处理：称取实施例3中制得的樟树籽仁油21.5g、20.0g、9.28g、4.30g，分别用植物油稀释至40ml，用此溶液作为受试物灌胃，灌胃容量为0.4ml/20g.BW。21.5g/40mL剂量组灌胃2次/日，间隔4小时一次，其它剂量组灌胃1次/日，动物灌胃剂量分别达到21.5、10.0、4.64、2.15g/Kg.BW。
(二)动物及环境设施：ICR小鼠40只，雌雄各半，体重18～22g。实验动物饲养环境：温度21.2-24.6℃，湿度50-56％。
(三)实验方法：按Horn’s法，小鼠隔夜禁食，随机分组，每组10只，雌雄各半。样品按不同剂量用植物油配制，灌胃容量为0.4mL/20g.BW。21.5g/40mL剂量组灌胃2次/日，间隔4小时一次，其它剂量组灌胃1次/日，连续观察14d并记录小鼠中毒症状和死亡情况，观察期结束后动物称重，处死后进行尸检。试验期间实验动物喂饲基础饲料自由饮水。
(四)试验结果：实验期间未见动物中毒及死亡现象，实验结果见表5。试验结束处死存活小鼠，大体解剖未见肉剖未见肉眼可见的病变。樟树籽仁油对雄、雌性小鼠经口LD50均≥21.5，属实际无毒。
表5急性经口毒性试验结果
二、哺乳动物红细胞微核试验：
(一)样品处理及给样方式：称取实施例3中制得的樟树籽仁油产品作为高剂量组受试物，中、低剂量组受试物分别以高剂量组受试物与植物油依次对半稀释而成，用这些浓度的溶液灌胃，灌胃容量为4mL/Kg.BW，因该样品的密度为0.86g/ml，高、中、低剂量组受试剂量分别达到3.44g、1.72g、0.86g/kg.BW。
(二)动物及环境设施：ICR小鼠50只，雌雄各半，体重25～30g。实验动物饲养环境：温度21.2-22.4℃，湿度50-53％RH。
(三)实验方法：采用经口灌胃30h染毒法进行试验。受试物设3个剂量组，每组10只，雌雄各半。以40mg/kg.BW剂量的环磷酰胺为阳性对照(CP)，植物油为阴性对照。各剂量组为3.44g、1.72g、0.86g/kg.BW。末次灌胃后6h，颈椎脱臼处死动物，取股骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数2000个嗜多染红细胞(PCE)，观察含微核的嗜多染红细胞数，同时观察200个嗜多染红细胞视野内的成熟红细胞数(NCE)，计算PCE/NCE值和微核率，并进行统计处理(X2检验Fisher确切概率法检验)。
(四)试验结果：由表6可知，该样品各剂量组PCE/NCE未少于溶剂对照组的20％，提示骨髓红细胞系统的增殖无明显抑制，对嗜多染红细胞微核的观察无明显影响。各样品剂量组与阴性对照组比较统计学上差异无显著性且均在本实验室正常值范围内，环磷酰胺阳性对照组微核率明显高于溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而受试样品各剂量组雌雄小鼠微核率与溶剂对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，说明该样品未表现出使小鼠PCE微核率上升的致突变效应。樟树籽仁油哺乳动物红细胞微核试验为阴性。
表6樟树籽仁油小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率及PCE/NCE值
*与阴性对照组及各剂量组比较统计学上差异有显著性(P<0.05)
三、体外哺乳类细胞TK基因突变试验：
(一)样品处理：称取1g实施例3中制得的樟树籽仁油产品用DMSO溶解至2mL，过滤除菌后依次用DMSO稀释出两个浓度，做为高、中、低剂量组受试物。因添加量为1％体积，故剂量分别为5、2.5、1.25mg/mL。
(二)细胞株：小鼠淋巴瘤细胞株L5178Y TK+/-clone(3.7.2C)
(三)试验方法：试验设置高、中、低3个剂量组，另设阴性(H2O)对照组、阳性对照组(-S9为：甲基磺酸甲酯(MMS)，+S9为：环磷酰胺(CP))和溶媒(DMSO)对照组，试验需在加与不加S9条件下进行。试验前细胞株经THMG培养基中处理24小时，离心、洗涤后在THG培养基中培养48小时。
(四)培养液和培养条件：含10％马血清的RPMI1640培养液(96孔板培养时使用含20％马血清的RPMI1640培养液)，5％CO2、37℃、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。
处理：取生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL，按1％体积加入受试物，37℃震摇处理3小时。离心，弃上清液，用不含马血清的RPMI1640培养液洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10％马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2×105/mL。
PE0(0天的平板接种效率)测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个/mL，接种到96孔板(每孔加200μL，即平均1.6个细胞/孔)，每个剂量作1块平板，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养12天，计数每块平板有集落生长的孔数。
PE2(2天表达培养后的平板接种效率)测定：2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，梯度稀释并接种96孔板，培养12天后计数每块平板有集落生长的孔数。
TFT抗性突变频率(tk-MF)测定：2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×104个/mL，加入TFT(三氟胸苷，终浓度为3μg/mL)，混匀，接种96孔板，每孔有2000个细胞。每个剂量组做两个平行，在5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养l2天后，计数每块平板的集落生长孔数。
(五)数据处理：
(1)平板效率(PE0和PE2)
PE＝[-ln(EW/TW)]/1.6×100％
式中：EW为无集落生长的孔数；TW为总孔数；1.6为每孔接种细胞数
(2)相对悬浮生长(RSG)
RSG＝[处理组表达期间细胞增殖倍数/(阴性/溶媒对照组表达期间细胞增殖倍数)]×100％
(3)相对存活率(RS)
RS＝[PE(处理)/PE(对照)]×100％
(4)TFT抗性突变频率(MF)：
MF(×10-6)＝[-ln(EW/TW)/N]/PE2
式中：EW为无集落生长的孔数；
TW为总孔数；
N为每孔接种细胞数(L5178Y细胞为2000)。
受试物一个以上剂量(浓度)组的T-MF显著高于阴性/溶媒对照，或是阴性/溶媒对照的3倍以上，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。但如仅在相对存活率低于20％的高剂量情况下出现阳性，则结果判为“可疑”。在相对存活率低于20％的情况下未见突变频率的增加，可判定为阴性。
(六)试验结果：由表7～9可知，该受试物各剂量组加与不加S-9突变频率均未超过阴性对照组3倍，亦无剂量反应关系，故该样品在本实验条件下TK试验未显示致突变毒性。樟树籽仁油TK试验在本实验室条件下未显示致突变毒性。
表7-1樟树籽仁油TK试验细胞毒性
表7-2樟树籽仁油TK试验细胞毒性
表8樟树籽仁油诱导L5178Y细胞TK基因突变频率(-S9)
*与溶媒对照比较P<0.05×
表9樟树籽仁油诱导L5178Y细胞TK基因突变频率(+S9)
*与溶媒对照比较P<0.05
四、细菌回复突变试验。
(一)样品处理：称取受试物1g用二甲基亚砜(DMSO)溶解至20mL即为最高浓度，高压灭菌，灭菌条件：0.103mpa，20min。
第一次试验：取此浓度样品2mL，加入无菌DMSO4.32mL混匀，如此依次√10倍(约3.16倍)稀释至第5个浓度，即实验剂量分别为5000，1582，501，158.5，50.2μg/皿。
第二次试验：取此浓度样品1mL，加入无菌DMSO4mL混匀，如此依次5倍稀释至第5个浓度，即实验剂量分别为5000，1000，200，40，8μg/皿。
(二)试验方法：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535五株试验菌株进行试验。采用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆(S9)作为体外代谢活化系统。第一次试验设5000，1582，501，158.5，50.2μg/皿五个剂量，第二次试验设5000，1000，200，40，8μg/皿5个剂量，再设一个空白对照(即未处理对照)，同时设溶媒对照和阳性对照(阳性物质见实验结果表格)。在顶层琼脂中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物溶液和0.5mLS-9混合液(当需要代谢活化时)，混匀后倒入底层培养基平板上。每个剂量组均做3个平行平皿。在37℃培养48小时，必要时延长至72小时，计数每皿回变菌落数。测试菌株TAl535、TA98的回变菌落数等于或大于未处理对照组的2倍，其他测试菌株的回变菌落数等于或大于未处理对照组的2倍，并具有以下a)、b)两种情况之一的可判定为阳性结果：a)有剂量反应关系；b)某一测试点有可重复的阳性结果。试验在不同剂量间距条件下重复做一次。
(三)试验结果：由表10-1～10-2可知，该受试物各剂量回变菌落数均未超过未处理对照菌落数2倍，亦无剂量反应关系，对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535五株试验菌株在加与不加S-9时，均未呈现遗传毒性。樟树籽仁油细菌回复突变试验为阴性。
表10-1樟树籽仁油细菌回复突变试验第1次结果
表10-2樟树籽仁油细菌回复突变试验第1次结果
表10-3樟树籽仁油细菌回复突变试验第2次结果
表10-4樟树籽仁油细菌回复突变试验第2次结果
五、大鼠90天经口毒性试验。
(一)样品处理及给样方式：以实施例3中制得的樟树籽仁油产品作为高剂量组受试物，中、低剂量组受试物依次以高剂量组受试物与植物油(1︰1)对半稀释而成，用这些浓度的溶液灌胃，灌胃容量为4mL/kg.BW。故高、中、低剂量组受试剂量分别达到4mL、2mL、1mL/kg.BW，对照组动物给予植物油。
(二)动物及环境设施：SPF级离乳SD大鼠120只，雌雄各半，体重60-80g左右。实验动物饲养环境：温度22.0-24.9℃，湿度50-64％。
(三)实验方法：SPF级离乳SD大鼠120只，适应3天后按体重随机分为6组，每组20只，雌雄各半。受试物设置3个剂量为4mL、2mL、1mL/kgBW，对照组给予植物油，连续喂饲大鼠90天，其中2组为卫星组，另4组试验为全程实验组。期间动物单笼喂养，自由饮食，观察动物生长状况，每周记录大鼠体重及进食量，试验6周，卫星组动物禁食后取血测血常规、各项血生化指标、血电解质指标、测尿分析指标、相关脏器作病理检查；试验结束，全程实验4组动物禁食后测血常规、各项血生化指标、血电解质指标、测尿分析指标、同时进行病理组织学检查。
观察指标：在试验前和试验结束时，对高剂量组和对照组动物进行眼部检查；动物的一般临床表现、体重增长量、摄食量、食物利用率；血液学检查包括：白细胞计数及其分类、红细胞计数、及血红蛋白、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)；血生化检查包括：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)，碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白及氯、钾、钠指标；尿液检查包括：尿蛋白、相对密度、pH值、葡萄糖和潜血。禁食后放血处死动物后进行解剖，大体检查，包括体表、颅、胸、腹腔及其主要脏器心脏、胸腺、肾上腺、肝、脾、肾、睾丸称重，计算相对重量(脏/体比值)；病理组织学检查：在对各剂量组动物做大体检查未发现明显病变和生化指标未见异常改变时，仅对高剂量和对照组动物进行脑、甲状腺、胸腺、心脏、肝、脾、肾、肾上腺、胃、十二指肠、结肠、胰、肠系膜淋巴结、睾丸(或卵巢)、膀胱进行病理组织学检查。
(四)试验结果。
1、一般临床表现。
试验过程中动物无死亡，被毛正常有光泽，未观察到异常行为和体征。大鼠黏膜未见异常分泌物，大、小便正常，无竖毛反应、呼吸正常，未见动物步态和姿势异常，无强直或阵挛性活动、无刻板反应等反常行为。
2、眼部检查。
试验前后，对高剂量组和对照组试验大鼠(共40只，雌雄各半)进行了眼部检查，均未见动物结膜分泌物、充血、水肿，未见动物角膜、虹膜、晶状体浑浊，未见动物视网膜出血等异常表现。
3、生长状况及摄食情况。
动物体重增长情况、摄食量和食物利用率列于表11-表15中。
表11-1樟树籽仁油对卫星组大鼠体重影响
表11-2樟树籽仁油对卫星组大鼠体重影响
表12-1樟树籽仁油对卫星组大鼠周进食量的影响
表12-2樟树籽仁油对大鼠卫星组周进食量的影响
表13-1樟树籽仁油对卫星组大鼠每周增重的影响
表13-2樟树籽仁油对卫星组大鼠每周增重的影响
表14-1樟树籽仁油对大鼠卫星组周食物利用率的影响
表14-2樟树籽仁油对大鼠周食物利用率的影响
表15樟树籽仁油对卫星组大鼠6周总食物利用率的影响
4、卫星组动物各项指标：
(1)受试物对卫星组大鼠体重、食物利用率的影响：
由表11-表15可见，受试物分别按4、0mL/kgBW的剂量给予2组大鼠6周，实验期间，动物活动生长正常，被毛浓密有光泽，眼部检查正常，尿液和粪便性状正常，各剂量组动物体重、体重增重、每周食物利用率、6周总食物利用率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
(2)樟树籽仁油对卫星组大鼠血常规、血生化和血电解质的影响：
受试物分别按4、0mL/kgBW的剂量，给予2组大鼠6周。由表16-表17可见，各剂量组动物白细胞计数及其分类(中性粒细胞、淋巴细胞、中间细胞比例)、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
受试物分别按4、0mL/kgBW的剂量给予2组大鼠6周，由表18可见，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)，尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白及氯、钾、钠指标与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；雄性高剂量组胆固醇低于对照组差异有显著性(P<0.05)，但在历史性对照范围内，认为无生物学意义。
表16-1樟树籽仁油对卫星组大鼠血常规的影响
表16-2樟树籽仁油对卫星组大鼠白细胞分类的影响
表17樟树籽仁油对卫星组大鼠凝血分析结果
表18-1樟树籽仁油对卫星组大鼠部分血生化的影响
表18-2樟树籽仁油对卫星组大鼠部分血生化的影响
表18-3樟树籽仁油对卫星组大鼠部分血生化的影响
表18-4樟树籽仁油对卫星组大鼠血电解质的影响
(3)卫星组大鼠尿液检查结果：
受试物分别按4、0mL/kgBW的剂量给予2组大鼠6周，动物尿液清亮透明，颜色呈淡黄色至浅黄色，由表19可见，实验动物各剂量组尿液相对密度、尿蛋白、pH值、葡萄糖和潜血与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；
表19樟树籽仁油对卫星组大鼠尿液检验结果
(4)樟树籽仁油对卫星组大鼠脏器重量及脏体比的影响：
由表20可见，受试物分别按4、0mL/kgBW的剂量给予2组大鼠6周，各剂量组的脏器重量、脏体比与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。
表20-1樟树籽仁油对卫星组大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表20-2樟树籽仁油对卫星组大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表20-3樟树籽仁油对卫星组大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表20-4樟树籽仁油对卫星组大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表20-5樟树籽仁油对卫星组大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表20-6樟树籽仁油对卫星组大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
(5)卫星组大鼠脏器大体解剖及组织学检查：
大体解剖肉眼观察各剂量组两种性别大鼠(共40只，雌雄各半)的脑(大脑、小脑、脑干)、甲状腺、胸腺、心脏、肝、脾、肾、肾上腺、胃、十二指肠、结肠、胰、肠系膜淋巴结、睾丸(或卵巢)、膀胱与对照组比较，其外观颜色和脏器大小正常，各脏器未见明显渗出、增生、水肿、萎缩等病变。进一步对高剂量组和对照组动物(40只，雌、雄各半)进行镜下病理检查。
1)脑：大脑皮质的神经元分层排列正常，无出血及水肿，大脑皮质无萎缩现象，神经元无变性坏死；小脑皮质分子层、浦肯野细胞层、颗粒层分布正常，髓质无神经胶质细胞增生；下丘-脑桥切面处基底动脉分布正常，基底动脉下方可见正常分布的脑桥横束，左右两侧为分布正常的脑桥纵束和内侧丘系。
2)甲状腺：甲状腺结构完整，无炎性细胞浸润，未发现结节性肿大，未见甲状腺上皮组织增生。
3)胸腺：胸腺小叶结构完整，皮质和髓质组织结构清楚，淋巴细胞和上皮性网状细胞分布均匀，散在分布的胸腺小体清晰可见，胸腺无萎缩及增生。
4)心脏：心肌肌纤维无变性和坏死，心内膜和心外膜处未见炎性细胞浸润，心肌细胞无肥大和萎缩，未见间质血管出血。
5)肝脏：肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，胆小管和毛细胆管未见异常。
6)脾脏：脾实质白髓及红髓组织结构清楚，未见淋巴细胞异常增生及减少。
7)肾脏：肾皮质和髓质组织结构清楚，肾单位分布均匀，肾小球毛细血管束、肾小囊、肾小管上皮细胞未见异常病理改变，肾间质无血管扩张、炎性渗出，无肾盂黏膜移行上皮，无鳞状上皮化生，无炎症细胞浸润。
8)肾上腺：各组实验动物镜下观察构成肾上腺被膜的结缔组织正常，皮质由表至里可观察到界限清楚的球状带、束状带、网状带，髓质细胞呈索团状排列，肾上腺皮质和髓质也无萎缩及炎症细胞浸润。
9)胃及十二指肠：胃及十二指肠粘膜完整，未见粘膜上皮坏死、脱落和出血。
10)结肠：结肠黏膜面平坦完整，无绒毛，大肠腺密集，固有层内可见孤立淋巴小节，结肠无出血、坏死、溃疡及炎症细胞浸润。
11)胰腺：被膜完整，无增生，胰小叶内可见正常浆液性腺泡和闰管，胰岛分散在腺泡间，胰岛细胞形成团索，胰腺组织无出血、坏死及炎症细胞浸润。
12)肠系膜淋巴结：肠系膜淋巴结皮质着色正常，浅层皮质、副皮质区、皮质淋巴窦结构清楚，无淋巴结肿大及炎症细胞浸润。
13)睾丸：可见各级生精细胞及成熟精子，间质未见异常。
14)卵巢：发育良好，可见各级卵泡和成熟黄体，无卵巢囊肿，无卵巢出血，未见间质异常。
15)膀胱：膀胱黏膜完整，变移上皮和固有层清晰，纤维膜未见异常，无炎症及水肿。
受试物分别按4、0mL/kgBW的剂量给予2组大鼠6周，40只动物大体解剖肉眼观察和显微镜下形态学观察结果表明：实验组与对照组比较，未见受试物对被检脏器：脑(大脑、小脑、脑干)、甲状腺、胸腺、心脏、肝、脾、肾、肾上腺、胃、十二指肠、结肠、胰、肠系膜淋巴结、睾丸(或卵巢)、膀胱等组织产生有意义的病理改变。
(6)全程试验动物各项指标：
1)体征及活动观察结果：
试验过程中动物无死亡，被毛正常有光泽，未观察到异常行为和体征。大鼠黏膜未见异常分泌物，大、小便正常，无竖毛反应、呼吸正常，未见动物步态和姿势异常，无强直或阵挛性活动、无刻板反应等反常行为。试验前后，对高剂量组和对照组试验大鼠(共40只，雌雄各半)进行了眼部检查，均未见动物结膜分泌物、充血、水肿，未见动物角膜、虹膜、晶状体浑浊，未见动物视网膜出血等异常表现。
2)樟树籽仁油对90天喂养大鼠体重、食物利用率的影响：
由表21-表25可见，受试物分别按4mL、2mL、1mL/kgBW的剂量给予各组大鼠90天，实验期间，各剂量组动物体重、体重增重、每周食物利用率、总食物利用率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
表21-1樟树籽仁油对大鼠体重影响
表21-2樟树籽仁油对大鼠体重影响
表21-3樟树籽仁油对大鼠体重影响
表22-1樟树籽仁油对大鼠周进食量的影响
表22-2樟树籽仁油对大鼠周进食量的影响
表22-3樟树籽仁油对大鼠周进食量的影响
表23-1樟树籽仁油对大鼠体重增重的影响
表23-2樟树籽仁油对大鼠体重增重影响
表23-3樟树籽仁油对大鼠体重增重影响
表24-1樟树籽仁油对大鼠周食物利用率的影响
表24-2樟树籽仁油对大鼠周食物利用率的影响
表24-3樟树籽仁油对大鼠周食物利用率的影响
表25樟树籽仁油对大鼠总食物利用率的影响
3)樟树籽仁油对90天喂养大鼠血常规、血生化和血电解质的影响：
受试物分别按4mL、2mL、1mL/kgBW的剂量给予各组大鼠90天，由表26～表27可见，各剂量组动物白细胞计数及其分类(中性粒细胞、淋巴细胞、中间细胞比例)、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
表26-1樟树籽仁油对卫星组大鼠血常规的影响
表26-2樟树籽仁油对卫星组大鼠白细胞分类的影响
表27樟树籽仁油对大鼠凝血分析结果
受试物分别按4mL、2mL、1mL/kgBW的剂量给予各组大鼠90天，由表28可见，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)，尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白及氯、钾、钠指标与对照组比较，均无显著性差异(P>0.05)；雌、雄性高剂量组血糖低于对照组差异有显著性(P<0.05)但在历史性对照范围内，认为无生物学意义。
表28-1樟树籽仁油对大鼠部分血生化的影响
表28-2樟树籽仁油对大鼠部分血生化的影响
表28-3樟树籽仁油对大鼠部分血生化的影响
表28-4樟树籽仁油对大鼠血电解质的影响
4)樟树籽仁油对90天喂养大鼠尿液的影响：
受试物分别按4mL、2mL、1mL/kgBW的剂量给予各组大鼠90天，动物尿液清亮透明，淡黄色至浅黄色，由表29可见，实验动物各剂量组尿液相对密度、尿蛋白、pH值、葡萄糖和潜血与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；
表29樟树籽仁油对大鼠尿液检验结果
5)樟树籽仁油对90天喂养大鼠脏器重量及脏体比的影响：
由表30可见，受试物分别按4mL、2mL、1mL/kgBW的剂量给予各组大鼠90天，各剂量组的脏器重量、脏体比与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。
表30-1樟树籽仁油对大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表30-2樟树籽仁油对大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表30-3樟树籽仁油对大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表30-4樟树籽仁油对大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表30-5樟树籽仁油对大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
表30-6樟树籽仁油对大鼠部分脏器重量及脏体比的影响
6)90天喂养大鼠脏器大体解剖及组织学检查。
大体解剖肉眼观察各剂量组两种性别大鼠(共80只，雌、雄各半)的脑、垂体、甲状腺、胸腺、心脏、肺、肝、脾、肾、肾上腺、胃和十二指肠、结肠、胰、肠系膜淋巴结、睾丸(或卵巢)、附睾、前列腺、膀胱、空肠、回肠、结肠、直肠与对照组比较，其外观颜色和脏器大小正常，各脏器未见明显渗出、增生、水肿、萎缩等病变。对高剂量组和对照组动物(40只，雌、雄各半)进行镜下病理检查。
(1)脑：大脑皮质的神经元分层排列正常，无出血及水肿，大脑皮质无萎缩现象，神经元无变性坏死；小脑皮质分子层、浦肯野细胞层、颗粒层分布正常，髓质无神经胶质细胞增生；下丘-脑桥切面处基底动脉分布正常，基底动脉下方可见正常分布的脑桥横束，左右两侧为分布正常的脑桥纵束和内侧丘系。
(2)垂体：垂体的远侧部、中间部和神经部结构均完整，无细胞萎缩，未见垂体囊肿。
(3)甲状腺：甲状腺结构完整，无炎性细胞浸润，未发现结节性肿大，未见甲状腺上皮组织增生。
(4)胸腺：胸腺小叶结构完整，皮质和髓质组织结构清楚，淋巴细胞和上皮性网状细胞分布均匀，散在分布的胸腺小体清晰可见，胸腺无萎缩及增生。
(5)肺：肺组织各级支气管管壁和肺泡隔结构均完整，未见肺水肿和出血，肺组织细胞无坏死及炎细胞浸润，间质也未见纤维化。
(6)心脏：心肌肌纤维无变性和坏死，心内膜和心外膜处未见炎性细胞浸润，心肌细胞无肥大和萎缩，未见间质血管出血。
(7)肝脏：肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，胆小管和毛细胆管未见异常。
(8)脾脏：脾实质白髓及红髓组织结构清楚，未见淋巴细胞异常增生及减少。
(9)肾脏：肾皮质和髓质组织结构清楚，肾单位分布均匀，肾小球毛细血管束、肾小囊、肾小管上皮细胞未见异常病理改变，肾间质无血管扩张、炎性渗出，无肾盂黏膜移行上皮，无鳞状上皮化生，无炎症细胞浸润。
(10)肾上腺：各组实验动物镜下观察构成肾上腺被膜的结缔组织正常，皮质由表至里可观察到界限清楚的球状带、束状带、网状带，髓质细胞呈索团状排列，肾上腺皮质和髓质也无萎缩及炎症细胞浸润。
(11)胃及十二指肠：胃及十二指肠粘膜完整，未见粘膜上皮坏死、脱落和出血。个别动物胃溃疡(对照组1/20例，高剂量组2/20例)，另有个别动物炎症细胞浸润(对照组1/20例，高剂量组2/20例)。
(12)空肠：空肠绒毛结构正常，上皮内可见较多杯状细胞，空肠无出血、坏死、溃疡及炎症细胞浸润。
(13)回肠:回肠绒毛短，正常分布呈锥形，黏膜常见集合淋巴小节，回肠无出血、坏死、溃疡及炎症细胞浸润。
(14)结肠：结肠黏膜面平坦完整，无绒毛，大肠腺密集，固有层内可见孤立淋巴小节，结肠无出血、坏死、溃疡及炎症细胞浸润。
(15)直肠：直肠黏膜结构完整，未见粘膜上皮出血、坏死、溃疡及炎症细胞浸润。
(16)胰腺：胰被膜完整，无增生，胰小叶内可见正常浆液性腺泡和闰管，胰岛分散在腺泡间，胰岛细胞形成团索，胰腺组织无出血、坏死及炎症细胞浸润。
(17)肠系膜淋巴结：肠系膜淋巴结皮质着色正常，浅层皮质、副皮质区、皮质淋巴窦结构清楚，淋巴结无肿大及炎症细胞浸润。
(18)睾丸：可见各级生精细胞及成熟精子，间质未见异常。
(19)附睾：可见许多输出小管和附睾管，官腔内可见大量精子细胞及精母细胞，间质未见异常。
(20)卵巢：发育良好，可见各级卵泡和成熟黄体，无卵巢囊肿，无卵巢出血，未见间质异常。
(21)子宫：子宫内膜正常，无增生及炎症细胞浸润，子宫肌层未见出血，外膜未见异常。
(22)前列腺：前列腺腺泡和导管未见增生及炎细胞浸润，前列腺被膜未见异常。
(23)膀胱：膀胱黏膜完整，变移上皮和固有层清晰，纤维膜未见异常，膀胱无炎症及水肿现象。
胃显微镜下所见，其病理学改变仅在个别动物中发生且在实验动物中常有发生，为实验动物常见自发性病变，并非因实验动物摄食受试物引发，认为与受试物无关。
综上所述：大体解剖肉眼观察和显微镜下形态学观察结果表明，所检测病理指标未见由受试物引起的异常改变。
(五)试验结论。
受试物以4mL、0mL/kgBW对SPF级SD大鼠40只(雌雄各半)，连续灌胃给予6周(卫星组)；受试物分别按4mL、2mL、1mL/kgBW的剂量给予各组大鼠80只(雌雄各半)，连续灌胃给予90天(全程实验组)。(6周和全程实验)实验期间，动物活动生长正常，被毛浓密有光泽，各剂量组动物体重、总食物利用率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。实验6周，卫星组动物，雄性高剂量组胆固醇低于对照组差异有显著性(P<0.05)，但在本室历史性对照范围内，认为无生物学意义，其余剂量组的相关指标与对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)。实验结束时，全程实验各剂量组动物白细胞计数及其分类(中性粒细胞、淋巴细胞、中间细胞比例)、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)，尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白及氯、钾、钠指标与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；雌、雄性高剂量组血糖低于对照组差异有显著性(P<0.05)，但在本室历史性对照范围内，认为无生物学意义，各剂量组尿液相对密度、尿蛋白、pH值、葡萄糖和潜血与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；实验期间，各剂量组动物体重、体重增重、每周食物利用率、总食物利用率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。病理检查，未见受试物对被检脏器产生有意义的病理变化。根据本样品在大鼠90天经口重复给样毒性试验结果，本样品的NOAEL大于4mL/kg bw/天。
毒理学试验结果充分说明，本发明专利制备得到的樟树籽仁油食用安全、无毒副作用。
Claims (1)
1.一种樟树籽仁油的提取方法，包括以下步骤：
（1）采用齿辊挤压破樟树籽皮肉，使得樟树籽的果皮果肉与樟树籽核分离，然后，利用毛辊摩擦和循环水冲洗设备，除去樟树籽皮肉和樟树籽核表面上的樟树精油，得到湿樟树籽核；干燥脱水，得到重量百分比含水量<5%的干樟树籽核；
（2）根据干樟树籽核直径差异、采用装有筛网孔径范围为3.5~9mm、级间孔径差为0.05~0.25 mm的多级震动筛将樟树籽核分级，然后分别存储备用；
（3）采用微间距比樟树籽核直径小0.05~0.1 mm双辊或双磨盘挤压破壳、然后同步采用震动分离和气流分离技术，初步分离干樟树籽核壳和仁；分别收集初步分离的樟树籽壳和樟树籽仁；
（4）同时采用色泽识别和气流分选技术，对步骤（3）初步分离的樟树籽壳和樟树籽仁再分别进行壳、仁分离，收集樟树籽壳，用于提取樟树精油、制备活性炭；收集樟树籽仁，用于提取樟树籽仁油；
（5）采用35℃~65℃水循环冲洗步骤（4）收集到的樟树籽仁，除去樟树籽仁表面粘附的樟树籽壳粉末和樟树精油；
（6）采用水蒸气蒸馏步骤（5）得到的樟树籽核仁30~240min，进一步除去樟树籽仁表面附着的樟树精油，得到不含樟树精油的樟树籽仁；
（7）采用水/酶提取法，从不含樟树精油的樟树籽仁中提取出樟树籽仁毛油；或对不含樟树精油的樟树籽仁进行干燥脱水、使樟树籽仁重量百分比含水量<5%，然后采用压榨法或溶剂萃取法或超临界CO2提取法或压榨-萃取组合法，从樟树籽仁中提取出不含樟树精油的樟树籽仁毛油；
（8）经包括脱酸、脱色、脱臭在内的油脂精炼过程，得到不含樟树精油的樟树籽仁油。
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