CN114010779A - 抗ninj1抗体在制备治疗痛风的药物中的用途及药物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗NINJ1抗体在制备治疗痛风的药物中的用途及药物制剂，属于生物医药与分子靶点技术领域，本发明研究了靶向NINJ1分子可以抑制痛风进程中炎症小体活化后走向死亡命运细胞的脂膜破裂或破碎，阻止细胞内容物的释放，从而可以抑制相关DAMP所致的过度的炎症反应，实现对剧烈炎症的控制，缓解痛风发病。本发明的研究发现，使用NINJ1特异性的中和抗体治疗可以显著缓解动物模型中的痛风发作，由此得出靶向NINJ1可以用于痛风的临床治疗。

Description

抗NINJ1抗体在制备治疗痛风的药物中的用途及药物制剂

技术领域

本发明涉及生物医药与分子靶点技术领域，具体涉及一种抗NINJ1抗体在制备治疗痛风的药物中的用途及药物制剂。

背景技术

痛风是由尿酸盐晶体沉积在关节和非关节等软组织部位所引起的炎症性疾病，其临床表现为累及下肢关节的极度疼痛等。遗传和代谢等因素可以导致血液中累积较高浓度的尿酸，在一些生理变化和外界条件的刺激下，高浓度的尿酸析出尿酸盐晶体并沉积在相关组织。沉积的尿酸盐可以和其它因素一起协同激活NLRP3炎症小体，产生活性的前炎性细胞因子IL-1β等启动痛风炎症，NLRP3炎症小体的活化还会进一步导致细胞焦亡以及其它类型的细胞死亡。焦亡或死亡细胞的内容物被释放到周围环境，其中包含大量的DAMP，这些DAMP会进一步激活免疫反应导致更剧烈的炎症，造成痛风发作期的极度疼痛表现。

目前临床上对于痛风的治疗主要是急性发作期的抗炎镇痛(例如，秋水仙碱、非甾体类抗炎药、激素等)和缓解期的降尿酸治疗(例如，促进尿酸排泄药、抑制尿酸合成药等)。目前还没有直接针对这种剧烈炎症反应的治疗靶点，也没有NINJ1和痛风的相关研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种抗NINJ1抗体的新用途。

抗NINJ1抗体，即anti-Ninjurin1，是一种神经损伤诱导蛋白1抗体。

本发明研究了靶向NINJ1分子可以抑制痛风进程中炎症小体活化后走向死亡命运细胞的脂膜破裂或破碎，阻止细胞内容物的释放，从而可以抑制相关DAMP所致的过度的炎症反应，实现对剧烈炎症的控制，缓解痛风发病。我们首次发现证明了NINJ1在痛风治疗中的良好疗效。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种抗NINJ1抗体在制备治疗痛风的药物中的用途。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备靶向作用NINJ1分子的制剂。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备痛风进程中NLRP3炎症小体的抑制剂。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备细胞脂膜破裂或破碎的抑制剂。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备DAMP的释放抑制剂。

本发明还提供一种用于治疗痛风的药物制剂，所述药物制剂包括如上所述的抗NINJ1抗体，并辅以药学上可接受的辅料或载体。

本发明的有益效果：

1、本发明通过实验证明，NINJ1是痛风疾病的治疗靶点，靶向NINJ1分子能够显著的改善痛风发病情况。在小鼠痛风模型中使用NINJ1特异性的中和抗体对NINJ1进行干扰显著的抑制了小鼠对踝关节注射尿酸盐的炎症反应，小鼠的关节红肿程度以及体内炎症水平显著降低，由此可见，使用NINJ1特异性的中和抗体在小鼠痛风模型中显著的改善了小鼠关节炎症表现，小鼠的关节红肿程度显著缓解。

2、本发明的研究发现，使用NINJ1特异性的中和抗体治疗都可以显著缓解动物模型中的痛风发作，靶向NINJ1可以用于痛风的临床治疗。

附图说明

图1是本发明使用NINJ1特异性的中和抗体对改善小鼠痛风症状的对比图。NC为生理盐水踝关节注射组，MSU为尿酸盐晶体悬液注射组，IGg为同型抗体注射组，anti-NINJ1为NINJ1中和抗体注射组。左图(a)为小鼠关节照片，右图(b)为对应的炎症水平检测。

图2是本发明使用NINJ1特异性的中和抗体对改善小鼠痛风症状的病理图片。(a)NC为生理盐水踝关节注射组，(b)MSU为尿酸盐晶体悬液注射组，(c)IGg为同型抗体注射组，(d)anti-NINJ1为NINJ1中和抗体注射组。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

尿酸盐，10mg/mL，购买自Sigma-Aldrich。

purified mouse anti-Ninjurin(anti-NINJ1)中和抗体，购自BD Biosciences,cat#610777，250μg/mL。

下述各实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

本发明提供了一种抗NINJ1抗体在制备治疗痛风的药物中的用途。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备靶向作用NINJ1分子的制剂。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备痛风进程中NLRP3炎症小体的抑制剂。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备细胞脂膜破裂或破碎的抑制剂。

优选地，所述抗NINJ1抗体用于制备DAMP的释放抑制剂。

该抗NINJ1抗体能够靶向NINJ1分子，并抑制痛风进程中NLRP3炎症小体活化后走向死亡的细胞的脂膜破裂或破碎，从而抑制相关DAMP的释放。

本发明还提供了一种用于治疗痛风的药物制剂，所述药物制剂包括如上所述的抗NINJ1抗体，并辅以药学上可接受的辅料或载体。

下面采用anti-NINJ1中和抗体对靶向NINJ1来治疗痛风的机制进行具体说明。

通过anti-NINJ1中和抗体靶向NINJ1分子治疗痛风的动物试验

1、实验动物

C57/BL6雄性小鼠，购自杭州子源实验动物科技有限公司。

所有小鼠都饲养在无病原体的动物设施中，任意提供无菌水和食物，并在8-12周龄时用于实验。中科大附属第一医院动物伦理委员会批准了所有程序。

2、MSU晶体悬浊液制备

通过将10mg/mL尿酸盐(Sigma-Aldrich)溶解在0.01M NaOH(pH 7.1)溶液中，在无热原条件下制备MSU(单钠尿酸盐)晶体，得到过饱和尿酸溶液。采用0.45μm滤膜过滤过饱和尿酸溶液，并在室温下干燥持48小时，得到MSU晶体。将MSU晶体用100％乙醇洗涤并超声处理以减小其尺寸，得到MSU晶体悬浊液。

3、建立小鼠痛风模型

3.1、分组

将20只小鼠，随机分为正常组(NC组)、模型组(MSU组)、实验组(anti-NINJ1组)，同型对照组(IGg组)，每组5只小鼠。

3.2、打耳标标记

分别完成四组小鼠编号，并将小鼠固定后，用记号笔在每只小鼠右后踝关节正中部位画一圈作标记。

3.3、尾静脉注射anti-NINJ1中和抗体

实验组(anti-NINJ1组)：每只小鼠尾静脉注射purified mouse anti-Ninjurin中和抗体2.5μg(BD Biosciences,cat#610777，250μg/mL)；

同型对照组(IGg组)：每只小鼠尾静脉注射Mouse IgG2a isotype(CST#61656S)2.5μg，用以排除抗体本身对动物的干扰。

3.4、造模

将模型组(MSU组)、实验组(anti-NINJ1组)、同型对照组(IGg组)均选右后踝关节外侧后方为穿刺点，踝关节尽量屈曲90度，用碘伏局部消毒后，针口斜面朝前上方，每只小鼠均选用4号针头向沿跟腱内侧30°-40°向下刺入关节腔注射MSU溶液(100μL 100mg/mLMSU)。以上过程严格按照无菌操作，以关节囊对侧鼓起为注入标准。

正常组(NC组)用相同剂量的生理盐水同法注射，注入标准以关节囊对侧鼓胀为注入标准。

用上述方法制备急性痛风性关节炎模型。

4、主要观察指标及实验终点

4.1、造模前及造模后12h，观察记录各组小鼠的关节肿胀及活动情况。

4.2、造模前及造模后12h，眼眶后静脉丛采血检测炎症因子水平差异。

采用ELISA法检测小鼠模型IL-1β血清水平。

4.3、踝关节滑膜组织经过常规处理(石蜡包埋切片)后，进行HE染色，用显微镜观察踝关节滑膜组织病理形态改变。主要观察：关节的红肿，HE切片中炎性细胞，炎症因子IL-1分泌。

5、判定标准

5.1、关节肿胀情况判定标准

无：无关节肿胀。

轻微：皮肤变红，关节轻度肿胀。

重度：包括踝关节在内全部红肿，重度关节肿胀，关节变形。

5.2、关节活动情况判定标准

正常：正常外观和屈曲状态。

受限：包括踝关节在内全部红肿，伴关节强直及活动受限。

6、实验结果

6.1、小鼠的关节肿胀及活动情况

表3造模前及造模后12h小鼠状态观察结果

通过实验观察可知，与正常组(NC组)相比，造模后12h明显观察到模型组(MSU组)小鼠踝关节肿胀，皮温升高，关节活动受限，证明造模成功。

与模型组(MSU组)相比，造模后12h，同型对照组(IGg组)小鼠踝关节肿胀，关节活动受限；而实验组(anti-NINJ1组)小鼠关节红肿程度较轻，由此说明，使用anti-NINJ1中和抗体对NINJ1进行干扰，能够使小鼠的关节红肿程度明显降低。

6.2、小鼠血清中IL-1β含量检测结果

表4造模前及造模后12h小鼠血清中IL-1β含量

组别	NC组	MSU组	anti-NINJ1组	IGg组
					造模前平均值(pg/ml)	41.56	42.35	44.85	52.72
造模后平均值(pg/ml)	75.0	164.06	67.72	176.60

IL-1β是一种非常重要的促炎症细胞因子，在免疫损伤机制中起到重要的调节作用。由表4结果可知，造模后12h，与NC组比较，MSU组和IGg组小鼠血清中的IL-1β含量均升高，而anti-NINJ1组小鼠血清中的IL-1β含量有所下降。由此说明使用anti-NINJ1抗体对NINJ1进行干扰，能够显著改善小鼠关节炎症表现，且关节红肿程度显著缓解，这也进一步验证使用anti-NINJ1中和抗体对NINJ1进行干扰能够显著缓解小鼠模型中的痛风发作。

图1是本发明使用NINJ1特异性的中和抗体对改善小鼠痛风症状的对比图。左图(a)为小鼠关节照片，右图(b)为对应的炎症水平检测。其中NC为生理盐水踝关节注射组，MSU为尿酸盐晶体悬液注射组，IGg为同型抗体注射组，anti-NINJ1为NINJ1中和抗体注射组。

如图1所示，MSU注射显著引起了小鼠关节的痛风表现，相对于NC组，MSU组的小鼠关节更加红肿，对应的炎症因子IL-1β产生也更多，而anti-NINJ1组通过注射NINJ1中和抗体显著抑制了MSU诱导的痛风发作，相对MSU组，anti-NINJ1组的小鼠关节红肿情况显著缓解，对应的炎症细胞也更少，而IGg组采用对照抗体注射则基本无影响，表明使用NINJ1中和抗体可以缓解MSU诱导的小鼠痛风发作。

6.3、踝关节滑膜组织病理形态学观察结果

图2是本发明使用NINJ1特异性的中和抗体对改善小鼠痛风症状的病理图片。NC为生理盐水踝关节注射组，MSU为尿酸盐晶体悬液注射组，IGg为同型抗体注射组，anti-NINJ1为NINJ1中和抗体注射组。

如图2所示，MSU注射显著引起了小鼠鼠关节的痛风表现，相对NC组，MSU组的炎症细胞数量更多，而anti-NINJ1组通过注射NINJ1中和抗体显著抑制了MSU诱导的痛风发作，相对MSU组，anti-NINJ1组的炎症细胞数目显著减少，而IGg组采用对照抗体注射则基本无影响，表明使用NINJ1中和抗体可以缓解MSU诱导的小鼠痛风发作。

三、结论

由上述试验证明，NINJ1是痛风疾病的治疗靶点，靶向NINJ1分子能够显著的改善痛风发病情况。在小鼠痛风模型中对NINJ1进行干扰显著的抑制了小鼠对踝关节注射尿酸盐的炎症反应，小鼠的关节红肿程度以及体内炎症水平显著降低，由此可得，使用NINJ1特异性的中和抗体治疗可以显著缓解动物模型中的痛风发作，靶向NINJ1可以用于痛风的临床治疗。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗NINJ1抗体在制备治疗痛风的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗NINJ1抗体用于制备靶向作用NINJ1分子的制剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗NINJ1抗体用于制备痛风进程中NLRP3炎症小体的抑制剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗NINJ1抗体用于制备细胞脂膜破裂或破碎的抑制剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述抗NINJ1抗体用于制备DAMP的释放抑制剂。

6.一种治疗痛风的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1～5任一项所述的抗NINJ1抗体，并辅以药学上可接受的辅料或载体。

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