CN113999298A - 一种动物胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents

一种动物胶原蛋白肽的制备方法 Download PDF

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杨彪
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Abstract

本发明涉及一种动物胶原蛋白肽的制备方法,包括原料预处理、脱脂处理、除杂蛋白、超细粉制备及超声波辅助酶解及真空冷冻干燥,将经预处理后的超细微原料制成溶液,料液比为1:20‑1:70,按3000‑6000 U/g加入蛋白酶解液,在酶解的过程中加入超声波辅助,酶解时间为3.5‑5h,酶解温度为40‑45℃,最终得到胶原蛋白肽粉末。本发明制备方法简单,步骤易于操作,采用超声波辅助酶解的方法提取家禽副产物中的胶原蛋白肽,酶解程度高,得率高。

Description

一种动物胶原蛋白肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种动物胶原蛋白肽的制备方法,属于农副产品加工技术领域。
背景技术
胶原蛋白是人体组织结构的主要成分之一,它遍及全身的各个组织器官,如:皮肤、骨骼、软骨、韧带、角膜以及各种内膜筋膜等,是维持皮肤和组织器官形态、结构的主要成分,也是修复各损伤组织的重要物质。随着人们生活水平的逐渐提高,家禽的加工市场前景广阔,但对于家禽的一些内脏基本都是直接遗弃,但若能对这些进行二次利用,则能够充分利用资源,实现废物的再利用,符合当今绿色发展的时代要求。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题,提供了一种动物胶原蛋白肽的制备方法。
本发明采用如下技术方案:一种动物胶原蛋白肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)原料预处理:将鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽产物解冻后,将鸡爪去除趾骨得到原料并处理得到组织颗粒;
(2)脱脂处理:取原料组织颗粒加入质量4-6倍的蒸馏水,然后向其中加入质量浓度为0.5%的NaOH及质量浓度为0.5%的Na2CO3溶液,混合均匀后加热至35-40℃搅拌0.5-1h,待冷却后密封保存;
(3)除杂蛋白:将脱脂后的原料至于0.1moL/L的NaOH溶液中浸泡5-6h,蒸馏水清洗至中性;
(4)超细粉的制备:进料气体通过文丘里喷嘴以40-50m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室,得到原料粉末粒径在10-20μm;
(5)超声波辅助酶解:将经预处理后的超细微原料制成溶液,料液比为1:60,加入酶解液,在酶解的过程中加入超声波辅助,酶解时间为3.5-5h;
(6)真空冷冻干燥:将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h,得到胶原蛋白肽粉末。
进一步的,所述步骤(1)中解冻后70~80℃的水浸泡3~6min。
进一步的,所述步骤(2)中混合加热搅拌后再加入0.5%的Na2CO3溶液继续搅拌1h。
进一步的,所述步骤(3)中NaOH溶液每隔2-3h更换一次。
进一步的,所述步骤(4)中加速超音速300-350m/s的速度做螺旋状运动。
进一步的,所述步骤(4)中的气流粉碎机的工作压力在6-8bar,工作功率在2.5Kw。
进一步的,所述步骤(5)中超声波的功率为100-300W,超声时间为20-40min。
进一步的,所述步骤(5)中酶解液包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶及胰蛋白酶中的一种或几种。
本发明的有益效果:本发明制备方法简单,步骤易于操作,采用超声波辅助酶解的方法提取家禽副产物中的胶原蛋白肽,酶解程度高,得率高。
附图说明
图1是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的紫外吸收光谱图。
图2是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的红外光谱分析图。
图3是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的X射线图。
图4是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的圆二色谱图。
图5为本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的SDS-PAGE电泳图。
图6为本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的分子量分布图。横坐标为时间;纵坐标为响应值。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的解释和说明。
实施例一:一种动物胶原蛋白肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)将冷冻鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽副产物进行流水解冻,用70℃的水浸泡6min,把以上家禽副产物依次捞出掌心朝上置于砧板,先用小手术刀在鸡爪末端、关节处横切几下,接着沿跗跖骨纹路竖切一刀,便顺刀口方向即取出跗跖骨组织;再在每根趾骨上划一痕,扯开趾骨上的鸡爪皮,依次取出各部分趾骨,剩余部分则称为鸡爪,将所得的鸡爪分装于自封袋中,于-20℃中备用;
(2)将一定量的鸡副产物原料组织颗粒装入烧杯中,首先向其中加入4倍蒸馏水(以皮块质量为基准),而后加入0.5%的NaOH和0.5%的Na2CO3(以蒸馏水的质量为基准),进行混合均匀后在40℃搅拌1h,后取出样品冷却淋干,再加入0.5%的Na2CO3(以蒸馏水的质量为基准),继续搅拌0.5h,待冷却淋干后密封保存备用;
(3)除杂蛋白:在0.1mol/L的NaOH溶液(液料比10:1mL/g)中浸5h,溶液每3h更换一次,碱处理后的样品用蒸馏水冲洗至近乎中性,以除去鸡爪中杂蛋白成分,除杂后原料进行冻干;
(4)超细粉的制备:进料气体通过文丘里喷嘴以40m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室,加速超音速300m/s的速度做螺旋状运动,工作压力在6bar,工作功率在2.5Kw,最后使得除杂后原料粉末粒径在20μm;
(5)将经预处理后的超细微原料加入去离子水制成溶液,料液比为1:60,加入酶解液,在酶解的过程中加入超声波辅助,超声波的功率为100W,超声时间为40min,酶解时间为3.5h;酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及复合蛋白酶,酶提时间为4.0h,加酶量为6000U/g;
(6)将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h,得到胶原蛋白肽粉末,鸡爪胶原蛋白肽提取得率为45.46%。
实施例二:一种动物胶原蛋白肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)将冷冻鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽副产物进行流水解冻,用75℃的水浸泡5min,把以上家禽副产物依次捞出掌心朝上置于砧板,先用小手术刀在鸡爪末端、关节处横切几下,接着沿跗跖骨纹路竖切一刀,便顺刀口方向即取出跗跖骨组织;再在每根趾骨上划一痕,扯开趾骨上的鸡爪皮,依次取出各部分趾骨,剩余部分则称为鸡爪,将所得的鸡爪分装于自封袋中,于-20℃中备用;
(2)将一定量的鸡副产物原料组织颗粒装入烧杯中,首先向其中加入5倍蒸馏水(以皮块质量为基准),而后加入0.5%的NaOH和0.5%的Na2CO3(以蒸馏水的质量为基准),进行混合均匀后在40℃搅拌1h,后取出样品冷却淋干,再加入0.5%的Na2CO3(以蒸馏水的质量为基准),继续搅拌1h,待冷却淋干后密封保存备用;
(3)除杂蛋白:在0.1mol/L的NaOH溶液(液料比10:1mL/g)中浸6h,溶液每3h更换一次,碱处理后的样品用蒸馏水冲洗至近乎中性,以除去鸡爪中杂蛋白成分,除杂后原料进行冻干;
(4)超细粉的制备:进料气体通过文丘里喷嘴以45m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室,加速超音速320m/s的速度做螺旋状运动,工作压力在7bar,工作功率在2.5Kw,最后使得除杂后原料粉末粒径在15μm;
(5)将经预处理后的超细微原料加入去离子水制成溶液,料液比为1:60,加入酶解液,在酶解的过程中加入超声波辅助,超声波的功率为200W,超声时间为30min,酶解时间为4h;酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及复合蛋白酶,酶提时间为4.0h,加酶量为4000U/g;
(6)将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h,得到胶原蛋白肽粉末,鸡爪胶原蛋白肽提取得率可达到45.46%。
实施例三:一种动物胶原蛋白肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)将冷冻鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽副产物进行流水解冻,用80℃的水浸泡3min,把以上家禽副产物依次捞出掌心朝上置于砧板,先用小手术刀在鸡爪末端、关节处横切几下,接着沿跗跖骨纹路竖切一刀,便顺刀口方向即取出跗跖骨组织;再在每根趾骨上划一痕,扯开趾骨上的鸡爪皮,依次取出各部分趾骨,剩余部分则称为鸡爪,将所得的鸡爪分装于自封袋中,于-20℃中备用;
(2)将一定量的鸡副产物原料组织颗粒装入烧杯中,首先向其中加入6倍蒸馏水(以皮块质量为基准),而后加入0.5%的NaOH和0.5%的Na2CO3(以蒸馏水的质量为基准),进行混合均匀后在35℃搅拌1h,后取出样品冷却淋干,再加入0.5%的Na2CO3(以蒸馏水的质量为基准),继续搅拌1h,待冷却淋干后密封保存备用;
(3)除杂蛋白:在0.1mol/L的NaOH溶液(液料比10:1mL/g)中浸6h,溶液每3h更换一次,碱处理后的样品用蒸馏水冲洗至近乎中性,以除去鸡爪中杂蛋白成分,除杂后原料进行冻干;
(4)超细粉的制备:进料气体通过文丘里喷嘴以50m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室,加速超音速350m/s的速度做螺旋状运动,工作压力在8bar,工作功率在2.5Kw,最后使得除杂后原料粉末粒径在10μm;
(5)将经预处理后的超细微原料加入去离子水制成溶液,料液比为1:60,加入酶解液,在酶解的过程中加入超声波辅助,超声波的功率为300W,超声时间为20min,酶解时间为5h;酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及复合蛋白酶,酶提时间为4.0h,加酶量为3000U/g;
(6)将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h,得到胶原蛋白肽粉末,鸡爪胶原蛋白肽提取得率可达到45.46%。
一、采用紫外光谱对实施例2得到的鸡爪蛋白肽进行光谱分析:
结果如图1所示。
根据图1知,UV光谱图对于鸡爪蛋白肽的波长扫描范围在200~400nm间,可见鸡爪胶原蛋白肽在220~230nm内出现特征吸收峰,是由于胶原蛋白在碱性蛋白酶的作用下三股螺旋结构逐渐被打开,分子表面出现具有紫外吸收的生色基团,肽键C=O电子的能级跃迁产生强吸收;图中还能看到270~280nm之间微微产生一个小隆峰,这说明胶原蛋白肽中含有少许芳香族氨基酸,如酪氨酸残基(在278nm有强吸收)和苯丙氨酸残基(在259nm有强吸收)等。且随着扫描波长的增加,提取得到的鸡爪胶原蛋白肽中氨基酸得到更多暴露,结构更加疏松。
二、采用红外光谱对实施例1-3得到的鸡爪蛋白肽进行光谱分析
结果如图2所示。
胶原蛋白肽的红外光谱扫描谱图均由酰胺A、B与酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组成。有研究报道称由N-H基团伸缩振动所产生的吸收峰,是位于3300~3500cm-1波长范围内。在波长范围为1200~1700cm-1的3个吸收峰分别代表反映肽构象的酰胺Ⅰ带、Ⅱ带与Ⅲ带。由图2得位于1500~1600cm-1波长处的是酰胺Ⅰ带,1653cm-1波长处产生一个微弱的肽键C=O的伸缩振动,可表明胶原分子的三螺旋结构已被破坏,这个峰位是属于胶原蛋白肽的重要峰位。1300~1400cm-1波长范围内的吸收峰是酰胺Ⅱ带。1530~1510cm-1波长区域与1550~1530cm-1波长区域表明反平行与平行β-折叠结构的存在,图谱中的样品在这两个区域间均不存在吸收峰,则鸡爪胶原蛋白肽不具备β-折叠结构。胶原蛋白肽在波长为1300~1400cm-1范围内的吸收峰为酰胺Ⅲ带,这是肽特有的吸收峰。以上分析说明实验得到的鸡爪胶原蛋白肽,符合肽特征谱图。
三、采用X射线对实施例1-3得到的鸡爪蛋白肽进行分析
结果如图3所示。
胶原蛋白X-射线衍射谱通常具备3个主峰,第1个峰的2θ值约为10°,是反映胶原蛋白分子链间的距离(d);第2个峰的2θ值约为20°,是反映胶原蛋白分子内部存在的非结晶成分含量比例的大小;第3个峰的2θ值约为30°。由图3可得:鸡爪胶原蛋白肽的第一个峰和第二个峰较为明显,第三个峰不明显,这说明胶原蛋白的三螺旋结构遭到严重破坏,有序程度降低,变成小分子的肽段。
四、采用圆二色谱对实施例1-3得到的鸡爪蛋白肽进行光谱分析。
结果如图4所示。
可得鸡爪胶原蛋白肽在波长220~224nm范围内没有出现正吸收峰,正负吸收带之间无明显的转折点,在扫描波长为194nm处出现了负吸收峰,这表明胶原分子构象中出现无规卷曲的现象,说明鸡爪胶原分子三股螺旋结构被破坏,符合胶原蛋白肽的基本构象。
五、根据胶原蛋白及胶原蛋白肽的区别,进行SDS-PAGE电泳实验,进行定性分析。
结果如图5所示。
从左往右第二条带、第三条带、第四条带分别是质量体积分数为5mg/mL鸡爪胶原蛋白肽的条带、marker、质量体积分数为2.5mg/mL的鸡爪胶原蛋白肽条带。凝胶电泳图谱结果显示,可清晰看到质量体积比为5mg/mL的产物有3条染色较深的条带,分别为α1链、α2链和β链,每个蛋白组分均得到了较好的反映。而质量体积比为2.5mg/mL的产物的条带不模糊,可能是由于质量体积比会直接影响上样量的多少,当质量体积比较少时,一部分蛋白组分得不到有效反映。图谱底部有些条带聚集,颜色沉积,可能是由于一些蛋白组分密切联结,堆积在一起而无法分开。总体来说,由图可得产物的电泳条带基本都集中在α2链以下,即说明胶原蛋白三螺旋基本结构遭到破坏,大部分已被酶解为小分子肽。
六、实施例所得产品分子量的分布表
据食品安全国家标准GB 31645—2018规定:富含胶原蛋白的新鲜动物组织在水解到一定程度后,分子量变为较小时,称为胶原蛋白肽。鸡爪胶原蛋白肽分子量分布情况见表1和图6,可得对鸡爪胶原蛋白肽而言,71%胶原蛋白肽分子量在1.35KDa≤Mw<17KDa范围内,27%胶原蛋白肽分子量小于1.35KDa。研究表明:胶原蛋白肽具有的小分子量组分百分含量较多,则其溶解度较好;相对而言,若胶原蛋白肽分子的大分子量组分含量较高,则其溶解性能较差。综上可得小分子量的胶原蛋白肽更易被人体所吸收,其体内消化转换率更高。
如下表1所示,为产物分子量分布表
表1产物的分子量分布表
Figure BDA0003340119370000051

Claims (8)

1.一种动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)原料预处理:将鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽产物解冻后,将鸡爪去除趾骨得到原料并处理得到组织颗粒;
(2)脱脂处理:取原料组织颗粒加入质量4-6倍的蒸馏水,然后向其中加入质量浓度为0.5%的NaOH及质量浓度为0.5%的Na2CO3溶液,混合均匀后加热至35-40℃搅拌0.5-1h,待冷却后密封保存;
(3)除杂蛋白:将脱脂后的原料至于0.1moL/L的NaOH溶液中浸泡5-6h,蒸馏水清洗至中性,粉碎处理得到组织颗粒;
(4)超细粉的制备:采用氮气为进料气体通过文丘里喷嘴以40-50 m/s的速度带着除杂后的原料组织颗粒喷入平碟型的粉碎室,得到原料粉末粒径为10-20 μm;
(5)超声波辅助酶解:将经预处理后的超细微原料制成溶液,料液比为1:20-1:70,按3000-6000 U/g加入蛋白酶解液,在酶解的过程中加入超声波辅助,酶解时间为3.5-5h,酶解温度为40-45℃;
(6)真空冷冻干燥:将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h,得到胶原蛋白肽粉末。
2.如权利要求1所述的动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中家禽产物解冻后采用70~80℃的水浸泡3~6 min。
3.如权利要求1所述的动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中混合加热搅拌后再加入0.5%的Na2CO3溶液继续搅拌1h。
4.如权利要求1所述的动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中NaOH溶液每隔2-3h更换一次。
5.如权利要求1所述的动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中进料时采用加速超音速300-350 m/s的速度做螺旋状运动。
6.如权利要求1所述的动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中的气流粉碎机的工作压力在6-8 bar,工作功率在2.5 Kw。
7.如权利要求1所述的动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中超声波的功率为100-300W,超声时间为20-40min。
8.如权利要求1所述的动物胶原蛋白肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中酶解液包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶及胰蛋白酶中的一种或几种。
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