CN113999248A

CN113999248A - 一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113999248A
Application number: CN202111293849.9A
Authority: CN
Inventors: 刘琪; 游孟可; 操玉青; 许斌; 肖俊杰; 李进; 高明春; 邓嘉莉
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-11-03
Also published as: CN113999248B

Abstract

本发明提供了一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物及其制备方法和应用，涉及新型药物技术领域。本发明所述小分子化合物根据miR‑29b进行设计，本发明通过功能逆转实验，证实上调miR‑29b能够显著抑制运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能，表明miR‑29b是介导运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能的重要效应因子；并且通过细胞实验验证，筛选出了一种小分子化合物SHU00281，能有效抑制AngII诱导的肌肉萎缩。本发明所述小分子化合物合成步骤简单、成本易控、结构性能容易优化，口服性好，有较好的成药优势和市场前景。

Description

一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于新型药物技术领域，具体涉及一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物及其制备方法和应用。

背景技术

心力衰竭患者会由于血管紧张素II(AngII)的上调，导致肌肉萎缩。运动训练是治疗心力衰竭引起的肌肉萎缩的唯一方法，而心力衰竭患者运动能力降低，限制了运动疗法的运用，因此亟需揭示运动保护心力衰竭引起的肌肉萎缩的关键效应因子。

肌肉萎缩是当前国际上医学界的难题，其病因还不十分清楚，并且无特效药治疗。有研究指出由于中枢神经元退化，导致肌肉萎缩的进行性麻痹，可使用基因工程有关物质治疗，激活退化中枢神经元，恢复肌肉功能，但是基因工程药物属高新技术，价格较高，工业化生产有待进一步改进提高。并且目前市场上miRNA的抑制剂主要是序列互补的经过特殊修饰的寡核苷酸，其应用上主要存在以下困难：结构复杂，难以合成、分离和结构优化；性能对立体构型的依赖性较高，易被外界条件所影响，保存和运输成本较高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物及其制备方法和应用，所述小分子化合物对肌肉萎缩有显著的防治效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物，所述小分子化合物包括异噁唑啉骨架，熔点为73～75℃。

优选的，所述小分子化合物包括SHU00281；

所述SHU00281的结构式如式I所示：

本发明还提供了上述小分子化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将丙烯酸丁酯、N-苯基马来酰亚胺、三水合硝酸铜、碘化钾和硼酸溶解后，于80℃反应，得4,6-二氧代-5-苯基-3a,5,6,6a-4H-吡咯[3,4-d]异恶唑-3-甲酸丁酯；

(2)将所述4,6-二氧代-5-苯基-3a,5,6,6a-4H-吡咯[3,4-d]异恶唑-3-甲酸丁酯和二氯甲烷/乙醇在硼氢化钠作用下发生还原反应，得SHU00281。

优选的，步骤(1)所述溶解的溶剂为乙腈/苯甲腈，所述乙腈/苯甲腈中乙腈和苯甲腈的体积比为2:1。

优选的，步骤(1)所述反应后，还包括氨水淬灭、乙酸乙酯萃取、干燥和纯化。

优选的，步骤(2)所述二氯甲烷/乙醇中二氯甲烷和乙醇的体积比为4:1。

优选的，步骤(2)所述还原反应后，还包括利用饱和氯化铵溶液淬灭，二氯甲烷萃取、干燥和纯化。

本发明还提供了上述小分子化合物在制备肌肉萎缩抑制剂中的应用。

优选的，所述肌肉萎缩包括AngII诱导的肌肉萎缩。

本发明还提供了一种肌肉萎缩抑制剂，所述抑制剂以上述小分子化合物为有效成分。

有益效果：本发明提供了一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物，所述小分子化合物根据miR-29b进行设计，本发明通过功能逆转实验，证实上调miR-29b能够显著抑制运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能，表明miR-29b是介导运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能的重要效应因子；并且通过细胞实验验证，筛选出了一种小分子化合物SHU00281，能有效抑制AngII诱导的肌肉萎缩。本发明所述小分子化合物SHU00281合成步骤简单、成本易控、结构性能容易优化，口服性好，有较好的成药优势和市场前景。

附图说明

图1为运动训练能够显著改善AngII诱导的肌肉萎缩，其中A：通过数字抓力仪测量小鼠抓力，n＝11:10(表示对照组11个小鼠样本，运动组10个小鼠样本，下同)；B：小鼠腓肠肌取样，检测统计肌肉质量，n＝11:10；C：通过麦胚凝集素(WGA)染色，使用ImageJ测量腓肠肌纤维的横截面积，n＝9:10；D：通过苏木素-伊红(HE)染色，使用ImageJ测量腓肠肌纤维横截面积并评价肌肉组织形态学变化，n＝7；*，P<0.05；***，P<0.001；

图2为运动训练通过促进肌肉细胞中蛋白合成与抑制蛋白降解改善AngII诱导的肌肉萎缩，其中A：蛋白质免疫印迹法检测腓肠肌中Atrogin-1和MuRF-1的表达，n＝6；B：蛋白质免疫印迹法检测腓肠肌中AKT/FOXO3A与AKT/mTOR信号通路蛋白的磷酸化，n＝6；ns，差异不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；

图3为运动训练能够显著抑制AngII诱导的肌肉细胞凋亡，其中A：肌肉冰冻切片TUNEL染色结果，ImageJ软件测定TUNEL阳性细胞核与总细胞核比值，n＝8；B：蛋白质免疫印迹法检测腓肠肌中Bax/Bcl2和Cleaved-caspase-3/Caspase-3的相对表达水平，n＝6；*，P<0.05；***，P<0.001；

图4为运动对AngII诱导的肌肉萎缩模型中miR-29b表达水平的影响，n＝11:10；*，P<0.05；**，P<0.01；

图5为腓肠肌组织中miR-29b表达量检测，n＝9:10；*，P<0.05；

图6为miR-29b过表达显著降低运动对于AngII诱导的肌肉萎缩的保护作用；其中A：miR-29b过表达显著减弱了运动训练组小鼠抓力，n＝10:11:11:11；B：AngII处理的对照组和运动组，注射对照腺相关病毒AAV8(AAV8-control)或miR-29b过表达腺相关病毒，小鼠的腓肠肌与胫骨前肌大小与质量检测，n＝10:11:11:11；ns，差异不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；

图7为miR-29b过表达显著降低了运动训练组肌纤维面积；其中A：通过麦胚凝集素(WGA)染色后，使用ImageJ软件测量肌纤维的横截面积，n＝8；B：通过苏木素-伊红(HE)染色后，使用ImageJ软件测量肌纤维面积并评价肌肉组织形态学变化，n＝8；**，P<0.01；***，P<0.001；

图8为过表达miR-29b显著上调运动训练组肌肉萎缩标志蛋白Atrogin-1和MuRF-1的表达，显著下调运动训练组AKT/FOXO3A/mTOR信号通路蛋白的磷酸化水平，n＝6；ns，差异不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；

图9为miR-29b过表达显著增加运动训练组肌肉细胞的凋亡，n＝8；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；

图10为过表达miR-29b对腓肠肌肌纤维组成类型和含量的影响，n＝6:6:5:6；ns，差异不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；

图11为细胞水平检测SHU00281对AngII诱导的C2C12肌肉萎缩模型的影响，n＝4；##或**，P<0.01；***，P<0.001。

具体实施方式

本发明所述小分子化合物优选为SHU00281；所述SHU00281的结构式如式I所示：

本发明通过miR-29b功能逆转实验，发现上调miR-29b能够显著抑制运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能，表明miR-29b是介导运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能的重要效应因子，因此根据miR-29b进行化合物设计所述小分子化合物。本发明所述小分子化合物为SHU00281，所述SHU00281是一个含有异噁唑啉和吡咯烷酮并环骨架的有机化合物，命名为：6-羟基-4-氧代-5-苯基-3a,5,6,6a-四氢-4H-吡咯[3,4-d]异恶唑-3-甲酸丁酯。本发明实施例对所述化合物SHU00281进行功能验证，证实了SHU00281对肌肉萎缩的显著防治效果。

本发明在步骤(1)所述反应时，优选还包括利用TLC板监测反应，直至原料消耗完全；当反应结束后，优选还包括冷却至室温，用氨水淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相。本发明将得到的有机相分别用水、饱和食盐水洗涤并用无水硫酸钠干燥，过滤收集滤液，除去溶剂，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到4,6-二氧代-5-苯基-3a,5,6,6a-4H-吡咯[3,4-d]异恶唑-3-甲酸丁酯为黄色油状液体。

本发明步骤(2)所述反应完全后，优选恢复至室温，用饱和氯化铵溶液淬灭，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，将有机相用饱和食盐水洗涤并用无水硫酸钠干燥。过滤后，收集滤液，除去溶剂，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到产物为黄色固体。

利用本发明所述制备方法得到的SHU00281的熔点为73～75℃；IR(KBr,cm^-1):3548,3432,2965,2872,1724,1691,1590,1499,1463,1410,1356,1303,1223,1119,997,925,849,791,760,692,643,562；¹HNMR(CDCl₃,500MHz):δ7.44-7.22(m,5H),5.59-5.44(m,1H),5.19(d,J＝9.0Hz,1H),5.06(d,J＝9.5Hz,1H),4.74(d,J＝9.0Hz,1H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),1.78-1.63(m,2H),1.49-1.35(m,2H),0.94(t,J＝7.5Hz,3H)；¹³CNMR(CDCl₃,125MHz):δ167.6,159.3,149.2,135.6,129.3,127.6,124.8,88.7,88.6,66.6,54.3,30.4,19.0,13.7；LC-MS(ESI)m/z319[M+H]⁺；HRMS(ESI)m/z calcd for C₁₆H₁₉N₂O₅[M+H]⁺319.1288,found 319.1287。

本发明实施例中通过构建AngII诱导的C2C12肌肉萎缩模型，利用SHU00281进行肌肉萎缩抑制率验证。用正在分化的肌管细胞置于24孔板培养，实验组加入用2％的马血清培养基稀释的化合物1ml，对照组加入等量的2％的马血清培养基。培养24h后收板，利用qPCR实验证实了SHU00281对肌肉萎缩的抑制作用。本发明所述肌肉萎缩优选包括AngII诱导的肌肉萎缩。

下面结合实施例对本发明提供的一类抑制肌肉萎缩的小分子化合物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

小鼠运动模型：将小鼠随机分为两个实验组：对照不运动组(Control)+AngII组和运动训练(Run)+AngII组。

运动训练组小鼠在开始实验之前，对照组不运动，运动组先在跑步机上进行运动训练适应一周，每天逐渐增加跑步速度和运动时间：第一天，5min(5m/min)，跑台坡度为0°；第二天，10min(5m/min)，跑台坡度为15°；第三天，20min(7m/min)，跑台坡度为15°；第四天，30min(9m/min)，跑台坡度为15°；第五天，40min(11m/min)，跑台坡度为15°；第六天，50min(13m/min)，跑台坡度为15°；第七天，60min(15m/min)，跑台坡度为15°。

经过一周的跑步机适应后，对照组和运动组的小鼠皮下植入1周型AngII渗透压缓释泵。将血管紧张素II(Selleck,P1085)溶于含有1*PBS和1mM乙酸溶剂中并注入AngII渗透压泵，注意不要产生气泡。将装有AngII溶液的渗透压缓释泵(ALZET,model 2001)在小鼠背部开口，以与身体平行的方向皮下植入对照组和跑步组小鼠体内，AngII泵在小鼠体内活化12h后以稳定剂量(1.5μg/kg/min)在小鼠体内释放。在AngII渗透压泵植入后的第2天，跑步组小鼠在15°倾斜坡度的跑步机上开始进行运动训练，速度15m/min，持续60min。整个运动训练持续一周，然后处死小鼠，骨骼肌组织取样称重并进行后序分析。

1、运动训练能够显著改善AngII诱导的肌肉萎缩

1.1小鼠抓力检测：使用数字抓力仪(中国益研科技有限公司,YLS-13)。首先，将力传感器仪表读值设置为零。接着，操作员拽住小鼠尾巴，轻拉尾巴，确保小鼠身体与金属拉杆垂直并抓牢金属拉杆。最后，操作员以恒定速度轻拽小鼠尾巴使小鼠远离拉杆直至小鼠与拉杆滑脱，并记录抓力数据。本实验由同一名操作人员在不清楚小鼠分组前提下对所有小鼠进行检测，每只小鼠测试3-5次，两次测试时间至少间隔30s。

麦胚凝集素(WGA)染色：将肌肉组织冰冻切片置于湿盒室温复温30min，用1*PBS清洗3次。然后，4％多聚甲醛固定组织20min，1*PBS洗涤3次。接着，将冰冻切片与带有绿色或红色荧光标记的WGA(Thermos Fisher，W11261或W21404)和DAPI在室温下共同避光孵育2h。通过Nikon荧光显微镜采集图像，每个切片采集至少20个视野并统计至少500个细胞。使用ImageJ软件测量肌纤维的横截面积。

苏木素-伊红(HE)染色：肌肉组织经4％多聚甲醛(PFA)固定48h，脱水后进行石蜡包埋。并置于石蜡切片机上切成5μm厚的肌肉组织石蜡切片，烘片脱蜡处理后，用苏木素染色液染色5min，用水清洗，随后用伊红染色液染色10-30s。通过Nikon显微镜观察并采集图像，每个切片采集至少20个视野统计至少500个细胞。使用ImageJ软件测量细胞大小并评价肌肉组织形态学变化。

结果如图1和表1所示，在AngII诱导的肌肉萎缩小鼠模型中，跑步训练可以明显改善AngII诱导的肌肉萎缩，通过小鼠抓力检测发现运动组小鼠抓力增加(图1中A)、通过称重发现腓肠肌质量增加(图1中B)、分别通过麦胚凝集素(WGA)染色和苏木素-伊红(HE)染色发现腓肠肌肌纤维横截面积增加(图1中C和D)。

表1运动训练对肌肉萎缩的影响

1.2通过磷酸蛋白抽提试剂盒(KeyGEN，KGP9100)从肌肉样本中提取总蛋白。得到的组织裂解液在4℃下12,000g离心10min，将上清液分装并储存在-80℃冰箱。使用BCA蛋白定量试剂盒(Takara，T9300A)测量蛋白样品的浓度。通过SDS-PAGE分离样本中不同分子量大小的蛋白质，接着通过电转将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜上，用5％BSA封闭后进行一抗孵育过夜。本实施例中使用的抗体如下：PPARγ(1:1,000，Abclonal，A0270),P-AKT(T308)(1:1,000，Cell Signaling Technology，Inc.#2965)，P-AKT(S473)(1:1,000，Cell Signaling Technology，193H12)，AKT(1:1,000，Proteintech，10176-2-AP)，P-FOXO3A(S253)(1:1,000，Cell Signaling Technology，9466S)，FOXO3A(1:1000，CellSignaling Technology，A0102)，P-mTOR(1:1,000，Cell Signaling Technology，2971S)，mTOR(1:1,000，Cell Signaling Technology，2972S)，P-p70S6K(1:1,000，Cell SignalingTechnology，9205S)，p70S6K(1:1,000，Cell Signaling Technology，9202S)，P-EIF-4EBP1(1:1,000，Abclonal Technology，AP0032)，EIF-4EBP1(1:1,000，Abclonal Technology，A1248)，Bax(1:1,000，Abclonal Technology，A12009)，Bcl2(1:1,000，AbclonalTechnology，A11025)，Caspase-3(1:1,000，Abclonal Technology，A2156)，GAPDH(1:10,000，Bioworld Technology，AP0063)。按照一抗说明书进行对应的二抗孵育，使用ECL显影液显影，使用Image J进行条带灰度统计。

结果如图2所示，在AngII诱导的肌肉萎缩模型中，跑步训练能够显著降低腓肠肌肌肉萎缩标志蛋白Atrogin-1和MuRF-1的表达(图2中A)，促进肌肉蛋白合成信号通路激活，表现为AKT(S473)、FOXO3A(S253)、mTOR、p70S6K和EIF-4EBP1的磷酸化水平增加(图2中B)。

表2跑步训练对Atrogin-1和MuRF-1的表达影响

Atrogin-1(Control+AngII)	Atrogin-1(Run+AngII)	MuRF-1(Control+AngII)	MuRF-1(Run+AngII)
				0.967023	1.020824	1.136962	0.844674
1.155858	0.956282	0.901142	0.726525
				0.877119	0.777189	0.961896	0.671343
0.934915	0.807027	0.979769	0.873776
				1.091169	0.742497	0.920809	0.465681
0.973916	0.581774	1.099422	0.538045

表3跑步训练对肌肉蛋白合成信号通路磷酸化影响

1.3 TUNAL染色法：将冰冻切片在室温下复温30min，用1*PBS清洗3次。然后，用4％多聚甲醛(PFA)固定组织20min，1*PBS清洗3次。接着，用蛋白酶K溶液破膜处理10min，1*PBS清洗3次。随后，在室温下用5％BSA封闭2h，加入TUNEL试剂(Promega，G3250)室温孵育1h，并用2×SSC终止。最后冰冻切片与带有红色荧光标记的WGA(Thermos Fisher，W21404)和DAPI在室温下避光孵育2h。Nikon荧光显微镜采集图像，Image J软件测定TUNEL阳性细胞核与总细胞核比值。

基于AngII诱导的肌肉萎缩模型，发现跑步训练能够显著抑制肌肉细胞的凋亡：利用TUNAL染色法发现运动组小鼠腓肠肌中TUNEL阳性细胞减少(图3中A)，利用蛋白免疫印迹法(Western blotting)发现促凋亡分子(Bax)与抗凋亡分子(Bcl-2)的比值降低，活化的Cleaved-caspase-3与Caspase-3的比值降低(图3中B，原始数据见表3中B)，表明运动显著抑制了肌肉细胞的凋亡。

表4运动对腓肠肌中TUNEL阳性细胞比例的影响

表5运动对促凋亡分子与抗凋亡分子的比例影响

上述结果表明在运动后，发现运动训练能显著改善AngII诱导的肌肉萎缩，并且利用实时荧光定量PCR法(qPCR)发现小鼠肌肉细胞中miR-29b表达量显著下降。在小鼠腿部肌肉注射miR-29b过表达腺相关病毒后，发现miR-29b下调是保护AngII诱导的肌肉萎缩所必须的。

2、运动训练能够下调miR-29b

在AngII诱导的肌肉萎缩模型中，利用实时荧光定量PCR法探究运动训练对miR-29b的影响：使用RNAiso plus试剂盒(Takara，Japan)从肌肉组织中分离提取总RNA，并根据说明书通过RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermos Fisher，USA)进行RNA反转录。采用SYBR premix Ex Taq(Takara，Japan)和Roche实时荧光定量PCR检测系统(Roche，Switzerland)进行qPCR。从广州RiboBio公司获得bulgeloop miR-29b和5S qPCR引物(购自锐博公司)。使用2^-ΔΔCT方法计算miR-29b的相对表达水平。结果发现运动能够下调miR-29b(图4，表6)，提示运动可能通过抑制miR-29b保护AngII诱导的肌肉萎缩。

3过表达miR-29b抑制运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护作用

3.1进行miR-29b的功能逆转实验：首先构建pENN-AAV-U6-miR29b过表达载体：基于pENN-AAV-U6质粒(BamHI和EcoRI)生成miR-29b过表达载体。

miR-29b的正向和反向引物如下：

SEQ ID NO.1：5’GATCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTCTCGAGAACACTGATTTCAAATGGTGCTATTTTTG-3’，

SEQ ID NO.2：:5’AATTCAAAAATAGCACCATTTGAAATCAGTGTTCTCGAGAACACTGATTTCAAATGGTGCTA-3’。

将miR-29b的两个引物在95°变性10min，然后通过逐渐降低温度退火，克隆到pENN-AAV-U6过表达载体。接着进行AAV8病毒包装：miR-29b过表达腺相关AAV8(pENN-AAV-U6-miR-29b)病毒和AAV8对照(pENN-AAV-U6)病毒在293T细胞中包装，采用碘克沙醇梯度密度离心纯化AAV8病毒直接用于动物实验。将miR-29b过表达腺相关病毒AAV8和AAV8对照病毒分别注射到对照组和跑步组小鼠右后肢腓肠肌和胫骨前肌，荧光定量PCR分析发现miR-29b过表达腺相关病毒AAV8能够显著增加miR-29b在肌肉中的表达(图5，表6)。

表6运动对miR-29b的影响

3.2 miR-29b功能逆转实验表明，上调miR-29b能够显著抑制跑步训练对AngII诱导的肌肉萎缩的保护作用，表现为抓力下降(图6中A)，腓肠肌和胫骨前肌质量下降(图6中B)。

表7上调miR-29b对跑步训练和肌肉萎缩的影响

3.3腓肠肌样本WGA与HE染色分析，发现AAV8介导的miR-29b过表达显著抑制了跑步训练对AngII诱导的肌肉萎缩保护作用，表现为肌纤维横截面积减少(图7)。

表8肌纤维横截面积

3.4 AAV8介导的miR-29b过表达上调运动训练组小鼠腓肠肌中肌肉萎缩基因Atrogin-1和MuRF-1(图8中A)，抑制肌肉蛋白合成信号通路的激活，表现为AKT(S473)、FOXO3A(S253)、mTOR、p70S6K和EIF-4EBP1的磷酸化水平降低(图8中B)。

表9不同情况下的Atrogin-1和MuRF-1表达量

表10不同情况下肌肉蛋白合成信号通路的表达

3.5腓肠肌样本TUNEL染色显示，运动训练能够明显降低AngII诱导的肌肉细胞的凋亡，miR-29b过表达显著增加了运动训练组肌肉细胞的凋亡(图9)。

表11 miR-29b过表达对肌肉细胞凋亡的影响

3.6通过免疫荧光染色评价腓肠肌肌纤维组成类型和含量：采用SYBR premix ExTaq(Takara，Japan)和Roche实时荧光定量PCR检测系统(Roche，Switzerland)进行qPCR。从广州RiboBio公司获得bulgeloop miR-29b和18S qPCR引物。使用2^-ΔΔCT方法计算miR-29b的相对表达水平。通过qPCR测定比目鱼肌中MYH1、MYH2、MYH4与18S的相对表达水平，使用的引物如下：

MYH1前引(SEQ ID NO.3):5’GCGAATCGAGGCTCAGAACAA3’，

后引(SEQ ID NO.4):5’GTAGTTCCGCCTTCGGTCTTG3’；

MYH2前引(SEQ ID NO.5):5’AAGTGACTGTGAAAACAGAAGCA3’，

后引(SEQ ID NO.6):5’GCAGCCATTTGTAAGGGTTGAC3’；

MYH4前引(SEQ ID NO.7):5’CTTTGCTTACGTCAGTCAAGGT3’，

后引(SEQ ID NO.8):5’AGCGCCTGTGAGCTTGTAAA3’；

18S前引(SEQ ID NO.9):5’TCAAGAACGAAAGTCGGAGG3’，

后引(SEQ ID NO.10):5’GGACATCTAAGGGCATCAC3’。

发现运动上调IIA型肌纤维，下调IIB型肌纤维，过表达miR-29b可抑制运动引起的IIA型肌纤维增加和IIB型减少(图10)。因此，抑制miR-29b的表达对于运动保护AngII诱导的肌肉萎缩是必要的。

表12过表达miR-29b对腓肠肌肌纤维组成类型和含量的影响

通过上述miR-29b功能逆转实验，证实上调miR-29b能够显著抑制运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能，表明miR-29b是介导运动对AngII诱导的肌肉萎缩的保护功能的重要效应因子。

实施例2

SHU00281的制备及功能验证

1、在烧瓶中加入丙烯酸丁酯(43μl)，N-苯基马来酰亚胺(207.6mg)，三水合硝酸铜(290mg)，碘化钾(49.8mg)，硼酸(37.1mg)，以及乙腈/苯甲腈(2:1，v/v，2ml)。反应在80℃下搅拌。通过TLC板监测反应，直至原料消耗完全。反应冷却至室温，并用氨水淬灭，乙酸乙酯萃取(3×10ml)。合并的有机相分别用水、饱和食盐水洗涤并用无水硫酸钠干燥。过滤后，收集滤液，除去溶剂，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到4,6-二氧代-5-苯基-3a,5,6,6a-4H-吡咯[3,4-d]异恶唑-3-甲酸丁酯为黄色油状液体(47.4mg，87％)。

在烧瓶中加入4,6-二氧代-5-苯基-3a,5,6,6a-4H-吡咯[3,4-d]异恶唑-3-甲酸丁酯(63.2mg)和二氯甲烷/乙醇(4:1，v/v，5ml)。然后在-80℃下缓慢滴加硼氢化钠(9.1mg)的乙醇溶液(1ml)。反应温度被严格控制在-80至-70℃。1.5h后，反应完全，反应恢复室温并用饱和氯化铵溶液(5ml)淬灭，并用二氯甲烷萃取(3×10ml)。合并的有机相用饱和食盐水洗涤并用无水硫酸钠干燥。过滤后，收集滤液，除去溶剂，通过柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到产物为黄色固体(61.2mg，96％)。

对得到的物质进行色谱分析：熔点为73～75℃；IR(KBr,cm^-1):3548,3432,2965,2872,1724,1691,1590,1499,1463,1410,1356,1303,1223,1119,997,925,849,791,760,692,643,562；¹HNMR(CDCl₃,500MHz):δ7.44-7.22(m,5H),5.59-5.44(m,1H),5.19(d,J＝9.0Hz,1H),5.06(d,J＝9.5Hz,1H),4.74(d,J＝9.0Hz,1H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),1.78-1.63(m,2H),1.49-1.35(m,2H),0.94(t,J＝7.5Hz,3H)；¹³CNMR(CDCl₃,125MHz):δ167.6,159.3,149.2,135.6,129.3,127.6,124.8,88.7,88.6,66.6,54.3,30.4,19.0,13.7；LC-MS(ESI)m/z319[M+H]⁺；HRMS(ESI)m/z calcd for C₁₆H₁₉N₂O₅[M+H]⁺319.1288,found319.1287；结果如式III所示。

2、AngII诱导的C2C12肌肉萎缩模型与药物处理

C2C12成肌细胞于24孔培养板中培养，2％马血清分化培养基培养4天，诱导C2C12细胞分化成肌管，用2％马血清分化培养基加AngII(0.5μM)与SHU00281(30μM)避光处理细胞48h。48h后，24孔板中细胞用PBS洗两次，4％PFA固定20min，PBS洗3次，0.5％Triton破膜处理15min，5％BSA封闭2h，MF-20抗体(1:100)孵育4℃过夜。第二天，PBS洗3次，Alexa-488鼠二抗(1:100)孵育2h，PBS洗3次，加入DAPI孵育10min，PBS洗3次，荧光显微镜拍照，利用ImageJ软件统计至少100个肌管的平均面积。

结果如图11所示，经AngII处理后，SHU00281组肌管直径分别相对于对照组均增长，证明SHU00281能有效抑制AngII诱导的肌肉萎缩。

表13 SHU00281对肌管的平均面积的影响

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海大学

<120> 一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatctagcac catttgaaat cagtgttctc gagaacactg atttcaaatg gtgctatttt 60

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggacatctaa gggcatcac 19

Claims

1.一种抑制肌肉萎缩的小分子化合物，所述小分子化合物包括异噁唑啉骨架，熔点为73～75℃。

2.根据权利要求1所述小分子化合物，其特征在于，所述小分子化合物包括SHU00281；

所述SHU00281的结构式如式I所示：

3.权利要求1或2所述小分子化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将丙烯酸丁酯、N-苯基马来酰亚胺、三水合硝酸铜、碘化钾和硼酸溶解后，于80℃反应，得4,6-二氧代-5-苯基-3a,5,6,6a-4H-吡咯[3,4-d]异恶唑-3-甲酸丁酯；

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述溶解的溶剂为乙腈/苯甲腈，所述乙腈/苯甲腈中乙腈和苯甲腈的体积比为2:1。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述反应后，还包括氨水淬灭、乙酸乙酯萃取、干燥和纯化。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述二氯甲烷/乙醇中二氯甲烷和乙醇的体积比为4:1。

7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述还原反应后，还包括利用饱和氯化铵溶液淬灭，二氯甲烷萃取、干燥和纯化。

8.权利要求1或2所述小分子化合物在制备肌肉萎缩抑制剂中的应用。

9.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述肌肉萎缩包括AngII诱导的肌肉萎缩。

10.一种肌肉萎缩抑制剂，其特征在于，所述抑制剂以权利要求1或2所述小分子化合物为有效成分。