CN113995758B - 咔唑-嘧啶衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供咔唑‑嘧啶衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，其具有式I所示的结构，该化合物可以有效导致线粒体功能紊乱、DNA损伤和染色体不稳定，从而诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移，并抑制多种肿瘤细胞的生长，在与DNA损伤修复抑制剂联用过程中，有较好的协同作用，在制备抗肿瘤药物上有着广阔的应用空间。

Description

咔唑-嘧啶衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及咔唑-嘧啶衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症是肿瘤是人类面对的重大疾病之一，而其中，癌症的侵袭和转移更是实体瘤患者发生肿瘤扩散和患者预后性差导致病人死亡的主要原因，但是目前抗肿瘤迁移的药物还十分欠缺，存在许多的问题与挑战。因此，具有良好抗肿瘤药物的发现一直是药物学家重要的研究方向，从而开发低毒副作用，高选择性、具有抗肿瘤增殖和迁移的高效抗肿瘤药物。
咔唑骨架是许多生物活性化合物的关键结构基序，包括合成和天然产物。含咔唑的小分子在药物化学中很受欢迎，因为它们表现出各种各样的生物活性。如抗菌、抗真菌、抗肿瘤、抗炎、抗组胺和神经保护活性。近年来，咔唑衍生物的一些结构被报道为小的抗癌分子，如LCY-2-CHO 35，Clausenamine A，玫瑰树碱(ellipticine),Xiamycin A等。这些咔唑衍生物结构的N9位置大多被H或烷基链取代。
线粒体是重要的细胞器，控制着细胞生存和死亡的多种信号通路。越来越多的证据表明，线粒体代谢和功能在肿瘤发生和癌症进展中是必不可少的，使线粒体和线粒体功能成为抗肿瘤治疗的可信靶点。线粒体通过调节ATP的产生和细胞凋亡，在维持细胞稳态中发挥重要作用，是细胞生存的关键调节器。虽然癌细胞通过代谢重编程和线粒体功能障碍实现了高水平的能量生产，但癌细胞中的线粒体仍然具有功能，并在细胞生存中发挥重要作用。因此，线粒体可能被认为是抗癌治疗的靶点。
染色体不稳定性(CIN)是人类癌症的标志，它与预后不良、转移和治疗耐药性有关。CIN是由有丝分裂过程中染色体分离的错误导致的，导致染色体结构和数量异常。尽管CIN在人类癌症中普遍存在，但其在肿瘤进化中的作用是复杂且看似矛盾的。一方面，CIN和复杂的非整倍体与肿瘤衍生细胞系和临床环境中对抗肿瘤药物(例如紫杉醇)的抗性相关，转移性病变和循环肿瘤细胞表现出CIN和染色体拷贝数异质性增加的证据。相反，过量的CIN预示着卵巢癌、直肠癌和乳腺癌对顺铂和5-氟尿嘧啶(5-FU)等细胞毒性疗法的敏感性增强。染色体分离错误会带来许多细胞负担，包括遗传物质的丢失、DNA损伤信号的激活以及蛋白毒性应激，所有这些都会影响生存能力。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种咔唑-嘧啶衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，该衍生物能够有效导致线粒体功能紊乱、DNA损伤和染色体不稳定，从而诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移，并抑制多种肿瘤细胞的生长。
本发明的第二个方面提出了一种包含上述咔唑-嘧啶衍生物的药物组合物。
根据本发明的第一个方面，提出了一种咔唑-嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗抗肿瘤药物中的应用，所述咔唑-嘧啶衍生物具有式I所示的结构，
Figure GDA0004178196930000021
其中，当R2为烷氧羰基时，R1选自卤素、硝基、氰基、C1～C6直链或支链烷基、C1～C6酰基、烷氧基或脂肪族酯基；
当R1为H时，R2选自C4～C6芳基羰基或取代C4～C6芳基羰基。
在本发明的一些实施方式中，所述烷氧羰基包括C1～C6烷氧羰基；所述C1～C6烷氧羰基包括甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、异丙氧羰基、丁氧羰基、叔丁氧羰基、戊氧羰基或辛氧羰基。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述卤素选自F、Cl、Br或I。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述C1～C6直链或支链烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、仲戊基、辛基或异辛基。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述C1～C6酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基或辛酰基。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、戊氧基、辛氧基或苄氧基。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述脂肪族酯基选自甲基酯基、乙基酯基、丙基酯基、异丙基酯基、丁基酯基、异丁基酯基、叔丁基酯基、戊基酯基或辛基酯基。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述取代C4～C6芳基羰基选自卤素、C1～C6烷基、烷氧基、取代磺酸基、硝基、羟基、氨基、巯基、醛基或酯基取代的C4～C6芳基羰基。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述C4～C6芳基羰基中所述C4～C6芳基选自苯环、呋喃环、噻吩环、苯并呋喃环、苯并噻吩环。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述咔唑-嘧啶衍生物选自以下化合物：
Figure GDA0004178196930000031
Figure GDA0004178196930000041
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述肿瘤包括卵巢癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、骨髓瘤、黑色素瘤或肝癌中的至少一种。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述肺癌包括腺癌或非小细胞肺癌。
根据本发明的第二个方面，提出了一种预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包括咔唑-嘧啶衍生物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物、结晶或前药。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括DNA损伤修复抑制剂，所述DNA损伤修复抑制剂包括RAD51抑制剂(B02)、MRE11核酸内切酶抑制剂(PFM01)、ATR激酶抑制剂、ATM抑制剂、CDK的抑制剂中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，可以将上述咔唑-嘧啶衍生物或者其异构体、溶剂合物、结晶或前药与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的“溶剂合物”在常规意义上是指溶质(如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂(如水)组合形成的复合物。溶剂是指本领域的技术人员所知的或容易确定的溶剂。如果是水，则溶剂合物通常被称作水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。
本发明的“结晶”是指本发明所述的化合物形成的各种固体形态，包括晶型、无定形。
本发明的“异构体”包括化合物构型异构体、构象异构体和对映异构体。构型异体是指顺式或反式构型的顺反异构体；构象异构体是指由于单键旋转产生的立体异构体。
本发明的“前药”是指在生物体的生理条件下，由于与酶、胃酸等反应而转化成本发明的化合物，即通过酶的氧化、还原、水解等转化成本发明的化合物和/或通过胃酸等的水解反应等转化成本发明的化合物。
本发明的“药学可接受的盐”是指本发明的化合物与酸形成的药学上可接受的盐，所述的酸包括但不限于磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、柠檬酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、醋酸、乳酸、硝酸等等。
本发明的“药物组合物”是指包含任何一种本文所述的化合物，包括异构体、前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或其化学的保护形式，和一种或多种药学上可接受载体的混合物。
本发明的“药学上可接受的载体”是指对有机体不引起明显刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体，包含溶剂、稀释剂或其它赋形剂、分散剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容。可以作为药学上可接受的载体的一些实例包括，但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、以及纤维素和乙酸纤维素；麦芽、明胶等。
本发明的“赋形剂”指加入到药用组合物中以进一步促进给予化合物的惰性物质。赋形剂可以包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇。
本发明的“在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用”是指可以抑制肿瘤的生长、发展和/或转移，主要向所需要的人或动物给治予治疗有效剂量的本发明的化合物以抑制、减慢或逆转受治疗者肿瘤的生长、迁移或扩散。
本发明的有益效果为：本发明的通式I化合物可以有效导致线粒体功能紊乱、DNA损伤和染色体不稳定，从而诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移，并抑制多种肿瘤细胞的生长，在与DNA损伤修复抑制剂联用过程中，有较好的协同作用，在制备抗肿瘤药物上有着广阔的应用空间。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例3中化合物A-1至化合物A-17对A549细胞的细胞毒作用。
图2为本发明实施例3中化合物B-1至化合物B-14对A549细胞的细胞毒作用。
图3为本发明实施例3中不同浓度化合物B-13对大鼠正常肾细胞NRK-52E细胞的毒性作用。
图4为本发明实施例4中不同浓度化合物B-13对肿瘤细胞的DNA损伤作用。
图5为本发明实施例5中不同浓度化合物B-13对肿瘤细胞的线粒体功能影响。
图6为本发明实施例6中不同化合物引起的癌细胞染色体不稳定结果。
图7为本发明实施例7中化合物B-13对癌细胞迁移CI曲线。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
以下实施例1和实施例2给出化合物A-1和化合物B-1的合成方法，化合物A-2至化合物A-17的合成方法可参考化合物A-1；化合物B-2至化合物B-14的合成方法可参考化合物B-1。
实施例1化合物A-1的合成
本实施例制备了一种化合物A-1，具体过程为：
Figure GDA0004178196930000061
以50mg吲哚置于15mL耐压管中，在冰水环境中，通过14mg强碱氢化钠的脱质子作用，升温至130℃，与41mg 2-氯嘧啶发生亲核取代反应，得到白色固体
Figure GDA0004178196930000062
对甲苯磺酰氯(10g,52.45mmol,1equiv)在丙酮(158mL)和H2O中的溶液(158mL)在0℃下用NaN3(3.41g,52.45mmol,1equiv)仔细处理。3h后，在0℃时，反应混合物在减压下浓缩到其体积的一半。剩余液体用乙醚萃取，Na2SO4干燥，溶剂蒸发，得到中间物TsN3(10.25g,51.20mmol,99％)；
在0℃下加入DBU(3.65g,24.0mmol)到化合物a(20.0mmol)的无水THF(30mL)溶液中。将得到的溶液搅拌5min，然后4-甲基苯磺酰叠氮10(4.33g，将10mL THF中的22.0mmol)加入5min以上。将得到的溶液加热至室温，搅拌4h。蒸发溶剂，得到的残渣用水(100mL)稀释，乙醚(100mL)萃取，在无水Na2SO4上干燥。溶剂蒸发后，粗产物经柱层析纯化(正己烷/乙酸乙酯＝6/1)得到化合物b黄色油状物。
将化合物b(32.1mmol)的40mL MeOH溶液在0℃缓慢加入NaBH4(1.9g,50.0mmol)。将所得溶液加热至室温，搅拌30min，蒸发甲醇，将残渣用水稀释(50mL)，乙酸乙酯萃取(50mL)，用无水Na2SO4烘干。溶剂蒸发后，粗产物经柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)得到中间产物c；
将POCl3(2.8mL,26.6mmol,1.5equiv)溶液加入10mL CH2Cl2中，超过25min，在0℃的100mL CH2Cl2中加入中间产物c(17.7mmol)和Et3N(4.0equiv)溶液。将得到的溶液加热到室温并搅拌4h。溶液用20mL水洗涤，在无水Na2SO4上干燥。粗产物经快速色谱(石油醚/乙酸乙酯＝8/1)纯化，得到氘化化合物d为黄色油；
将新鲜蒸馏的氯化氧磷(1.5equiv)在0℃下滴加到无水DMF中，室温搅拌2h。将得到的Vilsmeier试剂溶液在-10℃的DMF中缓慢加入化合物d(1.0equiv)溶液超过30min，在相同的温度下搅拌4h后，将反应混合物滴加到剧烈搅拌的乙酸乙酯和饱和NaHCO3的双相溶液中，在35℃下搅拌30min。有机层被分离，水层被乙酸乙酯萃取两次。结合的有机相用水、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥。溶剂蒸发后，粗产物用闪速色谱(PE/EA＝4/1)纯化，得到黄色固体化合物e。
将
Figure GDA0004178196930000071
(0.2equiv)和化合物e(0.24equiv)在15mL耐压管中，并加入搅拌子,(Cp*Rh(CH3CN)3)(SbF6)2(8.3mg)和(PhO)2POOH(5.0mg),CHCl3/DMF＝9/1(v/v)(1mL)随后被添加到反应体系中。反应允许在35℃下搅拌，直到完全消耗，用TLC分析监测(通常为20h)。然后用DCM(20mL)稀释反应混合物，用盐水洗涤。再次用DCM萃取水相。有机层被混合，用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥。用合适的溶剂，在二氧化硅上用柱层析法对产物进行纯化，得到产物化合物A-1(产率为95％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.79(d,J＝4.8Hz,2H),8.50(d,J＝8.4Hz,1H),8.22(dd,J＝7.7,1.2Hz,1H),8.08(d,J＝7.6Hz,1H),7.92(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.54–7.47(m,1H),7.40(m,2H),7.16(t,J＝4.8Hz,1H),3.92(q,J＝7.2Hz,2H),1.05(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.8,159.4,157.9,140.7,136.6,128.0,127.3,127.2,124.9,123.4,122.6,121.8,120.3,119.9,117.5,113.8,60.8,13.9.HRMS(ESI-MS):calculated[C19H15N3O2 +H]+:318.1237,found:318.1227.
实施例2化合物B-1的合成
Figure GDA0004178196930000081
化合物B-1结构式
Figure GDA0004178196930000082
将适当的2-溴苯乙酮(20.0mmol)的CH2Cl2(15mL)溶液滴加到三苯基膦(5.25g,20.0mmol)的CH2Cl2(45mL)溶液中，持续10min。在室温下搅拌反应混合物24h，在减压下浓缩得到的磷盐，用Et2O洗涤沉淀。定量得到了磷盐，无需进一步纯化即可使用。
获得的原油磷盐加到水和甲醇的混合物(v/v＝1:1,60毫升),反应混合物搅拌在室温2h,紧随其后的是1.6M氢氧化钠调节pH＝7～8,反应混合物是剧烈的搅拌15h。过滤沉淀物用水清洗，无需进一步净化即可干燥。如果没有沉淀发生，用CH2Cl2(20mL)萃取溶剂。结合的有机层被干燥(Na2SO4)，并在真空中浓缩得到产物g，无需进一步纯化即可使用。
将产物g(6.9mmol)和3-(叔丁基二甲基硅基氧基)丙醛(5.3mmol)的CHCl3(20mL)溶液回流48h，并在减压下浓缩。使用石油醚/乙酸乙酯(100:1)提供的透明液体化合物h通过硅胶柱层析纯化，收率为40％～86％(以及少量的顺式异构体)。
在0℃的20mL超干乙腈溶液中加入DBU溶液(5.18mmol)和5mL超干乙腈溶液，在15min内将酮化合物h(3.45mmol)和对甲苯磺酰肼(3.79mmol)加入溶液。将反应混合物慢慢加热到室温。烯酮完全消耗后(～2h)，用冰水淬灭反应混合物，用正己烷萃取(100mL)。收集的有机萃取物用水、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥。溶剂蒸发得到了一种高度不稳定的乙烯基重氮酮化合物i，它被立即用于下一步。在0℃的化合物i的THF(20mL)搅拌溶液中滴加TBAF(3.8mmol)的THF(10mL)。原料完全消耗后(～2h)，用冰水淬灭反应，用乙酸乙酯(100mL)萃取。有机相用水、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥。溶剂蒸发，用闪蒸柱层析(石油醚/乙酸乙酯16/1)纯化，得到不稳定重氮醇化合物j作为黄色液体，立即用于下一步。
在无水DMSO中，在惰性气氛下加入IBX(2-碘酰苯甲酸，1.2equiv)。将反应混合物搅拌1～3h(TLC监测)，用乙酸乙酯稀释。用饱和NaHCO3溶液洗涤。水相用乙酸乙酯反萃取，结合的有机相用水、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥。蒸发溶剂，在硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯6/1)上纯化粗烯醛重氮酮化合物k。
以50mg吲哚置于15mL耐压管中，在冰水环境中，通过14mg强碱氢化钠的脱质子作用，升温至130℃，与41mg 2-氯嘧啶发生亲核取代反应，得到白色固体
Figure GDA0004178196930000091
将
Figure GDA0004178196930000092
(0.2equiv)和化合物k(0.24equiv)在15mL耐压管中，并加入搅拌子,(Cp*Rh(CH3CN)3)(SbF6)2(8.3mg)和(PhO)2POOH(5.0mg),CHCl3/DMF＝9/1(v/v)(1mL)随后被添加到反应体系中。反应允许在35℃下搅拌，直到完全消耗，用TLC分析监测(通常为20h)。然后用DCM(20mL)稀释反应混合物，用盐水洗涤。再次用DCM萃取水相。有机层被混合，用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥。用合适的溶剂，在二氧化硅上用柱层析法对产物进行纯化，得到产物化合物B-1(产率为95％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(d,J＝4.8Hz,2H),8.41(d,J＝8.3Hz,1H),8.21(d,J＝7.0Hz,1H),8.10(d,J＝7.6Hz,1H),7.64–7.54(m,1H),7.54–7.43(m,2H),7.42–7.34(m,3H),6.95(t,J＝4.8Hz,1H),6.88(dd,J＝13.2,7.9Hz,2H),3.64(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ194.0,158.7,158.5,157.8,140.5,136.6,133.1,131.9,128.5,128.4,127.5,127.1,126.8,124.9,122.9,122.4,121.6,120.0,119.8,117.2,113.9,111.8,55.7.HRMS(ESI-MS):calculated
[C24H17N3O2 +H]+:380.1394,found:380.1383.
实施例3
本实施例测试了化合物安全性和对不同癌细胞的毒性作用，具体过程为：
MTT实验方法：
1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104个/mL。
2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100uL，这样待测细胞的密度为5000个孔(边缘孔用无菌PBS填充)。
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物。
4.在5％CO2，37℃下孵育48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
5.每孔加入10uLMTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。
6.终止培养，用100uLDMSO溶解结晶，测定其吸光度值(OD值)
通过MTT实验对化合物对不同癌细胞的活力影响进行测试，检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
不同化合物对A549细胞的细胞毒作用结果如图1和图2所示，从图1和图2可看出，通式I化合物中，当R2为脂肪族酯基时，所形成的化合物A-1至化合物A-17系列对A549细胞几乎没有细胞毒作用，细胞活力均大于50％，当R2为羰基芳基时，所形成的化合物B-13和B-14系列对A549细胞的毒性作用较强，细胞活力远小于50％。
筛选前述通式I化合物中对A549细胞的细胞毒作用较强的化合物B-13进行生物安全性测试，采用前述MTT实验测试不同浓度化合物B-13对大鼠正常肾细胞NRK-52E细胞的毒性作用，结果如图3所示。从图3可看出，当化合物B-13加入浓度为50μM时，对大鼠的正常肾细胞的抑制率也小于50％。
实施例4
本实施例测试了化合物对癌细胞DNA损伤的作用，具体过程为：
Western blot实验方法：
细胞培养：细胞记数，接种，培养在六孔板中，长至70％～80％后，加入化合物进行培养48h，取出，裂解，细胞被收集后，加入50μL细胞裂解液，提取上清总蛋白液。使用BCA法(蛋白质定量)检测总蛋白浓度，后变性蛋白样品，取相同质量的蛋白上样，SDS-PAGE胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离蛋白条带。根据目标蛋白计算分子量，将相应位置的电泳胶条带切下，湿转法将蛋白条带转到PVDF膜上。
配置TBST缓冲液：25mM NaCl，100mM Tris,0.2％吐温-20,pH 7.4，用TBST缓冲液溶解的5％脱脂奶粉溶液(w/v)封闭PVDF膜。分别相应用一抗和二抗孵育PVDF膜，TBST缓冲液漂洗适当次数后，使用SuperECL Plus超敏发光试剂盒显色成像。
测试对照组(加入与化合物相同体积的DMSO)与不同浓度化合物B-13对肿瘤细胞的DNA损伤作用，结果如图4所示，从图4可看出，γ-H2AX是DNA损伤的标志物；P-ATR和P-ATM是激活DNA损伤修复的重要蛋白、P-chk1是DNA损伤修复的检查点。相对于对照组，化合物B-13处理的肿瘤细胞中DNA损伤相关蛋白表达量出现变化，DNA损伤修复通路相关蛋白的表达出现变化。可知，化合物B-13能够诱导肿瘤细胞DNA损伤和同源重组修复抑制，引起肿瘤细胞的死亡。
实施例5
本实施例测试了化合物对癌细胞线粒体的影响，具体过程为：
细胞荧光成像实验方法：
1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至(5～10)×104个/mL；
2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入2mL；
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(6孔平底板)，加入一定浓度的药物；
4.在5％CO2，37℃下孵育48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果；
5.加入线粒体染料JC-1，37度孵育30min；
6.拍照：用激光共聚焦显微镜拍摄视野。
对照组(加入与化合物相同体积的DMSO)和不同浓度化合物B-13处理后，用JC-1的线粒体膜电位染料和hochest活细胞细胞核染料进行染色，结果如图5所示，蓝色信号代表细胞核DNA信号；红色荧光代表线粒体膜电位正常、染色信号是聚集化，正常状态红色荧光和绿色荧光叠加为橙色荧光；绿色荧光代表线粒体膜电位去极化，染色信号是单极化。可见，化合物B-13能通过诱导肿瘤细胞线粒体膜电位发生变化，影响线粒体的功能，从而抑制癌细胞的正常生长和增殖。
实施例6化合物对癌细胞染色体的影响
细胞荧光激光共聚焦显微镜实验方法(专用的dish或玻璃板底部的96孔板)
1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至2×104个/mL；
2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100uL，这样待测细胞的密度为2000个孔(边缘孔用无菌PBS填充)。
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入一定浓度的药物。
4.在5％CO2，37℃下孵育48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果；
5.固定细胞：倒掉培养基，100μL 4％多聚甲醛/孔，室温放置30min。
6.透化细胞：倒掉PBS，加PBST，50μL/孔；150μL 0.5％ Triton X-100(用剩的要回收)加30mL PBS到加样槽，50μL/孔；37℃，20min；用PBS洗3次，一次100μL/孔
7.封闭：在37℃，5％ BSA中孵育，30min；5％ BSA＝20mL PBS+1g BSA
8.抗体孵育(WB的10～20倍浓度)
(1)孵一抗
20～30μL/孔，4℃，过夜
(2)从4℃冰箱取出，一抗回收，用PBS洗
100μL/孔，洗4次
(3)孵二抗，37℃，1h
二抗的初始浓度为1mg/mL，里面加有叠氮化钠来防菌，使用说明书上的推荐浓度是0.5～2μg/mL，本试验例使用的浓度是2μg/mL，即500μL 1％ BSA+1μL二抗
(4)用PBS洗，100μL/孔，洗4次；
9.染色：50μL DAPI/孔0.5μg/mL；37℃，避光存放，15min；
10.拍照：用激光共聚焦显微镜拍摄视野。
对照组(加入与化合物相同体积的DMSO)和浓度均为1μM的化合物B-13、化合物B-14引起的癌细胞染色体不稳定结果如图6所示。从图6可看出，蓝色是细胞核的信号，绿色是γ-微管蛋白的信号，相对于对照组，化合物B-13、化合物B-14均能通过诱导肿瘤细胞染色体不稳定，从而导致癌细胞在增殖分裂的过程不能正常进行，进而抑制癌细胞的正常生长和增殖。
实施例7
本实施例测试了化合物对癌细胞迁移的影响，具体过程为：
RT-CA实验：
CIM-Plate装配
在下室的孔中用多道或单道移液器加入165uL培养基
将夹具连同下室沿逆时针旋转90度，将上室中传感器一面置于下室上，注意使上室和下室的孔对齐。听到卡扣卡入的声音。
在上室中加入30uL无血清培养基，轻拍板四周，使培养基分布均匀。
平衡检测板：
将检测板置于37℃，CO2浓度为5％的CO2培养箱平衡1h。
基线测量：
将平衡1h的检测板置于RTCA DP监测台上，开始step 1进行基线检测。
细胞悬液准备细胞接种：向CIM-Plate上室加入100μL不同浓度细胞悬液，使最终孔中细胞数量为40000个/每孔。
向每孔加入浓度梯度10.75μM、5.38μM、2.69μM、1.35μM、0.68μM、0.34μM、0.1％DMSO、0μM的实施例的化合物B-13，上室和下室平行加入化合物。具体操作请参考RT-CA仪器使用的参考程序。
室温静置检测板：室温静置30min待细胞沉降。
开始实验：待细胞沉降后将CIM-Plate放回RTCA DP检测台，在系统自动扫描“ScanPlate”后，进行细胞迁移的实时动态检测(每15min检测一次，持续18h)
停止实验：细胞迁移达到18h后停止实验；分析细胞迁移CI曲线。
10.75μM、5.38μM、2.69μM、1.35μM、0.68μM、0.34μM、0.1％DMSO、0μM的实施例的化合物B-13对癌细胞迁移CI曲线如图7所示，从图7可看出，化合物B-13在2.69μM以上浓度时，能有效地抑制细胞的迁移。
综上，本发明的化合物能引起癌细胞DNA损伤，促进肿瘤细胞染色体不稳定，抑制肿瘤细胞包括肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌细胞株，且当式I化合物的R1为H，R2为芳基羰基或者取代芳基羰基时，所形成的化合物B-13和B-14系列化合物对肿瘤显示出更好的抑制活性。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (2)

1.一种咔唑-嘧啶衍生物在制备治疗肺癌药物中的应用，所述咔唑-嘧啶衍生物选自以下化合物中的一种：
Figure QLYQS_1
、
Figure QLYQS_2
。
2.一种治疗肺癌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括咔唑-嘧啶衍生物或其药学可接受的盐，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；所述咔唑-嘧啶衍生物选自以下化合物中的一种：
Figure QLYQS_3
、
Figure QLYQS_4
。
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