CN114409636A

CN114409636A - 一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用

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Publication number: CN114409636A
Application number: CN202210218923.9A
Authority: CN
Inventors: 陈国良; 王立辉; 石雅洁; 吴春福; 杨静玉; 张秋樾; 孙健文; 张茂营; 刘森; 陈永松; 陈露
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-03-08
Also published as: CN114409636B

Abstract

本发明提供了一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用，涉及医药技术领域。本发明提供了一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，所述喹唑啉酮化合物具有式I所示的结构。本发明提供的喹唑啉酮化合物同时含有G9a和EZH2双靶点药效团，对肿瘤细胞生长抑制作用强，能够显著降低肿瘤细胞中EZH2/EHMT2底物蛋白水平，在制备治疗G9a和/或EZH2介导的疾病，尤其是肿瘤中具有很有的应用前景。

Description

一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用。

背景技术

表观遗传学，最初于1942年由Conrad Waddington提出(International Journalof Epidemiology,2012,41(1):10-13)，用来表述DNA序列不变的情况下，对基因表达可遗传变化的研究。对于表观遗传修饰的研究主要包括DNA甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA调控等。在过去的几十年中，已发现主要由异常的DNA甲基化状态，异常的组蛋白修饰和染色质结构代表的表观遗传在多种疾病，特别是在肿瘤发生，肿瘤侵袭和转移，免疫逃逸和耐药性中起着关键作用。因此，在开发用于治疗包括癌症在内的疾病的药物中，靶向表观遗传已成为有吸引力的治疗策略。

G9a又称常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基化酶2(Euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2，EHMT2)或KMT1C，是含有SET结构域的SUV39H蛋白家族之一，是一种重要的常染色质组蛋白甲基化酶。G9a能够使H3K9发生单甲基化、二甲基化及缓慢的三甲基化，也可以特异性地催化一些非组蛋白的甲基化，如催化p53蛋白Lys373二甲基化从而使其丧失转录活性。G9a介导的H3K9甲基化通常用作表观遗传基因沉默标记，G9a活性的异常上调诱导抑癌基因沉默，促进癌症的发生发展。

Zeste基因增强子同源物2(Enhancer of zeste homologue 2，EZH2/KMT6A)是转录抑制因子PcG(Polycomb group))蛋白家族的一员，与EED、SUZ12、组蛋白结合蛋白RbAp46和PHFI共同构成PRC2(Polycomb repressive complex 2)复合物，能够催化H3K9、27位赖氨酸单、双和三甲基化，从而抑制转录，沉默靶基因，抑制抑癌系统，进而促进细胞增殖。

最近有证据表明，G9a和EZH2(通过PRC2复合物)相互作用，并共享表观遗传沉默的靶点。Chiara.M等在2014年报道了这一现象，PRC2复合物和G9a/GLP在全基因组相互作用并协同定位，调控编码发育调节因子的共同基因，同时G9a/GLP在基因组位点控制PRC2募集和H3K27me3，PRC2对其部分靶基因的募集依赖于G9a的活性(Mozzetta C,Pontis J,FritschL,et al.The Histone H3 Lysine 9 Methyltransferases G9a and GLP RegulatePolycomb Repressive Complex 2-Mediated Gene Silencing[J].Molecular Cell,2014,53(2):277-289.)。同时也有文献提出EZH2和G9a可以相互结合从而影响组蛋白甲基化水平([1]Coward,William,R,et al.Interplay between EZH2 and G9a Regulates CXCL10Gene Repression in Idiopathic Pulmonary Fibrosis[J].American Journal ofRespiratory Cell and Molecular Biology,2018,58(4):449-460.)提示了EZH2和G9a功能上的协同作用。

沉默EZH2或给予EZH2抑制剂可以敏化肿瘤细胞对依托泊苷和顺铂等化疗药物的抗肿瘤作用，这说明EZH2与肿瘤耐药也密切相关。与EZH2相似，G9a也被发现在多种恶性肿瘤组织中表达增高，且与肿瘤的恶性程度密切相关。G9a可以通过调控STAT3通路参与肿瘤干细胞形成，也可以影响氨基酸代谢从而参与肿瘤细胞增殖，同时还可以通过促进IL-8/CXCR1/2的分泌介导吉西他滨耐药。

EZH2和G9a在结构上具有同源性，都含有甲基催化活性的SET结构域，赖氨酸底物的结合区域以及辅因子结合的区域，同时可以相互结合影响组蛋白甲基化水平并协同促进肺癌耐药。因此，设计EZH2和G9a双靶抑制剂或许是一个新的抗肿瘤药物方向。例如，CurryE等于2015年报道了一系列喹唑啉类BIX-01294衍生化合物作为对于EZH2和G9a均有活性的双靶抑制剂(Edward,Curry,Ian,et al.Dual EZH2 and EHMT2 histonemethyltransferase inhibition increases biological efficacy in breast cancercells.Curry E et al.Clinical Epigenetics,2015,7:84)，证实了双靶药物的可行性，但其化合物结构基于G9a抑制剂BIX-01294，其化合物结构中未引入EZH2药效基团。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用，本发明提供的喹唑啉酮化合物含有G9a和EZH2双靶点药效团，对肿瘤细胞生长抑制作用强，能够显著降低肿瘤细胞中EZH2/EHMT2底物蛋白水平。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，所述喹唑啉酮化合物具有式I所示的结构：

所述式I中，M和Z独立地包括-O-、-S-或-NH-；

X和Y独立地包括-CH-或-N-；

n为0～5的整数；

R₁和R₂独立地包括氢、卤素、烷基、烷氧基、羟基、氨基或巯基；

R₃包括氢、卤素、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烷氧基、氨基、未取代或取代的脂肪胺基、未取代或取代的苯胺、未取代或取代的萘胺、未取代或取代的脂肪胺基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的杂芳基；

R₄包括氢、卤素、烷基或烷氧基；

R₅包括氢、氨基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的烷基胺基、未取代或取代的环亚胺基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的杂芳基。

优选的，所述取代的烷基、取代的烷氧基、取代的脂肪胺基、取代的苯胺、取代的萘胺、取代的脂肪胺基、取代的杂环基、取代的杂芳基、取代的环烷基、取代的烷基胺基、取代的环亚胺基和取代的芳基中的取代基独立的包括卤素、-OH、-NO₂、-CN、-OR、-SR、-N(R)₂、-C(O)R、-CO₂R、-C(O)C(O)R、-C(O)CH₂C(O)R、-S(O)R、-S(O)₂R、-C(O)N(R)₂、-SO₂N(R)₂、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)N(R)₂、烷基、环烷基、芳香基、杂环基或杂芳基，其中R包括烷基。

优选的，所述杂环基独立地包括5～10元杂环基；

所述杂芳基独立地包括5～10元杂芳基；

所述杂环基和杂芳基中的杂原子独立地包括N、O和S中的一种或几种，所述杂原子的个数独立地优选为1～3个；

所述环烷基包括3～7元环烷基。

优选的，所述喹唑啉酮化合物具有式I-1～I-17所示结构中的任意一种：

优选的，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、高氯酸盐、氨基磺酸盐、脂肪羧酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、扑酸盐、烷基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、萘磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、丙酮酸盐、谷氨酸盐、抗坏血酸盐或硫辛酸盐。

本发明提供了上述技术方案所述喹唑啉酮化合物的制备方法，包括以下步骤：

将化合物II、氯代试剂和有机胺混合进行氯代反应，得到化合物III；所述化合物II包括化合物II-1或化合物II-2；

将所述化合物III、化合物IV和碱性试剂混合进行氨解反应，得到化合物V；

将所述化合物V、R₃H和磺酸类化合物混合进行取代反应，得到具有式I所示结构的喹唑啉酮化合物；所述R₃H中R₃与所述式I中R₃相同；

所述化合物II-1、化合物II-2、化合物III、化合物IV和化合物IV中的n、X、Y、Z、M、R₁～R₅与所述式I相同。

优选的，所述化合物II-1的制备方法，包括：

当n＝0，R₅＝H、X＝N且Y＝N时，所述化合物II-1的制备方法包括以下步骤：

将化合物1和尿素混合进行环合反应，得到化合物II-1；

所述化合物1中，M、Y和R₄与所述式I相同；

当n＝1～5、X＝N且Y＝N时，所述化合物II-1的制备方法包括以下步骤：

将化合物2、甲醇和氯化亚砜混合进行酯化反应，得到化合物3；

将所述化合物3、Cl-(CH₂)_n-CH₂Br和碱性试剂混合进行取代反应，得到化合物4；所述Cl-(CH₂)_n-CH₂Br中n与所述式I中n相同；

将所述化合物4、硝化试剂、有机酸和有机酸酐混合，进行硝化反应，得到化合物5；

所述化合物5、R₅H、卤代盐和碱性试剂混合，进行取代反应，得到化合物6；所述R₅H中R₅与所述式I中R₅相同；

将所述化合物6、还原性金属和无机酸混合，进行还原反应，得到化合物7；

将所述化合物7、氰酸盐和有机酸混合，进行环合反应，得到化合物II-1。

本发明还提供了上述技术方案所述的喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐或上述技术方案所述制备方法制备的喹唑啉酮化合物在制备治疗G9a和/或EZH2介导的疾病中的应用。

优选的，所述G9a和/或EZH2介导的疾病包括恶性肿瘤。

优选的，所述恶性肿瘤包括肺癌、肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、淋巴瘤和白血病中的一种或几种。

本发明提供了一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，所述喹唑啉酮化合物具有式I所示的结构；所述式I中，M和Z独立地包括-O-、-S-或-NH-；X和Y独立地包括-CH-或-N-；n为0～5的整数；R₁和R₂独立地包括氢、卤素、烷基、烷氧基、羟基、氨基或巯基；R₃包括氢、卤素、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烷氧基、氨基、未取代或取代的脂肪胺基、未取代或取代的苯胺、未取代或取代的萘胺、未取代或取代的脂肪胺基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的杂芳基；R₄包括氢、卤素、烷基或烷氧基；R₅包括氢、氨基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的烷基胺基、未取代或取代的环亚胺基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的杂芳基。本发明提供的喹唑啉酮化合物同时含有G9a抑制剂的关键喹唑啉母核和EZH2抑制剂的吡啶酮药效团，对肿瘤细胞生长抑制作用强，能够显著降低肿瘤细胞中EZH2/EHMT2底物蛋白水平，在制备治疗G9a和/或EZH2介导的疾病，尤其是在恶性肿瘤的治疗中具有很有的应用前景。

本发明提供了上述技术方案所述喹唑啉酮化合物的制备方法。本发明提供的制备方法，操作简单，产率高，生产成本低，适宜工业化生产。

附图说明

图1为喹唑啉酮化合物结构式图；

图2为ST1～ST5和SU01～SU12的活性筛选结果图；

图3为使用化合物SU08、UNC0638和GSK126分别处理H1299/CDDP、A549/PTX、PC9/ER、SW982和RD后的细胞存活情况图；

图4为给予SU08后，H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER对不同药物的的敏感性变化图；

图5为SU08与顺铂、紫杉醇或厄洛替尼合用后抑制耐药细胞的生长情况图；

图6为化合物SU08、UNC0638和GSK126分别对A549和A549/紫杉醇细胞H3K27me3和H3K9me2蛋白表达水平的影响图；

图7为SU08对EZH2和G9a的双靶向性结果图；

图8为SU08对3种NSCLC耐药细胞H460/顺铂、A549/紫杉醇和PC9/厄洛替尼迁移能力影响的荧光显微镜图和细胞相对迁移率结果图；

图9为SU08对3种NSCLC耐药细胞H460/CDDP、A549/PTX、PC9/ER成球能力的影响图；

图10为SU08对横纹肌肉瘤细胞克隆形成能力的影响图；

图11为药物对非小细胞肺癌细胞异位移植瘤生长的抑制作用图；

图12为药物对荷瘤裸鼠体重和脏器指数的影响图；

图13为药物对横纹肌肉瘤细胞异位移植瘤生长的抑制作用图；

图14为药物对横纹肌肉瘤细胞荷瘤裸鼠体重和脏器指数的影响图。

具体实施方式

本发明提供了一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，所述喹唑啉酮化合物具有式I所示的结构(如图1所示)：

在本发明中，所述式I中，M和Z独立地包括-O-、-S-或-NH-。

在本发明中，所述式I中，X和Y独立地包括-CH-或-N-。

在本发明中，所述式I中，n为0～5的整数，具体为0、1、2、3、4或5。

在本发明中，所述R₁和R₂独立地包括氢、卤素、烷基、烷氧基、羟基、氨基或巯基。在本发明中，所述卤素优选包括氟、氯或溴。在本发明中，所述烷基优选包括C₁～C₆烷基，更优选包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丁基、异丙基、异戊基或叔丁基。在本发明中，所述烷氧基中的烷基优选包括C₁～C₆烷基、5～10元环烷基或未取代或取代的芳香烷基，更优选包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、环戊氧基、环己氧基、苯氧基或苄氧基。

在本发明中，所述R₃包括氢、卤素、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烷氧基、氨基、未取代或取代的脂肪胺基、未取代或取代的苯胺、未取代或取代的萘胺、未取代或取代的脂肪胺基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的杂芳基。在本发明中，所述卤素优选包括氟、氯或溴。在本发明中，所述取代的烷基、取代的烷氧基、取代的脂肪胺基、取代的苯胺、取代的萘胺、取代的脂肪胺基、取代的杂环基和代的杂芳基中的取代基独立地优选包括卤素、-OH、-NO₂、-CN、-OR、-SR、-N(R)₂、-C(O)R、-CO₂R、-C(O)C(O)R、-C(O)CH₂C(O)R、-S(O)R、-S(O)₂R、-C(O)N(R)₂、-SO₂N(R)₂、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)N(R)₂、C₁～C₆烷基、环烷基、芳香基、杂环基或杂芳基，其中R独立地包括C₁～C₆烷基；本发明对于所述取代基的取代位置没有特殊限定，任意取代位置均可。在本发明中，所述环烷基优选包括3～7元环烷基。在本发明中，所述杂环基优选包括5～10元杂环基。在本发明中，所述杂芳基优选包括5～10元杂环基。在本发明中，所述杂环基和杂环基中的杂原子包括N、O和S中的一种或几种，更优选包括N、O或S，所述杂原子的个数优选为1～3，更优选为1、2或3。在本发明中，所述卤素和C₁～C₆烷基优选与前述卤素和C₁～C₆烷基相同，在此不再赘述。在本发明中，所述杂环基优选包括吡啶环基、噻吩环基、嘧啶环基、吲哚环基、喹啉环基、异喹啉环基、吡咯环基、吡唑环基、吗啉基或哌嗪基。在本发明中，所述杂芳基优选包括苯并咪唑环基、苯并吡咯环基或苯并吡唑环基。在本发明中，所述未取代或取代的烷基中的烷基优选包括C₁～C₇烷基，更优选包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、戊基、异丁基、异丙基、叔丁基、异戊基、己基、庚基。在本发明中，所述未取代或取代的烷氧基中的烷氧基优选包括C₁～C₇烷氧基，更优选包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、环戊氧基、环己氧基、苯氧基或苄氧基。在本发明中，所述未取代或取代的脂肪胺基中的脂肪胺基优选包括C₁～C₇脂肪胺基或C₃～C₇环脂肪亚胺基，所述C₁～C₇脂肪胺基优选包括甲胺基、乙胺基、丙氨基、异丙胺基、环己胺基或哌啶-4-氨基；所述C₃～C₇环脂肪亚胺基优选包括四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、N-甲基哌嗪基、N-甲基高哌嗪基、吗啉基、六亚甲基亚胺基或4,4-二氟哌啶基。在本发明中，所述R₃优选包括甲胺基、二甲胺基、乙胺基、2-羟基丙胺基、二乙胺基、二乙醇胺基、苯乙胺基、四氢吡咯基、哌啶基、环己胺基、吗啉基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、N-乙基哌嗪基或N-羟乙基哌嗪基。

在本发明中，所述式I中，R₄包括氢、卤素、烷基或烷氧基。在本发明中，所述卤素优选包括氟、氯或溴。在本发明中，所述烷基优选包括C₁～C₆烷基。在本发明中，所述烷氧基优选包括C₁～C₇烷氧基。在本发明中，所述R₄优选包括氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丁基、异丙基、叔丁基、异戊基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、环戊氧基、环己氧基、苯氧基或苄氧基。

在本发明中，所述式I中，R₅包括氢、氨基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的烷基胺基、未取代或取代的环亚胺基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的杂芳基。在本发明中，所述取代的环烷基、取代的烷基胺基、取代的环亚胺基、取代的芳基、取代的杂环基、取代的杂芳基中的取代基优选与前述R₃中的取代基相同，更优选包括-F、-Cl、-Br、-OH、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂或C₁～C₆烷基。在本发明中，所述C₁～C₆烷基、所述未取代或取代的环烷基中的环烷基、未取代或取代的杂环基中的杂环基和未取代或取代的杂芳基中的杂芳基与前述C₁～C₆烷基、环烷基、杂环基和杂芳基相同，在此不再赘述。在本发明中，所述R₅优选包括甲胺基、二甲胺基、乙胺基、2-羟基丙胺基、二乙胺基、二乙醇胺基、苯乙胺基、四氢吡咯基、哌啶基、环己胺基、吗啉基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、N-乙基哌嗪基、N-羟乙基哌嗪基、苯基、萘基、吡啶环基、噻吩环基、嘧啶环基、吲哚环基、喹啉环基、异喹啉环基、吡咯环基、吡唑环基、苯并咪唑基、苯并吡咯环基或苯并吡唑环基。

在本发明中，所述喹唑啉酮化合物优选包括具有式I-1～I-17所示结构中的任意一种：

所述喹唑啉酮化合物的命名依次为：3-({[6,7-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)喹唑啉-4-基]氨基}甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-1)、3-{[(6,7-二甲氧基-2-吗啉代喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-2)、3-{[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-3)、3-({[6,7-二甲氧基-2-(4-甲基-1,4-二氮杂-1-基)喹唑啉-4-基]氨基}甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-4)、3-{[(2-{[3-(二甲基氨基)丙基][甲基]氨基}-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-5)、3-{[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基][甲基]氨基}-6-甲氧基-7-{3-[吡咯烷-1-基]丙氧基}喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-6)、3-[({6-甲氧基-2-[4-甲基-1,4-二氮杂-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-7)、3-[({6-甲氧基-2-[哌啶-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-8)、3-[({6-甲氧基-2-[4-甲基哌嗪-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-9)、3-[({[2-(4-乙基哌嗪-1-基)-6]甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶2(1H)-酮(I-10)、3-[({6-甲氧基-2-[4-甲氧基哌啶-1-基]-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶2(1H)-酮(I-11)、3-[({[2-(氮杂-1-基)-6]甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-12)、3-[({2-[4,4-二氟哌啶-1-基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4，6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-13)、3-[({2-[二乙氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷基-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-14)、3-[({2-[二甲基氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷基-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-15)、3-[({6-甲氧基-2-吗啉代-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-16)、3-[({6-甲氧基-2-[吡咯烷-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-17)。

在本发明中，所述药学上可接受的盐优选包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、高氯酸盐、氨基磺酸盐、脂肪羧酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、扑酸盐、烷基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、萘磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、丙酮酸盐、谷氨酸盐、抗坏血酸盐或硫辛酸盐。在本发明中，所述脂肪羧酸盐优选包括C₁～C₆脂肪羧酸盐，更优选包括甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、异丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐、异戊酸盐、新戊酸盐、己酸盐或4-甲基戊酸盐。在本发明中，所述烷基磺酸盐优选包括C₁～C₆烷基磺酸盐，更优选包括甲基磺酸盐或乙基磺酸盐。在本发明中，所述喹唑啉酮化合物的成盐基团优选为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、水杨酸盐或枸橼酸盐。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明将化合物II、氯代试剂和有机胺混合进行氯代反应，得到化合物III；所述化合物II包括化合物II-1或化合物II-2。

在本发明中，(i)当n＝0，R₅＝H，X＝N且Y＝N时，或，(ii)n＝1～5，X＝N且Y＝N时，采用化合物II-1为原料制备具有式I所示结构的喹唑啉酮化合物；当式I中n、R₅、X和Y为除(i)和(ii)的其他情况时，采用化合物II-2为原料制备具有式I所示结构的喹唑啉酮化合物。

在本发明中，当n＝0，R₅＝H、X＝N且Y＝N时，所述化合物II-1的制备方法优选包括以下步骤：将化合物1和尿素混合进行环合反应，得到化合物II-1；

所述化合物1中，M、Y和R₄与所述式I相同。

在本发明中，所述化合物1和尿素的摩尔比优选为1：5～20，更优选为1：10～15。在本发明中，所述环合反应的温度优选为140～200℃，更优选为150～180℃；所述环合反应的时间优选为5～15h，更优选为10～12h。所述环合反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述环合反应得到的反应液冷却后与水混合，调节pH值至酸性，保温混合，降温析晶，固液分离，将所得固体产物进行干燥，得到化合物II-1。在本发明中，所述冷却后的温度优选为90～110℃，更优选为100℃；本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可，具体如自然冷却。在本发明中，所述调节pH值采用的酸优选包括冰醋酸；所述酸性的pH值优选为4～6，更优选为5；本发明对于所述酸的用量没有特殊限定，能够将pH值调节至4～6即可。在本发明中，所述保温混合的时间优选为20～40min，更优选为30min。本发明对于所述降温析晶的降温速率没有特殊限定，置于室温环境中自然降温即可；本发明对于所述降温析晶的时间没有特殊限定，降温析晶至晶体不再增加即可。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。在本发明中，所述干燥的温度优选为10～40℃，更优选为20～30℃，本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可。

当n＝1～5、X＝N且Y＝N时，所述化合物II-1的制备方法优选包括以下步骤：

将所述化合物5、R₅H、卤代盐和碱性试剂混合，进行取代反应，得到化合物6；所述R₅H中R₅与所述式I中R₅相同；

本发明将化合物2、甲醇和氯化亚砜混合进行酯化反应，得到化合物3。在本发明中，所述化合物2和氯化亚砜的摩尔比优选为1：1～1.3，更优选为1:1～1.2。在本发明中，所述化合物2与甲醇的摩尔比优选为1：10～30，更优选为1：20～25。在本发明中，所述混合优选为将化合物2与甲醇混合，冷却至0℃后滴加氯化亚砜混合。在本发明中，所述冷却优选为冰浴冷却。本发明对于所述氯化亚砜的滴加速度没有特殊限定，能够将反应体系的温度控制在10℃以下即可。在本发明中，所述酯化反应的温度优选为0～100℃，更优选为20～65℃；所述酯化反应的时间优选为0.5～10h，更优选为5～7h。所述酯化反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述酯化反应得到的反应液浓缩，将所得浓缩物溶解于与水不互溶溶剂中，饱和碳酸氢钠溶液洗涤、饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，得到化合物3。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏，所述浓缩的目的是除去剩余的甲醇和氯化亚砜。本发明中，所述与水不互溶溶剂优选包括氯代烷烃，更优选包括二氯甲烷(DCM)，本发明对于所述与水不互溶溶剂的用量没有特殊限定，能够将浓缩物溶解即可。在本发明中，所述饱和碳酸氢钠溶液洗涤的次数优选为1～4次，更优选为2～3次。在本发明中，所述饱和氯化钠溶液洗涤的次数优选为1次。本发明对于所述干燥的方式和条件没有特殊限定，干燥至恒重即可。在本发明的具体实施例中，所述干燥优选包括无水硫酸钠干燥后抽滤，将所得滤液蒸干，得到化合物3。

得到化合物3后，本发明将所述化合物3、Cl-(CH₂)_n-CH₂Br和碱性试剂混合进行取代反应，得到化合物4；所述Cl-(CH₂)_n-CH₂Br中n与所述式I中n相同。在本发明中，所述化合物3与Cl-(CH₂)_n-CH₂Br的摩尔比优选为优选为1：1.1～1.5，更优选为1:1.5。在本发明中，所述碱性试剂优选包括碳酸盐，更优选包括碳酸钾和/或碳酸钠；所述所述化合物3与碱性试剂的摩尔比优选为优选为1：2～5，更优选为1:3～4。在本发明中，所述取代反应优选在溶剂存在条件下进行，所述溶剂优选包括腈类溶剂，更优选包括乙腈；本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够保证取代反应顺利进行即可。在本发明中，所述取代反应的温度优选为20～80℃，更优选为40～50℃；所述取代反应的时间优选为10～40h，更优选为20～30h。所述取代反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述取代反应得到的反应液固液分离，将所得液体产物浓缩，将所得浓缩物溶解于与水不互溶溶剂中，水洗，干燥后重结晶，得到化合物4。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如抽滤。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。本发明中，所述与水不互溶溶剂优选包括二氯甲烷(DCM)，本发明对于所述与水不互溶溶剂的用量没有特殊限定，能够将浓缩物溶解即可。在本发明中，所述水洗次数优选为1～4次，更优选为2～3次。本发明对于所述干燥的方式和条件没有特殊限定，干燥至恒重即可；在本发明的具体实施例中，所述干燥优选包括无水硫酸钠干燥后抽滤，将所得滤液蒸干，得到干燥产物。在本发明中，所述重结晶用溶剂优选包括丙酮；所述干燥产物的质量与重结晶用溶剂的体积之比优选为1g：2～5mL，更优选为1g：3～4mL；所述重结晶得到的液体组成可循环利用。

得到化合物4后，本发明将所述化合物4、硝化试剂、有机酸和有机酸酐混合，进行硝化反应，得到化合物5。在本发明中，所述硝化试剂优选包括发烟硝酸，所述发烟硝酸的浓度优选≥95wt％。在本发明中，所述化合物4与硝化试剂的摩尔比优选为优选为1：1.05～1.3，更优选为1：1.1～1.2。在本发明中，所述有机酸优选包括醋酸；所述化合物4的物质的量与有机酸的体积比优选为优选为1mol：200～300mL，更优选为1mol：250～280mL。在本发明中，所述有机酸酐优选包括醋酐；所述化合物4的物质的量与有机酸酐的体积比优选为优选为1mol：200～300mL，更优选为1mol：250～280mL。在本发明中，所述混合优选为将所述化合物4、有机酸和有机酸酐混合，冷却至0℃后滴加硝化试剂混合。在本发明中，所述冷却优选为冰浴冷却。本发明对于所述硝化试剂的滴加速度没有特殊限定，能够将反应体系的温度控制在0℃以下即可。在本发明中，所述硝化反应的温度优选为0～35℃，更优选为10～25℃；所述硝化反应的时间优选为0.5～6h，更优选为3～5h。所述硝化反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述硝化反应得到的反应液与冰水混合后析晶，固液分离，将所得固体产物进行干燥，得到化合物5。本发明对于所述析晶的时间没有特殊限定，析晶至晶体不再增加即可。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如抽滤。在本发明中，所述干燥的温度优选为10～40℃，更优选为20～30℃，本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可。

得到化合物5后，本发明将所述化合物5、R₅H、卤代盐和碱性试剂混合，进行取代反应，得到化合物6；所述R₅H中R₅与所述式I中R₅相同。在本发明中，所述化合物5与R₅H的摩尔比优选为优选为1：1～1.1，更优选为1:1.05。在本发明中，所述卤代盐优选包括KI；所述化合物5与卤代盐的摩尔比优选为优选为1：1～1.1，更优选为1:1～1.05。在本发明中，所述碱性试剂优选包括碳酸盐，更优选包括碳酸钾和/或碳酸钠；所述化合物5与碱性试剂的摩尔比优选为优选为1：2～5，更优选为1：3～4。在本发明中，所述取代反应优选在溶剂存在条件下进行，所述溶剂优选包括腈类溶剂，更优选包括乙腈；本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够保证取代反应顺利进行即可。在本发明的具体实施例中，所述混合优选为将所述化合物5、卤代盐和溶剂混合后回流，冷却后与碱性试剂和R₅H混合。在本发明中，所述回流的时间优选为20～40min，更优选为30min。本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，冷却至20～40℃即可，更优选为30℃，具体如自然冷却。在本发明中，所述取代反应的温度优选为50～80℃，更优选为70～80℃；所述取代反应的时间优选为5～24h，更优选为12～20h。所述取代反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述取代反应得到的反应液固液分离，将所得液体产物浓缩，将所得浓缩物与水混合，依次进行有机溶剂萃取、水洗、饱和氯化钠溶液洗、干燥和硅胶柱层析分离，得到化合物6。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如抽滤。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。本发明中，所述化合物5的物质的量与混合用水的体积之比优选为1mol：2.5～3L，更优选为1mol：2.7～2.8L。在本发明中，在本发明中，所述有机溶剂萃取用有机溶剂优选包括酯类溶剂，更优选包括乙酸乙酯(EA)；所述有机溶剂萃取的次数优选为2～5次，更优选为3～4次。在本发明中，所述水洗的次数优选为1～2次。在本发明中，所述饱和氯化钠溶液洗的次数优选为1次。本发明对于所述干燥的方式和条件没有特殊限定，干燥至恒重即可；在本发明的具体实施例中，所述干燥优选包括无水硫酸镁干燥后抽滤，将所得滤液蒸干，得到干燥产物。在本发明中，所述硅胶柱层析分离用洗脱剂优选包括乙酸乙酯、石油醚(PE)和三乙胺(TEA)混合溶剂，所述混合溶剂中乙酸乙酯、石油醚和三乙胺的体积比优选为1：2～5：0.001～0.005，更优选为1：3～4：0.002～0.003。

得到化合物6后，本发明将所述化合物6、还原性金属和无机酸混合，进行还原反应，得到化合物7。在本发明中，所述还原性金属优选包括Sn；所述化合物6与还原性金属的摩尔比优选为优选为1：1.5～2.2，更优选为1：1.8～2。在本发明中，所述无机酸优选包括HCl；所述无机酸优选以无机酸气体形式使用；所述化合物6与无机酸的摩尔比优选为1：1.5～5，更优选为1：2～3。在本发明中，所述还原反应优选在溶剂存在条件下进行，所述溶剂优选包括醇类溶剂，更优选包括甲醇和/或乙醇；本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够保证还原反应顺利进行即可。在本发明的具体实施例中，所述混合优选为将化合物6、还原性金属和溶剂混合，加热至还原反应的温度后通入无机酸混合。在本发明中，所述还原反应的温度优选为40～60℃，更优选为50℃；所述还原反应的时间优选为1～8h，更优选为3～5h。所述还原反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述还原反应得到的反应液固液分离，将所得固体产物溶解于水中，加入有机溶剂混合，调节pH值至碱性，分相，将所得有机相饱和氯化钠溶液洗涤后干燥，得到化合物7。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如抽滤。本发明对于所述水的用量没有特殊限定，能够将固体产物溶解即可。在本发明中，所述有机溶剂优选包括乙酸乙酯。在本发明中，所述调节pH值采用的碱优选包括氨水，所述氨水的浓度优选为10～50wt％，更优选为25wt％；所述调节pH值优选在冰浴条件下进行。在本发明中，所述饱和氯化钠溶液洗涤的次数优选为1～2次，更优选为1次。本发明对于所述干燥的方式和条件没有特殊限定，干燥至恒重即可。在本发明的具体实施例中，所述干燥优选包括无水硫酸钠干燥后抽滤，将所得滤液蒸干，然后置于冰箱中固化，得到化合物7。

得到化合物7后，本发明将所述化合物7、氰酸盐和有机酸混合，进行环合反应，得到化合物II-1。在本发明中，所述氰酸盐优选包括KOCN和/或NaOCN；所述化合物7与氰酸盐的摩尔比优选为优选为1：1.2～2，更优选为1：1.5～1.8。在本发明中，所述有机酸优选包括冰醋酸；所述化合物7的物质的量与有机酸的体积之比优选为优选为1mol：300～400mL，更优选为1mol：340～350mL。在本发明中，所述环合反应优选包括依次进行第一环化反应和第二环化反应，所述第一环化反应优选在溶剂存在条件下进行，所述溶剂优选包括水；本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够保证所述第一环化反应顺利进行即可。在本发明中，所述第一环化反应的温度优选为40～80℃，更优选为50～65℃；所述第一环化反应的时间优选为3～15h，更优选为8～10h。在本发明中，所述第二环合反应优选在溶剂存在条件下进行，所述溶剂优选包括水和醇类溶剂；所述醇类溶剂优选包括甲醇和/或乙醇；所述水和醇类溶剂的体积比优选为1：1.5～3，更优选为1：2～2.5；本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够保证所述第二环化反应顺利进行即可。在本发明中，所述第一环化反应后，本发明优选将所述第一环化反应得到的反应液冷却至室温，加入溶剂，调节pH值至碱性后再进行第二环化反应。本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可，具体如自然冷却。在本发明中，所述调节pH值采用的碱优选包括NaOH和/或KOH，本发明对于所述碱的用量没有特殊限定，能够将体系的pH值调节至8～10即可，所述pH值更优选为9。在本发明中，所述第二环化反应的温度优选为30～80℃，更优选为50～65℃；所述第二环化反应的时间优选为0.5～5h，更优选为1～2h。所述环化反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述环化反应得到的反应液进行浓缩，将所得浓缩物进行水洗后干燥，得到化合物II-1。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。在本发明中，所述水洗的次数优选为1～4次，更优选为2～3次。在本发明中，所述干燥的温度优选为10～40℃，更优选为20～30℃，本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可。

得到化合物II后，本发明将所述化合物II、氯代试剂和有机胺混合进行氯代反应，得到化合物III；所述化合物II包括化合物II-1或化合物II-2。在本发明中，所述氯代试剂优选包括三氯氧磷、三氯化磷。在本发明中，所述化合物II与氯代试剂的摩尔比优选为1：3～10，更优选为1：5～8。在本发明中，所述有机胺优选包括N,N-二甲基苯胺、N,N-二异丙基乙胺；所述化合物II与有机胺的摩尔比优选为1：0.5～1.5，更优选为1：0.5～1。在本发明中，所述氯代反应的温度优选为60～110℃，更优选为65～100℃；所述氯代反应的时间优选为1～6h，更优选为3～5h。所述氯代反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述氯代反应得到的反应液进行浓缩，将所得浓缩物溶解于与水不互溶溶剂中，将所得溶液与水混合，分相，得到水相和有机相；将所述水相进行有机溶剂萃取，将所得萃取有机相与所述有机相合并后依次进行水洗、饱和氯化钠溶液洗涤、干燥和柱层析分离，得到化合物III。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。本发明中，所述与水不互溶溶剂优选包括氯代烷烃，更优选包括二氯甲烷，本发明对于所述与水不互溶溶剂的用量没有特殊限定，能够将浓缩物溶解即可。所述有机溶剂萃取用有机溶剂优选包括氯代烷烃，更优选包括二氯甲烷；所述有机溶剂萃取的次数优选为2～3次。在本发明中，所述水洗的次数优选为2～3次。在本发明中，所述饱和氯化钠溶液洗涤的次数优选为1次。本发明对于所述干燥的方式和条件没有特殊限定，干燥至恒重即可。在本发明的具体实施例中，所述干燥优选包括无水硫酸镁干燥干燥后抽滤，将所得滤液蒸干。在本发明中，所述硅胶柱层析分离用洗脱剂优选包括乙酸乙酯、石油醚(PE)和冰醋酸的混合溶剂，所述混合溶剂中乙酸乙酯、石油醚和冰醋酸的体积比优选为1：1～3：0.001～0.002，更优选为1：1～2：0.001～0.0015。

得到化合物III后，本发明将所述化合物III、化合物IV和碱性试剂混合进行氨解反应，得到化合物V。在本发明中，所述化合物III与化合物IV的摩尔比优选为优选为1：1～1.2，更优选为1：1.1～1.5。在本发明中，所述碱性试剂优选包括碳酸盐，更优选包括碳酸钠和/或碳酸钾；所述化合物III与碱性试剂的摩尔比优选为优选为1：3～5，更优选为1：4～5。在本发明中，所述氨解反应优选在溶剂存在条件下进行，所述溶剂优选包括酰胺类溶剂，更优选包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够保证氨解反应顺利进行即可。在本发明中，所述氨解反应优选在保护气氛下进行，所述保护气氛优选包括氮气、氩气或氦气。在本发明中，所述氨解反应的温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃；所述氨解反应的时间优选为3～10h，更优选为5～7.5h。在本发明中，所述氨解反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述氨解反应得到的反应液与水混合，有机溶剂萃取，将所得有机相依次进行水洗、饱和氯化钠溶液洗涤和干燥，得到化合物V。在本发明中，所述有机溶剂萃取用有机溶剂优选包括酯类溶剂，更优选包括乙酸乙酯；所述有机溶剂萃取的次数优选为2～3次。在本发明中，所述水洗的次数优选为2～3次。在本发明中，所述饱和氯化钠溶液洗涤的次数优选为1次。本发明对于所述干燥的方式和条件没有特殊限定，干燥至恒重即可。在本发明的具体实施例中，所述干燥优选包括无水硫酸镁干燥干燥后抽滤，将所得滤液蒸干。

得到化合物V后，本发明将所述化合物V、R₃H和磺酸类化合物混合进行取代反应，得到具有式I所示结构的喹唑啉酮化合物；所述R₃H中R₃与所述式I中R₃相同。在本发明中，所述化合物V与R₃H的摩尔比优选为优选为1：1～3，更优选为1：1.5～2。在本发明中，所述磺酸类化合物优选包括对甲苯磺酸和/或甲基磺酸；所述化合物V与磺酸类化合物的摩尔比优选为优选为1：0.5～2，更优选为1：1～1.5。在本发明中，所述取代反应优选在溶剂存在条件下进行，所述溶剂优选包括醇类溶剂，更优选包括正丙醇，本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够保证取代反应顺利进行即可。在本发明中，所述取代反应优选在保护气氛下进行，所述保护气氛优选包括氮气、氩气或氦气。在本发明中，所述取代反应的温度优选为90～130℃，更优选为100～110℃；所述氨解反应的时间优选为5～24h，更优选为22.5h。在本发明中，所述取代反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述取代反应得到的反应液浓缩，在将所得浓缩物与饱和碳酸氢钠溶液混合，有机溶剂萃取，将所得有机相依次进行饱和氯化钠溶液洗涤、干燥和硅胶柱层析分离，得到具有式I所示结构的喹唑啉酮化合物。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。在本发明中，所述有机溶剂萃取用有机溶剂优选包括氯代烷烃，更优选包括二氯甲烷；所述有机溶剂萃取的次数优选为2～5次，更优选为3～4次。在本发明中，所述饱和氯化钠溶液洗的次数优选为1次。本发明对于所述干燥的方式和条件没有特殊限定，干燥至恒重即可；在本发明的具体实施例中，所述干燥优选包括无水硫酸镁干燥后抽滤，将所得滤液蒸干。本发明中，所述硅胶柱层析分离用洗脱剂优选包括二氯甲烷、甲醇和三乙胺混合溶剂，所述混合溶剂中二氯甲烷、甲醇和三乙胺的体积比优选为20～50：1：0.002～0.005，更优选为30～40：1：0.003～0.04。

本发明提供了上述技术方案所述的喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐或上述技术方案所述制备方法制备的喹唑啉酮化合物在制备治疗G9a和/或EZH2介导的疾病中的应用。在本发明中，所述G9a和/或EZH2介导的疾病优选包括恶性肿瘤。在本发明中，所述恶性肿瘤优选包括肺癌、肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、淋巴瘤和白血病中的一种或几种。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，化合物的核磁共振数据由BrukerARX-400和BrukerARX-600核磁共振仪测定，内标为TMS；液质(LC-MS-ESI)采用Agilent1100Series MSD Trap(SL)测定；熔点使用X-4型数字显示熔点仪测定(温度未经校正)。

实施例1

(1)向250mL单口瓶中加入20g(0.10mol)2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸和60.06g(1.0mol)尿素搅拌均匀，在150℃油浴条件下反应10h，将反应液降温至100℃，加入100mL水，用冰醋酸调pH值至5，在100℃条件下搅拌30min，移至室温冷却析晶，抽滤，将所得滤饼干燥至恒重，得到6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(近白色固体，16.64g，收率为74.9％)。6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮：¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆):δ11.10(s,1H),10.92(s,1H),7.26(s,1H),6.68(s,1H),3.82(s,3H),3.78(s,3H)。

(2)在100mL单口瓶中加入3.0g(13.5mmol)6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮和8.18g(67.5mmol)三氯氧磷，在室温条件下加入1.03g(6.75mmol)N,N-二甲基苯胺，搅拌10min后升温至回流6h，减压蒸馏蒸去大部分三氯氧磷，趁热加入30mL二氯甲烷(DCM)溶解残余油状物，在搅拌条件下倒入40mL水中，分液，得到DCM层和水层，水层DCM萃取2次(单次用DCM体积为30mL)，合并DCM层后水洗2次，饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，将所得滤液蒸干，将所得深红色固体(2.53g)进行快速柱层析(洗脱剂为EA：PE：AcOH体积比＝1:1:0.001)，得到2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹唑啉(白色固体，2.12g，收率为60.8％)。2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹唑啉：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.42(s,1H),7.35(s,1H),4.02(s,3H),4.00(s,3H)。

(3)在50mL单口瓶中加入2.12g(8.06mmol)2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹唑啉、1.36g(8.90mmol)3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮、3.18g(40.3mmol)碳酸钾粉末和10mL DMF，Ar置换3次，在70℃条件下油浴反应7.5h，将反应液倒入50mL水中，EA萃取3次(单次用EA体积为20mL)，水洗2次，饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，将所得滤液蒸干，得到3-{[(2-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(淡黄色固体，2.54g，收率为84.4％)。3-{[(2-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮：ESI-MS m/z:375.3[M+H]⁺,373.0[M-H]^-.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ11.13(s,1H),7.26(s,1H),6.98(s,1H),5.99(s,1H),4.73(s,2H),3.95(s,3H),3.92(s,3H),2.53(s,3H),2.26(s,3H).

(4)在25mL单口瓶中加入100mg(0.27mmol)3-(((2-氯-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮、29mg(0.29mmol)N-甲基哌嗪、46mg(0.27mmol))对甲苯磺酸和10mL正丙醇，Ar置换3次，回流反应22.5h，蒸干反应液，加入到30mL水中，DCM萃取4次(单次用DCM体积为30mL)，饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，将所得滤液蒸干，将所得淡绿色油状液体(109mg)用0.15g硅胶拌样，2g硅胶柱层析(洗脱剂：DCM：MeOH：TEA体积比＝20:1:0.005)得到3-({[6,7-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)喹唑啉-4-基]氨基}甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-1，简写为ST01，白色固体，84mg，收率为71％)。ST01：m.p.203～205℃.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ11.43(s,1H),7.27(s,1H),7.12(s,1H),6.87(s,1H),5.95(s,1H),4.76(d,J＝5.3hz,2H),3.96(br,7H),3.88(s,3H),2.55(t,J＝4.3hz,4H),2.37(s,3H),2.36(s,3H),2.28(s,3H).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ165.1,158.8,154.7,150.4,145.8,142.5,122.7,109.9,105.1,103.4,101.5,56.5,55.1,46.2,44.3,37.3,29.8,19.9,19.0.hRMS(ESI)calcd for C₂₃H₂₉N₆O₃[M-H]^-:437.2301,found437.2318。

实施例2

按照实施例1的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(4)中以吗啉代替N-甲基哌嗪，得到3-{[(6,7-二甲氧基-2-吗啉代喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-2，简写为ST02，白色固体，71mg，收率为62％)。ST02：m.p.233～235℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ10.95(s,1H),7.26(s,1H),6.97(s,1H),6.81(s,1H),5.97(s,1H),4.78(d,J＝5.5hz,2H),3.96(s,3H),3.90(br,7H),3.82-3.79(m,4H),2.36(s,3H),2.27(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.1,158.9,154.5,150.4,145.8,141.8,123.0,110.2,101.2,67.2,56.2,44.8,37.0,19.8,18.9.ESI-MS m/z:426.37[M+H]⁺。

实施例3

按照实施例1的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(4)中以N,N,N'-三甲基乙二胺代替N-甲基哌嗪，得到3-{[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-3，简写为ST03，白色固体，84mg，收率为71％)。ST03：m.p.210～211℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.56(s,1H),7.27(s,1H),7.10(s,1H),6.94(s,1H),5.95(s,1H),4.75(d,J＝4.9hz,2H),3.96(s,3H),3.87-3.85(m,5H),3.28(s,3H),2.65(t,J＝6.9hz,2H),2.38(s,6H),2.34(s,3H),2.29(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.2,158.8,154.5,150.4,145.3,142.3,122.6,109.8,105.5,103.2,101.6,57.0,56.4,56.0,47.5,46.1,37.2,19.8,18.9.ESI-MS m/z:441.36[M+H]⁺。

实施例4

按照实施例1的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(4)中以N-甲基高哌嗪代替N-甲基哌嗪，得到3-({[6,7-二甲氧基-2-(4-甲基-1,4-二氮杂-1-基)喹唑啉-4-基]氨基}甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-4，简写为ST04，白色固体，96mg，收率为79％)。ST04：m.p.141～142℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.97(s,1H),6.92(s,1H),6.83(s,1H),6.71(s,1H),5.93(s,1H),4.77(d,J＝5.3hz,2H),4.07-4.05(m,2H),3.94(s,3H),3.86(s,3H),2.76-2.74(m,2H),2.68-2.60(m,4H),2.40(s,3H),2.34(s,3H),2.28(s,3H),2.08-2.02(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.5,158.7,158.4,154.3,150.8,148.8,145.0,142.8,122.5,109.9,105.6,103.3,101.8,59.0,57.5,56.3,56.0,46.6,46.1,45.6,36.9,27.8,19.8,18.8.hRMS(ESI)calcd for C₂₄H₃₃N₆O₃[M+H]⁺:453.2569,found453.2622。

实施例5

按照实施例1的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(4)中以N,N,N'-三甲基丙二胺代替N-甲基哌嗪，得到3-{[(2-{[3-(二甲基氨基)丙基][甲基]氨基}-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-5，简写为ST05，白色固体，89mg，收率为72％)。ST05：m.p.101～103℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.75(s,1H),7.00(s,1H),6.99(s,1H),6.93(s,1H),5.95(s,1H),4.76(d,J＝5.2hz,2H),3.96(s,3H),3.88(s,3H),3.76(t,J＝7.1hz,2H),3.24(s,3H),2.41(t,J＝7.0hz,2H),2.35(s,3H),2.29-2.28(m,9H),1.90-1.83(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.4,158.7,158.6,154.3,150.8,148.5,145.0,142.8,122.4,109.9,105.3,103.2,102.0,57.3,56.3,55.9,52.8,47.5,45.5,37.0,35.3,25.9,19.8,18.8.hRMS(ESI)calcd for C₂₄H₃₅N₆O₃[M+H]⁺:455.2726,found455.2771。

实施例6

(1)将40.0g(0.24mol))香草酸置于500mL三口瓶中，加入200mL甲醇，冰浴降温至0℃，滴加20.8mL(0.28mol)氯化亚砜，控制滴速使温度保持在10℃以下，1h滴加完毕，升温至65℃回流反应7h，减压蒸去MeOH和剩余氯化亚砜，残余物加入200mL DCM溶解，用60mL饱和碳酸氢钠洗2次，60mL饱和NaCl洗1次，无水硫酸钠干12h，抽滤，蒸干滤液，将所得浅蓝色液体放置10min固化，得到4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯(近白色固体，41.6g，收率为96.1％)。

(2)将31.0g(0.17mol)4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯置于1L三口瓶中，加入300mLCH₃CN、54.55g(0.26mol)1-溴-3-氯丙烷和70.49g(0.51mol)碳酸钾升温至50℃反应40h，停止反应，抽滤，减压蒸馏，残余物用300mL DCM溶解，200mL水洗2次，无水硫酸钠干燥12h，抽滤，将所得滤液减压蒸干，将所得浅红色半固体(45.3g)用135mL丙酮重结晶，得到4-(3-氯丙氧基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(白色块状晶体，37.33g，收率为85.2％)，重结晶滤液回收套用。4-(3-氯丙氧基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯：m.p.103～104℃.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ7.66(dd,J＝2.6hz,1H),7.55(d,J＝2.0hz,1H),6.92(d,J＝8.4hz,1H),4.24(t,J＝6.0hz,2H),3.90(s,3H),3.89(s,3H),3.78(t,J＝6.2hz,2H),2.34-2.28(m,2H)。

(3)向250mL三口瓶中加入30g(0.12mol)4-(3-氯丙氧基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯、30mL醋酸和30mL醋酐，冰浴降至0℃，缓慢滴加9.3g(0.14mol)发烟硝酸(≥95wt％)，控制温度在0℃以下，1h滴加完毕，然后升温至25℃，反应5h，将反应液倒入300mL冰水中，搅拌5min，析出黄色固体，抽滤，烘干，得到4-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯(黄色固体粉末，34g，收率为96.5％)。4-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯：m.p.63～65℃.ESI-MS m/z:325.27[M+Na]⁺.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ7.48(s,1H),7.07(s,1H),4.26(t,J＝5.9hz,2H),3.95(s,3H),3.91(s,3H),3.78(t,J＝6.2hz,2H),2.35(m,2H)。

(4)在250mL单口瓶中加入11.12g(0.037mol)4-(3-氯丙氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯、6.14g(0.037mol)KI和60mL乙腈，回流30min，降温至30℃，加入15.34g(0.11mol)研细碳酸钾和2.74g(0.039mol)四氢吡咯，升至80℃反应12h，停止反应，抽滤，滤液蒸干，加水100mL，EA萃取3次(单次用EA体积为100mL)，水洗1次，饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，将所得滤液蒸干，将所得棕色油状物(15.4g)用20g硅胶拌样，150g硅胶柱层析(EA:PE:TEA体积比＝1:3:0.002)，得到5-甲氧基-2-硝基-4-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]苯甲酸甲酯(黄色液体，8.3g，收率为66.4％)。5-甲氧基-2-硝基-4-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]苯甲酸甲酯：ESI-MS m/z:339.32[M+H]⁺.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ7.50(s,1H),7.07(s,1H),4.20(t,J＝6.6hz,2H),3.95(s,3H),3.91(s,3H),2.68-2.59(m,6H),2.15-2.09(m,2H),1.82(br,4H)。

(5)向50mL三口瓶中加入4.5g(13.3mmol)5-甲氧基-2-硝基-4-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]苯甲酸甲酯、45mL无水乙醇和Sn粉4.8g(26.6mmol)，在50℃油浴条件下向反应液中缓缓通入HCl气体(79.8mol)，并继续反应5h，停止反应，抽滤，将所得滤饼溶于10mL水，加入50mL EA，冰浴条件下用25％氨水调pH值至9，分出有机层，用30mL饱和氯化钠溶液洗1次，干燥12h，抽滤，蒸干滤液，将所得黄色液体置于冰箱中固化12h，得到2-氨基-5-甲氧基-4-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]苯甲酸甲酯(黄色固体，3.2g，收率为85.4％)。2-氨基-5-甲氧基-4-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]苯甲酸甲酯：m.p.73～74℃。ESI-MS m/z:308.17[M+H]⁺.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ7.30(s,1H),6.19(s,1H),5.55(s,2H),4.10(t,J＝6.6hz,2H),3.85(s,3H),3.80(s,3H),2.76-2.67(m,6H),2.19-2.11(m,2H),1.88-1.84(m,4H)。

(6)向100mL三口瓶中加入4.5g(14.59mmol)2-氨基-5-甲氧基-4-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]苯甲酸甲酯、5mL冰乙酸和10mL水，在室温条件下下加入1.4g(21.88mmol)氰酸钠，在65℃条件下反应10h，降至室温，加入10mL甲醇和20mL水，氢氧化钠固体调pH值至9，65℃继续反应2h，减压蒸馏蒸去甲醇，抽滤，将所得滤饼用10mL水洗涤2次，干燥，得到6-甲氧基-7-[3-(1-吡咯烷基)丙氧基]-2,4(1H,3H)-喹唑啉二酮(白色固体，4.13g，收率为88.6％)。6-甲氧基-7-[3-(1-吡咯烷基)丙氧基]-2,4(1H,3H)-喹唑啉二酮：ESI-MS m/z:320.4[M+H]⁺.

(7)向100mL三口瓶中加入4.13g(12.9mmol)6-甲氧基-7-[3-(1-吡咯烷基)丙氧基]-2,4(1H,3H)-喹唑啉二酮和20mL丙酮，在冰浴条件下滴加5.93g(38.7mmol)POCl₃和1.67g(12.9mmol)DIPEA，升温至80℃反应5h，减压蒸干，趁热向残余物中加入50mL DCM溶解，倒入至50mL冰水中，冰浴条件下向混合液中滴加30％NaOH溶液至pH值为9，分液，得到DCM层和水层，水层用DCM萃取2次(单次用DCM体积为30mL)，合并DCM层，水洗1次，饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸钠干燥，抽滤蒸干，将所得棕黄色固体(3.92g)进行快速柱层析(MeOH:DCM:TEA体积比＝1:20:0.002)，得到2,4-二氯-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷基)丙氧基]喹唑啉(白色固体，3.01g，收率为65.5％)。2,4-二氯-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷基)丙氧基]喹唑啉：m.p.95～97℃ESI-MS m/z:356.2[M+H]⁺.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ7.34(s,1H),7.29(s,1H),4.29(t,J＝8.0hz,2H),4.05(s,3H),2.69(t,J＝4.0hz,2H),2.56-2.47(m,4H),2.19-2.12(m,2H),1.81-1.79(m,4H)。

(8)在25mL单口瓶中加入1.0g(2.80mmol)2,4-二氯-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉、0.46g(3.00mmol)3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮、1.90g(14.0mmol)研细的碳酸钾和2mLDMF，氩气置换3次，在70℃油浴条件下反应24h，加水抽滤，得到3-[({2-氯-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(淡黄色固体，1.10g，收率为84.6％)。3-[({2-氯-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮：ESI-MS m/z:472.3,474.32[M+H]⁺.¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ11.52(s,1H),8.28(s,1H),7.70(s,1H),7.03(s,1H),5.90(s,1H),4.45(d,J＝4.3hz,2H),4.13(t,J＝6.2hz,2H),3.85(s,3H),2.56-2.54(m,2H),2.47(br,4H),2.25(s,3H),2.13(s,3H),1.95-1.92(m,2H),1.69(br,4H)。

(9)在25mL单口瓶中加入0.2g(0.42mmol)3-[({2-氯-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮、0.048g(0.46mmol)N,N,N'-三甲基乙二胺、0.144g(0.84mmol)对甲苯磺酸和2mL正丙醇，氩气置换3次，回流反应12h，蒸干反应液，加水20mL，DCM萃取3次(单次用DCM体积为20mL)，DCM层合并，水洗1次，饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液蒸干，制备液相分离，得到3-{[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基][甲基]氨基}-6-甲氧基-7-{3-[吡咯烷-1-基]丙氧基}喹唑啉-4-基)氨基]甲基}-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-6，简写为SU01，黄色固体，80mg，收率为35％)。SU01：m.p.96～97℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.62(s,1H),6.96(s,1H),6.84(s,1H),5.94(s,1H),4.77(s,2H),4.16(t,J＝6.6hz,2H),3.84(br,5H),3.25(s,3H),2.69(t,J＝7.2hz,2H),2.61-2.58(m,6H),2.35-2.34(m,9H),2.29(s,3H),2.18-2.08(m,2H),1.82-1.79(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.5,158.8,153.9,150.8,149.0,145.1,142.9,122.4,109.9,106.5,103.2,102.5,67.2,56.9,56.5,54.1,53.0,47.4,45.8,36.9,35.6,28.4,23.4,19.8,18.8.ESI-MS m/z:538.54[M+H]⁺。

实施例7

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以N-甲基高哌嗪代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({6-甲氧基-2-[4-甲基-1,4-二氮杂-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-7，简写为SU02，白色固体，98mg，收率为43％)。SU02：m.p.116～118℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.11(s,1H),6.90(s,1H),6.79(s,1H),6.64(s,1H),5.93(s,1H),4.77(d,J＝5.3hz,2H),4.16(t,J＝6.8hz,2H),4.05(s,2H),3.94-3.90(m,2H),3.85(s,3H),2.75(s,2H),2.66-2.61(m,4H),2.55(s,3H),2.40(s,3H),2.34(s,3H),2.28(br,4H),2.15-2.05(m,4H),1.79(br,4H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ165.1,158.6,153.9,150.1,145.2,122.9,109.7,106.7,103.2,102.0,67.2,59.0,57.5,56.6,54.2,53.0,46.7,46.1,45.6,37.0,28.4,23.5,19.7,19.0.ESI-MS m/z:550.51[M+H]⁺。

实施例8

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以哌啶代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({6-甲氧基-2-[哌啶-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-8，简写为SU03，黄色固体，102mg，收率为46.1％)。SU03：m.p.132～134℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.64(s,1H),7.00(s,1H),6.90(s,1H),5.95(s,1H),4.74(s,2H),4.16(t,J＝6.6hz,2H),3.84(s,7H),2.70-2.67(m,2H),2.64-2.60(m,4H),2.36(s,3H),2.28(s,3H),2.14-2.09(m,2H),1.81(s,4H),1.65-1.62(m,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.05,158.7,153.9,151.3,145.8,143.0,128.8,125.9,121.9,110.1,104.7,103.0,102.9,67.1,56.6,54.1,52.8,45.5,37.6,27.8,25.9,24.8,23.4,19.8,18.9.hRMS(ESI)calcd for C₂₉H₄₁N₆O₃[M+H]⁺:521.3195,found521.3243。

实施例9

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以N-甲基哌嗪代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({6-甲氧基-2-[4-甲基哌嗪-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-9，简写为SU04，黄色固体，100mg，收率为47％)。SU04：m.p.101～102℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ12.50(s,1H),6.88(s,1H),6.84(s,1H),6.75(s,1H),5.94(s,1H),4.78-4.76(m,2H),4.17-4.12(m,2H),3.90(s,4H),3.80(s,3H),2.63-2.58(m,4H),2.51-2.50(m,8H),2.36-2.33(m,6H),2.28(s,3H),2.12-2.06(m,2H),1.77(br,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.5,157.9,153.0,149.2,148.1,144.5,141.5,121.7,108.8,105.8,102.6,101.1,66.2,55.5,54.3,53.1,51.9,45.3,45.1,43.1,27.4,22.4,18.7,17.8.hRMS(ESI)calcd for C₂₉H₄₂N₇O₃[M+H]⁺:536.3324,found 536.3352。

实施例10

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以N-乙基哌嗪代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({[2-(4-乙基哌嗪-1-基)-6]甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶2(1H)-酮(I-10，简写为SU05，100mg黄色固体，收率为47％)。SU05：m.p.120～123℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ12.06(s,1H),6.89(s,1H),6.81(s,1H),6.72(s,1H),5.93(s,1H),4.78(S,2H),4.15(s,2H),3.92(s,4H),3.84(s,3H),2.63(s,4H),2.54(s,6H),2.45(s,2H),2.36(s,3H),2.28(s,3H),2.09(s,2H),1.78(s,4H),1.14(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.5,158.9,154.0,150.2,149.2,145.6,142.3,122.9,109.8,106.9,103.6,102.1,67.3,56.6,54.2,53.1,53.0,52.6,44.1,37.0,28.5,23.5,19.7,18.8,12.0.hRMS(ESI)calcd for C₃₀H₄₄N₇O₃[M+H]⁺:550.3461,found550.3514。

实施例11

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以4-甲氧基哌啶代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({6-甲氧基-2-[4-甲氧基哌啶-1-基]-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶2(1H)-酮(I-11，简写为SU06，黄色固体，99mg，收率为43％)SU06：m.p.113～115℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.87(s,1H),6.88(s,1H),6.80(s,1H),6.69(s,1H),5.93(s,1H),4.78(s,2H),4.51(d,J＝10.3hz,2H),4.15(s,2H),3.84(s,3H),3.40(s,4H),3.36-3.33(m,2H),2.63(s,2H),2.53(s,4H),2.36(s,3H),2.28(s,3H),2.09(s,3H),1.98(s,3H),1.78(s,4H),1.59(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.4,158.9,158.8,154.0,150.1,145.5,142.3,123.0,109.7,106.8,103.4,102.1,67.3,56.6,55.6,54.2,53.0,41.8,37.0,31.0,28.5,23.5,19.7,18.9.hRMS(ESI)calcd for C₃₀H₄₃N₆O₄[M+H]⁺:551.3301,found 551.3362。

实施例12

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以环己亚胺代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({[2-(氮杂-1-基)-6]甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-12，简写为SU07，黄色固体，66mg，收率为30％)。SU07：m.p.107～109℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ12.72(s,1H),6.91(s,1H),6.88(s,1H),6.73(s,1H),5.90(s,1H),4.76(d,J＝4.2hz,2H),4.14(t,J＝6.4hz,2H),3.84-3.82(m,4H),3.80(s,3H),2.60(t,J＝7.1hz,2H),2.51(s,4H),2.31(s,3H),2.25(s,3H),2.09-2.06(m,2H),1.81(s,4H),1.77(s,4H),1.56(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.6,158.7,158.6,153.9,150.6,144.9,142.7,122.6,109.9,106.6,103.1,102.6,67.2,56.6,54.1,53.0,46.9,46.2,36.8,28.6,28.6,27.5,23.5,19.6,18.7,11.5.hRMS(ESI)calcd for C₃₀H₄₃N₆O₃[M+H]⁺:535.3352,found 535.3411。

实施例13

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以4,4-二氟哌啶盐酸盐代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({2-[4,4-二氟哌啶-1-基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4，6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-13，简写为SU08，黄色固体，145mg，收率为62％)。SU08：m.p.121～123℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ12.43(s,1H),6.91(s,1H),6.88(s,1H),6.82(s,1H),5.92(s,1H),4.76(d,J＝4.5hz,2H),4.15(t,J＝6.3hz,2H),4.03(s,4H),3.82(s,3H),2.66(t,J＝7.1hz,2H),2.54(s,4H),2.33(s,3H),2.26(s,3H),2.11-2.07(m,2H),2.06-1.98(m,4H),1.78(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.5,159.1,158.2,154.0,150.5,149.1,145.8,142.7,122.6,109.9,106.9,103.7,102.2,67.2,56.5,54.1,52.9,41.2,37.0,34.0(t,J＝22.1hz),28.4,28.3,23.5,19.7,18.8.hRMS(ESI)calcd for C₂₉H₃₉F₂N₆O₃[M+H]⁺:557.3007,found 557.3054。

实施例14

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以二乙胺代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({2-[二乙氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷基-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-14，简写为SU09，黄色固体，80mg，收率为38％)。SU09：m.p.97～98℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ12.45(s,1H),6.87(s,1H),6.83(s,1H),6.62(s,1H),5.93(s,1H),4.78(d,J＝5.4hz,2H),4.16(t,J＝6.8hz,2H),3.82(s,3H),3.72(q,J＝7.0hz,4H),2.62(t,J＝7.2hz,2H),2.53-2.51(m,4H),2.33(s,3H),2.28(s,3H),2.12-2.05(m,2H),1.79-1.77(m,4H),1.22(t,J＝7.0hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.6,158.8,158.3,153.9,150.3,145.0,142.5,122.8,109.8,106.7,103.1,102.4,67.2,56.7,54.2,53.0,41.2,36.9,28.6,23.5,19.6,18.8,13.7.hRMS(ESI)calcdfor C₂₈H₄₁N₆O₃[M+H]⁺:509.3195,found 509.3244。

实施例15

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以二甲胺代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({2-[二甲基氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷基-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-15，简写为SU10，黄色固体，89mg，收率为44％)。SU10：m.p.107～110℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.71(s,1H),6.94(s,1H),6.85(s,1H),6.82(s,1H),5.93(s,1H),4.78(d,J＝5.3hz,2H),4.16(t,J＝6.7hz,2H),3.84(s,3H),3.24(s,6H),2.66(t,J＝7.3hz,2H),2.56(s,4H),2.36(s,3H),2.28(s,3H),2.14-2.07(m,2H),1.81-1.77(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.3,158.7,154.0,150.3,145.3,142.3,122.9,109.8,106.4,103.0,102.4,67.2,56.6,54.1,52.9,37.3,37.1,28.4,23.5,19.8,18.9.hRMS(ESI)calcd for C₂₆H₃₇N₆O₃[M+H]⁺:481.2882,found481.2934。

实施例16

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以吗啉代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({6-甲氧基-2-吗啉代-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-16，SU11，黄色固体，78mg，收率为36％)。SU11：m.p.158～160℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.89(s,1H),6.93(s,1H),6.88(s,1H),5.93(s,1H),4.75(d,J＝5.2hz,2H),4.16(t,J＝6.4hz,2H),3.87-3.86(m,4H),3.83(s,3H),3.80-3.78(m,4H),2.78(t,J＝7.3hz,2H),2.71(s,4H),2.34(s,3H),2.28(s,3H),2.22-2.14(m,2H),1.87-1.84(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.1,158.8,153.6,150.8,145.9,142.7,129.7,129.1,122.2,114.1,109.9,105.9,103.7,102.4,67.0,66.6,56.5,53.9,52.8,44.9,29.7,23.4,19.8,18.9.hRMS(ESI)calcd for C₂₈H₃₉N₆O₄[M+H]⁺:523.2988,found 523.3044。

实施例17

按照实施例6的方法制备，与实施例1的区别在于，步骤(9)中以四氢吡咯代替N,N,N'-三甲基乙二胺，得到3-[({6-甲氧基-2-[吡咯烷-1-基]-7}{[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉-4-基}氨基)甲基]-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(I-17，简写为SU12，黄色固体，130mg，收率为61％)。SU12：m.p.205～208℃.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.28(s,1H),7.07(s,1H),6.91(s,1H),5.93(s,1H),4.76(d,J＝3.6hz,2H),4.16(t,J＝6.6hz,2H),3.84(s,3H),3.68(s,4H),2.67(t,J＝7.0hz,2H),2.58(s,4H),2.38(s,3H),2.27(s,3H),2.13-2.09(m,2H),1.99-1.96(m,4H),1.80(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ165.1,158.6,154.1,142.2,109.8,103.1,102.6,67.3,56.6,54.1,52.9,46.9,37.2,28.3,25.6,23.5,19.8,19.0.hRMS(ESI)calcd for C₂₈H₃₉N₆O₃[M+H]⁺:507.3039,found 507.3086。

测试例1

体外活性实验

1实验样品和材料

1.1受试药物：ST01～ST05、SU01～SU12。

1.2实验室细胞株及来源

人非小细胞肺癌H460购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，人非小细胞肺癌H1299购自ATCC，人非小细胞肺癌A549购自ATCC，人非小细胞肺癌PC9购自ATCC，NSCLC耐药细胞H460/顺铂(H460/CDDP)实验室构建，NSCLC耐药细胞A549/紫杉醇(A549/PTX)实验室构建，NSCLC耐药细胞PC9/厄洛替尼(PC9/ER)实验室构建，滑膜肌肉瘤细胞SW982购自ATCC，横纹肌肉瘤细胞RD购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，其中，实验室构建具体为利用药物(顺铂、紫杉醇或厄洛替尼)对细胞进行处理使其具有耐药性。

1.3实验试剂

实验试剂如表1所示：

表1实验试剂

1.4实验仪器

表2实验仪器

2实验方法

2.1细胞培养

以含10％胎牛血清的RPMI 1640为培养液放于37℃，5％CO₂饱和湿度的恒温培养箱中传代培养。

2.2药物配制

将各化合物及CDDP、Taxol、Erlotinib、UNC0638和GSK126分别用DMSO溶解，配制成浓度为100mM(mmol/L)的母液，配制好的母液储存于-20℃保存，分装使用，避免反复冻融。实验时，用培养液稀释至所需浓度，需保证药品中的DMSO在培养液中的终浓度不超过1‰。

2.3统计方法

实验数据采用SPSS统计软件进行分析，采用GraphPad Prism 8.0绘图软件制图。各组数据用平均值±标准误(Mean±S.E.M.)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)评价整体显著性差异，使用LSD进行组间比较(方差齐性时)或Dunnett’s T3进行组间比较(方差不齐时)，P<0.05为有显著性差异。

2.4MTT实验

2.4.1实验原理

MTT法也称四唑盐比色法，用于检测细胞活性。由于MTT带正电荷，可以穿过细胞膜作用于活细胞线粒体中的呼吸链，被其中的琥珀酸脱氢酶还原，在细胞色素C的作用下形成不溶于水的蓝紫色甲瓒结晶，而死细胞不能发生以上的反应。甲瓒结晶的形成量与活细胞数目成正比，使用定量的DMSO溶解甲瓒后，使用酶标仪检测492nm波长的吸光度值，OD值可以间接反映活细胞的数目。

细胞抑制率＝1-100％×实验组OD值/对照组OD值。

2.4.2实验步骤

(1)细胞铺板：取对数生长期的细胞，弃去原培养液，PBS洗涤细胞一次，0.25％胰酶消化细胞，使用适量含血清的培养液吹匀细胞制成单细胞悬液，计数后均匀铺入96孔板内，每孔细胞约为3～5×10³个，每孔100μL培养液，为减少边缘效应边孔加入等体积的培养液，放于37℃，5％CO₂饱和湿度的恒温培养箱中培养。

(2)加药：待细胞培养24h后，设计加药浓度梯度为0.1μM、1μM、10μM、100μM和1000μM，换液的同时加药，每孔加药100μL，并设置3个复孔，继续于培养箱中培养。

(3)呈色：待药物作用时间达到时，每孔避光加入10μL MTT溶液，培养箱中孵育4～6h，完全弃去每孔中液体，每孔加入100μL的DMSO溶液，避光震荡5min。

(4)比色：将96孔板放于酶标仪中，于492nm波长处检测OD值，分别计算每组细胞抑制率，使用SPSS计算IC₅₀值。

MTT实验结果如表3所示。

表3化合物的IC₅₀值(μM)

由表3可知，在4种非小细胞肺癌亲本细胞H460、H1299、A549和PC9中，SU08的IC₅₀值最小，对癌细胞的杀伤作用最强。在3种非小细胞肺癌耐药细胞H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER中，SU08和SU03对癌细胞杀伤作用最强。

2.4.3活性筛选

在H460、H1299、A549、PC9、H1299/CDDP、A549/PTX、PC9/ER、SW982和RD细胞中对ST1～ST5和SU01～SU12的活性进行筛选，按照步骤2.4.2进行操作。

图2为ST1～ST5和SU01～SU12的活性筛选结果。由图2可知，在上述三类肿瘤细胞中SU08能够显著抑制肿瘤细胞的存活率，因此SU08因其具有良好的活性而用于后续实验研究。

2.4.4SU08与单靶点阳性药的活性比较

在H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER、细胞中考察SU08与EZH2的阳性药GSK126和EPPZ6438以及G9a的单靶点阳性药物UNC0638对细胞存活率的影响，按照步骤2.4.2进行操作。

结果如表表4和图3所示，图3为使用化合物SU08、UNC0638和GSK126分别处理H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER后的细胞存活情况。

表4化合物SU08、UNC0638和GSK126分别处理H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER后的细胞存活情况(IC₅₀值，μM)

由图3和表4可知，与单靶点阳性药物UNC0638和GSK126相比，SU08对肿瘤细胞的抑制作用更强，具有良好的抗肿瘤活性。

2.4.5SU08抑制EZH2和EHMT2后对耐药细胞生长的抑制作用

采用非细胞毒浓度(细胞成活率高于80％)的EZH2和EHMT2抑制剂SU08处理H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER。给予5μM的SU08处理细胞48h，考察在抑制EZH2和EHMT2后，顺铂、紫杉醇或厄洛替尼对各自耐药细胞生长抑制作用的变化，结果如表5和图4所示，图4为给予SU08后，H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER对不同药物的的敏感性变化。

表5给予SU08后H1299/CDDP、A549/PTX和PC9/ER对不同药物的敏感性变化结果

由图4和表5可知，在给予SU08后，3种NSCLC耐药细胞H460/CDDP、A549/PTX和PC9/ER均对其各自治疗药物的敏感性增强。SU08的逆转指数RI均大于4。说明，SU08能够逆转肺癌耐药细胞的耐药性。

2.4.6SU08与顺铂、紫杉醇或厄洛替尼联用的协同作用

采用等效剂量法研究EZH2和EHMT2双靶向抑制剂SU08是否可以协同顺铂、紫杉醇或厄洛替尼抑制肺癌耐药细胞的生长，具体步骤如下：药物的联用问题用联合用药指数(combination index，CI)来判断，先算出两药各自的IC₅₀值，然后根据等效剂量法采用1/8、1/4、1/2、1、2倍的IC50值浓度给药，利用Calcusyn软件，根据Chou-Talalay法计算药物的CI值。CI<0.9表示二者为协同作用，0.9≤CI≤1.1表示二者为相加作用，RI>1.1表示二者为拮抗作用。RI＝药物对耐药细胞的IC50值/药物对亲本细胞的IC50值采用Calcusyn软件分析结果。图5为SU08与顺铂、紫杉醇或厄洛替尼合用后抑制耐药细胞的生长情况，由图5可知，SU08与顺铂、紫杉醇或厄洛替尼合用后能明显抑制耐药细胞的生长，在多数剂量下具有协同效应(CI<0.9)，说明，SU08可以联合顺铂、紫杉醇或厄洛替尼用药。

2.5 Western Blot实验

2.5.1实验原理

Western Blot，即蛋白免疫印迹技术，与Southern或Northern杂交方法类似，Western Blot由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。凝胶电泳采用的是聚丙烯酰胺电泳，被检测蛋白是抗原，“探针”是与抗原特异性结合的一抗，“显色”用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二体。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离的蛋白质样品，转移到固相载体PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的一抗起免疫反应，对应的二抗与一抗特异性结合，最后加入ECL发光液使用化学呈像仪或者X光底片曝光的方法来显示目的蛋白条带。这种方法最低可检测到1～5ng含量的蛋白。

2.5.2细胞处理

取对数生长期的细胞于100mm培养皿内均匀传代至所需皿数。待细胞长至70％左右时，设定药物给药浓度，换液加药。将细胞置于37℃，5％CO₂的饱和湿度的恒温培养箱中继续培养48h。收集细胞进行下一步操作。

细胞总组蛋白提取方法：

(1)收细胞：用0.25％胰酶消化收集，2mL离心管收集，4℃，1500rpm/min，离心5min。

(2)用水将10×Pre-Lysis Buffer稀释至1×，然后重悬细胞饼(1千万细胞/mL)，冰上孵育10min。

(3)4℃，10000转离心1min后，去除上清。

(4)以1千万细胞/200μL的比例，用Lysis Buffer重悬细胞饼，然后冰上孵育30min。

(5)4℃，12000转离心5min后转移上清至新管中。

(6)以1：500的比例将DTT Buffer加入至Balance Buffer，并将0.3倍上清体积的混合液加入上清中。

2.5.3蛋白浓度测定

(1)根据BCA试剂盒说明书，制备浓度梯度的BSA标准液，如表6所示：

表6浓度梯度的BSA标准液

(2)配制BCA工作液，根据所测样品的数目，将试剂A与试剂B以50:1的比例混匀。

(3)检测样品蛋白的含量

将蛋白样品取适量稀释10倍，将稀释好的BSA标准品和待测样品蛋白20μL分别加入做好标记的96孔板中。每孔加入之前配好的BCA工作液180μL，轻轻拍打96孔板充分混匀，37℃孵育30min。在酶标仪562nm波长下检测OD值，根据BSA标准品的OD值绘制标准曲线，计算待测样品中的蛋白浓度。

2.5.4蛋白免疫印迹

将蛋白Maker和蛋白样品按照顺序加入至梳子孔中。接通电源进行电泳，开始时电压调至60V-80V，待样品进入分离胶时，将电压调至120V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可停止电泳。按滤纸-膜-胶-滤纸的顺序制备“三明治”，膜一定要大于滤纸，防止短路，赶净气泡后盖上转膜机，上面放冰块，打开转膜机15V开始恒压转膜。

将膜从电转槽中取出，根据胶的大小剪膜，做好标记，放入5％的牛奶中封闭1h。将Western膜从封闭液中取出，TBST洗一下，放入剪好的自封袋中，加入一抗4℃过夜，注意镊子尽量不要碰到蛋白所在的位置。过夜孵育的膜室温复温1h，回收一抗，TBST洗三次，每次10min。根据一抗来源选择合适的二抗，M 1:5000，R 1:10000稀释，室温轻摇1h。二抗孵育结束后，用TBST洗膜三次，每次10min。使用蛋白质成像系统，将适量ECL发光液滴加到PVDF膜上，进行蛋白条带图像采集。

图6为化合物SU08、UNC0638和GSK126分别对A549和A549/紫杉醇细胞H3K27me3和H3K9me2蛋白表达水平的影响。由图6可知，与空白组相比，SU08以5μM对人非小细胞肺癌亲本细胞株A549和耐药细胞株A549/紫杉醇进行处理后，H3K27me3和H3K9me2蛋白表达水平下调。

为了验证SU08对EZH2和G9a的双靶向性，采用浓度分别为1μM、5μM和7.5μM的SU08作用于H460/CDDP、A549/PTX和PC9/ER细胞并检测H3K27me3及H3K9me2的蛋白表达水平，采用浓度为5μM的SU08和阳性药EPZ6438作用于RD细胞并检测H3K27me3及H3K9me2的蛋白表达水平。图7为SU08对EZH2和G9a的双靶向性结果。由图7可知，在H460/CDDP、A549/PTX、PC9/ER和RD细胞中，SU08能够浓度依赖性的抑制EZH2和G9a的底物H3K27me3及H3K9me2，说明，SU0具有对EZH2和G9a的双靶向性。

2.6 Transwell实验

2.6.1实验原理

肿瘤细胞自原发瘤体脱离后，降解基质、穿越基底膜并进入血管内是完成转移的关键步骤之一。采用Transwell小室模拟细胞基底膜，考察药物对细胞从Transwell小室的上室穿到下室的能力。Transwell小室模拟体内的细胞外基底膜从而考察肿瘤细胞的迁移能力。

2.6.2实验步骤

(1)细胞处理及加药

取生长状态良好的细胞，弃掉培养液，PBS清洗一次，换成无血清的1640培养基饥饿培养12h，胰酶消化，用无血清培养基吹匀并计数，调整细胞密度为1.5×10⁵cells/mL，上室内，加入200μL含有所需浓度药物的细胞悬液。下室内，加入500μL含有10％血清的培养液配置好的各个浓度的药物，使上下室内药物浓度保持一致。

(2)染色

把小室于5％CO₂、37℃恒温细胞培养箱中培养48h，PBS冲洗小室，Calcein-Ca²⁺(1:1000)染色15min后，用棉签擦去上室表面的细胞，使用倒置荧光显微镜进行拍照，利用Image J进行统计。

肺癌细胞的恶性表型和肺癌耐药有着紧密的关联，肺癌耐药细胞的迁移能力反映出恶性表型能力，通过Transwell实验考察SU08对耐药细胞迁移能力的影响。肺癌细胞的恶性表型和肺癌耐药有着紧密的关联，肺癌耐药细胞的迁移能力反映出恶性表型能力。因此，通过Transwell实验考察SU08对耐药细胞迁移能力的影响。采用非细胞毒浓度(细胞成活率高于80％)5μM的SU08处理细胞48h后，观察耐药细胞迁移能力的变化。图8为SU08对3种NSCLC耐药细胞H460/顺铂、A549/紫杉醇和PC9/厄洛替尼迁移能力影响的荧光显微镜图和细胞相对迁移率结果，其中，A为H460/顺铂，B为A549/紫杉醇，C为PC9/厄洛替尼。由图8可知，H460/CDDP、A549/PTX、PC9/ER耐药细胞的迁移能力明显减弱，且抑制能力优于各单靶点抑制剂联用。说明，SU08通过抑制EZH2和EHMT2来减弱耐药细胞的迁移能力。

2.7成球实验

2.7.1实验原理

肿瘤球形成实验采用特殊培养液以及能替代血清的营养因子来培养肿瘤细胞的方法。这种特殊培养液以及能替代血清营养因子的培养基促进肿瘤细胞的分裂与增殖且能维持肿瘤细胞的未分化状态，使肿瘤细胞悬浮成球不贴壁，这样更贴近肿瘤细胞生长的原始状态。肿瘤球形成率＝形成肿瘤球的数量/接种细胞总数。肿瘤球形成率是肿瘤细胞自我更新能力的重要指标。

2.7.2实验步骤

(1)配制特殊培养液：向无血清的Ham’s F-12/DM培养液中加入1×B27、20ng/mL的人重组bFGF、20ng/mLEGF等营养因子，混合均匀，最好现用现配。

(2)从培养箱取出细胞，PBS小心涮洗2次，胰酶消化，用上述配好的培养液重悬细胞，并且用移液枪多次吹细胞，使之成单个细胞，计数板计数。将细胞以1500cells/mL的密度接种超低粘附6孔板中培养，每孔2mL。

(3)铺板后根据肿瘤球生长状况补加一定体积的上述培养液使终体积维持在2mL，待肿瘤球直径大于1mm，拍照并计数，实验结果重复三次之后，统计分析。

采用非细胞毒浓度(细胞成活率高于80％)5μM的SU08处理细胞14天后，观察耐药细胞成球能力的变化。图9为SU08对3种NSCLC耐药细胞H460/CDDP、A549/PTX、PC9/ER成球能力的影响，由图9可知，H460/CDDP、A549/PTX、PC9/ER耐药细胞的成球能力明显减弱，且抑制能力优于各单靶点抑制剂联用，说明，SU08通过抑制EZH2和EHMT2来减弱耐药细胞的成球能力。

SU08对肿瘤细胞的增殖能力的影响：采用平皿克隆的方法以浓度为5μM的SU08和EPZ6438分别作用于RD细胞，作用5天后采用结晶紫染色并考察对其克隆形成能力的影响。图10为SU08对横纹肌肉瘤细胞克隆形成能力的影响，由图10可知，与空白对照组相比，SU08较EPZ6438能够明显抑制RD的克隆形成能力，因而SU08对横纹肌肉瘤细胞的增殖能力有明显的抑制作用。

测试例2

体内活性实验

1实验细胞

NSCLC耐药细胞H460/顺铂(H460/CDDP)和PC9/ER细胞由实验室构建，人横纹肌肉瘤RD细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

2实验动物

BALB/c-Nude鼠，雄性，4～5周龄，体重18～20g，购自北京华阜康生物科技有限公司，实验动物合格证号：18066。实验取健康BALB/c-nu小鼠100只，小鼠饲料为块状消毒标准饲料。

3实验步骤和实验结果

3.1 SU08对非小细胞肺癌H460/CDDP细胞荷瘤裸鼠肿瘤体积TV、相对肿瘤体积RTV和肿瘤生长抑制率的影响

分组给药，给药浓度分别为腹腔注射SU08(10mg/kg)、EPZ6438(50mg/kg)、UNC0642(5mg/kg)、顺铂(5mg/kg)和厄洛替尼(13.5mg/kg)，连续23天，每周给药5次，给药容积为0.1mL/10g，实验结果如表7和图11所示。图11为药物对非小细胞肺癌细胞异位移植瘤生长的抑制作用。

表7药物对非小细胞肺癌细胞异位移植瘤生长的抑制作用

由表7和图11可知，SU08单用或联合顺铂或厄洛替尼均能抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长，且与顺铂或厄洛替尼联用效果显著。

荷瘤裸鼠的体重和脏器指数能反映出药物可能的毒性。图12为药物对荷瘤裸鼠体重和脏器指数的影响，由图12可知，在H460/顺铂荷瘤模型中，与Control组相比，单用SU08组给药后体重下降，随后回升，给药23天后各组裸鼠体重比较均无统计学意义(P>0.05)，说明，SU08对体重无明显影响；与Control组相比，H460/顺铂荷瘤模型中各组的心、肝、脾、肺、肾指数比较均无统计学意义(P>0.05)，说明，SU08在治疗剂量下对这些脏器无明显的毒副作用。在PC9/厄洛替尼荷瘤模型中，与Control组相比，给药23天后各组裸鼠体重比较均无统计学意义(P>0.05)，说明，SU08对体重无明显影响；与Control组相比，PC9/厄洛替尼荷瘤模型中各组心、肝、脾、肺、肾指数比较均无统计学意义(P>0.05)，说明，SU08在治疗剂量下对这些脏器无明显的毒副作用。

3.2 SU08对横纹肌肉瘤RD细胞荷瘤裸鼠肿瘤体积和肿瘤生长抑制率的影响

分组给药，给药浓度分别为腹腔注射SU08(10mg/kg)、SU08(20mg/kg)和EPZ6438(20mg/kg)，连续21天，每周5次，给药容积为0.1mL/10g。如图所示，SU08(20mg/kg)能抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。

图13为药物对横纹肌肉瘤细胞异位移植瘤生长的抑制作用，由图13可知，SU08(20毫mg/kg)能抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。

图14为药物对横纹肌肉瘤细胞荷瘤裸鼠体重和脏器指数的影响，由图14可知，在横纹肌肉瘤细胞荷瘤模型中，与对照组相比各给药组给药21天后对裸鼠体重和脏器指数无明显影响，说明，SU08在治疗剂量下无明显的毒副作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述喹唑啉酮化合物具有式I所示的结构：

所述式I中，M和Z独立地包括-O-、-S-或-NH-；

X和Y独立地包括-CH-或-N-；

n为0～5的整数；

R₄包括氢、卤素、烷基或烷氧基；

2.根据权利要求1所述的喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述取代的烷基、取代的烷氧基、取代的脂肪胺基、取代的苯胺、取代的萘胺、取代的脂肪胺基、取代的杂环基、取代的杂芳基、取代的环烷基、取代的烷基胺基、取代的环亚胺基和取代的芳基中的取代基独立的包括卤素、-OH、-NO₂、-CN、-OR、-SR、-N(R)₂、-C(O)R、-CO₂R、-C(O)C(O)R、-C(O)CH₂C(O)R、-S(O)R、-S(O)₂R、-C(O)N(R)₂、-SO₂N(R)₂、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)N(R)₂、烷基、环烷基、芳香基、杂环基或杂芳基，其中R包括烷基。

3.根据权利要求1或2所述的喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述杂环基独立地包括5～10元杂环基；

所述杂芳基独立地包括5～10元杂芳基；

所述环烷基包括3～7元环烷基。

4.根据权利要求3任一项所述的喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述喹唑啉酮化合物具有式I-1～I-17所示结构中的任意一种：

5.根据权利要求1所述的喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、高氯酸盐、氨基磺酸盐、脂肪羧酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、扑酸盐、烷基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、萘磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、丙酮酸盐、谷氨酸盐、抗坏血酸盐或硫辛酸盐。

6.权利要求1～5任一项所述喹唑啉酮化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述化合物II-1的制备方法，包括：

将化合物1和尿素混合进行环合反应，得到化合物II-1；

所述化合物1中，M、Y和R₄与所述式I相同；

8.权利要求1～5任一项所述的喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐或权利要求6～7任一项所述制备方法制备的喹唑啉酮化合物在制备治疗G9a和/或EZH2介导的疾病中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述G9a和/或EZH2介导的疾病包括恶性肿瘤。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括肺癌、肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、淋巴瘤和白血病中的一种或几种。