CN113975314A - 罗浮山百草油在制备预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物中的用途 - Google Patents

罗浮山百草油在制备预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑20‑40份、水杨酸甲酯200‑300份、松节油80‑110份、薄荷素油200‑300份、丁香罗勒油10‑20份、樟油100‑200份、八角茴香油10‑30份、肉桂油10‑30份、冰片2‑4份、薄荷脑20‑35份、桉油30‑50份、茶油提取物40‑120份。罗浮山百草油中的各味药材之间互相配合，协同作用，标本兼治，扶正祛邪，起效快，效果好，对由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病具有很好的临床疗效。

Description

罗浮山百草油在制备预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物 中的用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒 感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途。
背景技术
人的冠状病毒在1965年已被分离出来，但人们目前对它们的认识相当有 限。1967年，Mclntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒，其 代表株是OC43株。1968年，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子 显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病 毒为冠状病毒。1965年，Tyrrell与Bynoe利用胚胎的带有纤毛的气管组织首 次培养出冠状病毒，此病毒在电子显微镜下可见如日冕般外围的冠状，因此被 称为冠状病毒(Coronaviridae)。1975年，病毒命名委员会正式命名冠状病 毒科。这类病毒具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性。
冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、 冠状病毒属(Coronavirus)，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原， 引起多种急慢性疾病。目前已知的可感染人类的冠状病毒有七种，其中三种 (SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2)可引起严重的传染性呼吸道疾病，并可 引发大流行。
目前，关于新冠病毒感染及其并发症的治疗主要依靠对症辅助治疗，尚缺 乏特效药物。然而，新药开发是一项耗时的过程，不仅研发周期上市批准后的 批量生产亦是一项耗时的工程。因此，从已上市的经典药物中寻找具有抗冠状 病毒感染(特别是新冠病毒感染)作用的“老药”，是预防或治疗新冠病毒感 染及其并发症的一种有效策略。
根据中医理论，“疫者，疠气流行，多兼秽浊”，“芳香辟秽”，即以芳 香之品辟邪扶正，疏利通达，开闭化滞，推陈祛腐，服用或佩戴芳香药物可用 于预防和治疗疫病。明清时期疫病频繁爆发，而该时期芳香药被大量应用于疫 病防治中，对中医学影响巨大。岭南地区自古以来气候潮湿、多瘴气，罗浮山 百草油以岭南医药学为特色，富含芳香精油及多种芳香药材，由羌活、五月艾、 独活等68种中药经茶油浸泡制成“百草精油”，再加入薄荷油、肉桂油、桉 油、八角茴香油、樟油、薄荷素油、松节油、丁香罗勒油、水杨酸甲酯、樟脑、 薄荷脑11种植物油脂/提取物组成。罗浮山百草油具有祛风解毒、消肿止痛的 功效，临床可用于治疗感冒头痛、虫蚊咬伤、无名肿毒、舟车眩晕；适用于治 疗各种风毒、湿毒、热毒、暑毒引起的一系列病症，其制作技艺现已被中国非 物质文化遗产名录收录。罗浮山百草油大量应用芳香药物及精油，气味芳香， 正体现了“芳香辟秽”的中医理论。
本发明人长期致力于对“罗浮山百草油”新用途和新适应证的研发，以进 行中药大品种的二次开发(参见CN110934926 A)，本发明是发明人此前研究 工作的延续，本发明首次提出了可以将罗浮山百草油用于预防或治疗冠状病毒 感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病，具有良好的应用价值、社 会意义和市场前景。
发明内容
为了解决目前尚无能够有效防治新冠病毒感染及其并发症的药物的问题， 本发明提供了一种罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病 毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
本发明提供了罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病 毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，所述罗浮山百草油包含以 下重量份的组分：樟脑20-40份、水杨酸甲酯200-300份、松节油80-110份、 薄荷素油200-300份、丁香罗勒油10-20份、樟油100-200份、八角茴香油10-30 份、肉桂油10-30份、冰片2-4份、薄荷脑20-35份、桉油30-50份、茶油提 取物40-120份。
作为可选的方式，在上述用途中，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组 分：樟脑25-30份、水杨酸甲酯240-280份、松节油90-100份、薄荷素油220-300 份、丁香罗勒油11-18份、樟油120-180份、八角茴香油14-20份、肉桂油15-25 份、冰片2-3份、薄荷脑25-30份、桉油35-45份、茶油提取物60-100份。
作为可选的方式，在上述用途中，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组 分：樟脑25份、水杨酸甲酯240份、松节油90份、薄荷素油220份、丁香罗 勒油11份、樟油120份、八角茴香油14份、肉桂油15份、冰片2份、薄荷 脑25份、桉油35份、茶油提取物60份。
或者，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑30份、水杨酸甲 酯280份、松节油100份、薄荷素油300份、丁香罗勒油18份、樟油180份、 八角茴香油20份、肉桂油25份、冰片3份、薄荷脑30份、桉油45份、茶油 提取物100份。
作为可选的方式，在上述用途中，所述茶油提取物从茶油组合物中提取制 得，所述茶油组合物包含以下重量份的组分：卷柏1.0份、鹅不食草1.0份、 水芙蓉1.0份、辛夷1.0份、山白芷0.5份、徐长卿1.0份、山银花0.5份、 救必应0.5份、金不换1.0份、白半枫荷0.5份、荜澄茄0.5份、麻黄0.5份、 重楼0.25份、人字草0.25份、金线风0.25份、金耳环0.25份、一朵云0.25 份、吊黄0.25份，所述茶油提取物是将茶油组合物粉碎成粗粉，混匀后加入 茶油，浸渍10-30天，过滤，即得所述茶油提取物。
作为可选的方式，在上述用途中，所述茶油组合物还包括以下重量份的组 分：两面针1.0份、九里香1.0份、红花1.0份、水芙蓉1.0份、千里光1.0 份、大头陈1.0份、当归1.0份、三七1.0份、肿节风1.0份、鸡骨香1.0份、 砂仁0.55份、独活0.55份、羌活0.55份、姜皮0.55份、陈皮0.55份、香 附0.5份、野菊花0.5份、桂枝0.5份、小罗伞0.5份、蔓荆子0.5份、桔梗 0.5份、紫珠叶0.5份、地胆草0.5份、细辛0.5份、五指柑0.5份、肉豆蔻 0.5份、木防己0.5份、三叉苦0.5份、地稔0.5份、防风0.5份、半枝莲0.5 份、铁包金0.5份、柴胡0.5份、飞天蠄蟧0.5份、鸡骨草0.5份、荆芥0.5 份、虎杖0.5份、钩藤0.5份、一枝黄花0.45份、白花灯笼0.43份、白花蛇 舌草0.43份、石仙桃0.25份、五月艾0.25份、皂角刺0.25份、木香0.25 份、山芝麻0.25份、益母草0.25份、紫苏叶0.25份、倒扣草0.25份、侧柏 叶0.25份、鱼腥草0.25份。
作为可选的方式，在上述用途中，所述冠状病毒选自SARS-Cov-2 (2019-nCov)、SARS-CoV、HCoV 229E、NL63、OC43、HKU1或MERS-CoV，所 述药物具有抑制或杀灭冠状病毒的作用。
作为可选的方式，在上述用途中，所述呼吸系统感染性疾病选自上呼吸道 感染或下呼吸道感染。
优选地，所述上呼吸道感染选自：鼻炎、扁桃体炎或咽喉炎。
所述下呼吸道感染选自：支气管炎、病毒性肺炎、新冠肺炎、严重急性呼 吸综合征或中东呼吸综合征。
作为可选的方式，在上述用途中，所述药物为外用制剂。
作为可选的方式，在上述用途中，所述药物的给药方式为吸入或穴位涂擦。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
(1)在全球面临新冠病毒严峻的威胁下，本发明首次提出了罗浮山百草 油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性 疾病的药物中的用途。
(2)罗浮山百草油是一种已上市多年的药品，累积了大量安全性数据， 使得通过外用给药的方式使用罗浮山百草油防止新冠病毒感染及其相关并发 症的安全性能够得到充分保障。
(3)罗浮山百草油外用给药能够高效透皮吸收，药物起效快，避免口服 药物经过肝脏的首过效应；治愈后不易复发，疗效确切，安全性高，使用便捷， 无成瘾性、耐药性和依赖性，无胃肠道、肝肾损伤副作用，市场用途前景广泛。
附图说明
图1：罗浮山百草油对HRT18细胞以及A549细胞的细胞毒性。
图2：罗浮山百草油对冠状病毒的抑制作用。注：与正常组比较，##P<0.01； 模型组比较，**P<0.01，*P<0.05。
图3：罗浮山百草油对冠状病毒引起细胞炎症的抑制作用。其中，图A表 示罗浮山百草油对IL-1β蛋白的影响，图B表示罗浮山百草油对IL-6蛋白的 影响，图C表示罗浮山百草油对IP10蛋白的影响。注：与正常组比较，##P<0.01； 模型组比较，**P<0.01。
图4：显微镜下观察药物处理后Vero细胞的变化情况。
图5：瑞德西韦的体外抗新冠病毒SARS-CoV-2作用结果。
图6：罗浮山百草油体外抗新冠病毒SARS-CoV-2作用结果。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面对本发明中涉及的各种主要术语进 行描述。
如本文所用，“冠状病毒”属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒 科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是许多家畜、宠物包括 人类疾病的重要病原，引起多种急慢性疾病。目前已知的可感染人类的冠状病 毒有七种，分别是SARS-Cov-2(2019-nCov)、SARS-CoV、HCoV 229E、NL63、 OC43、HKU1和MERS-CoV，其中三种(SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2)可 引起严重的传染性呼吸道疾病，并可引发大流行。
本发明的药物为外用制剂，本发明药物的给药方式为吸入或穴位涂擦。
如本文所用，“吸入法”即“嗅鼻法”作为传统中医纳鼻法之一，主要针 对具有“辛散之性”的芳香性药物，中医学认为“辛入肺”，芳香类中药经鼻 或口腔吸入肺部后，直接作用于靶器官,具有起效迅速、疗效佳、全身不良反 应少等优势，在呼吸系统疾病的治疗上可发挥较好的疗效。吸嗅法历史悠久， 作用温和，常用于慢性病及小儿病的治疗。“吸入法”即即“嗅鼻法”包括湿 润嗅鼻法、干燥嗅鼻法、熏香法和香枕疗法。
如本文所用，“湿润嗅鼻法”将罗浮山百草油滴入湿润的手帕、纸巾中， 置于鼻旁或口腔旁吸嗅，或滴入装有热水的马克杯中，吸入蒸腾的蒸气。
如本文所用，“干燥嗅鼻法”将罗浮山百草油(2-3滴)涂于手腕和掌心 处，用力深呼吸3-5分钟。
如本文所用，“熏香法”利用香薰器将罗浮山百草油扩散出去，经鼻和口 腔将芳香分子吸收到人体从而激发经气，疏通经络，促进气血运行，发挥防治 疾病的作用。以香熏灯为例，将罗浮山百草油加入容器中(5滴/15m2)，水温 控制在50-60℃，液体不少于50ml，熏香时关闭门窗，每次1小时左右，既能 作用于人体，又能清新空气。
如本文所用，“香枕疗法”香枕疗法是将罗浮山百草油滴洒在枕套中，令 人睡卧时达到治疗的自然疗法。
“穴位涂擦”优选在人中穴，迎香穴和口禾髎穴给药。
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的 具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或 条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可 通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中 所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
制备实施例：
本发明效果实验中使用的罗浮山百草油的制备方法与CN110934926A中所 述的制备方法基本一致，具体如下所示：
实施例1
本实施例提供了罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状 病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，所述药物为外用制剂， 其中，罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑25份、水杨酸甲酯240份、 松节油90份、薄荷素油220份、丁香罗勒油11份、樟油120份、八角茴香油 14份、肉桂油15份、冰片2份、薄荷脑25份、桉油35份、茶油提取物60 份。
而茶油提取物从茶油组合物中提取制得，具体的，是将茶油组合物粉碎成 粗粉，过30目筛，混匀后加入2倍体积的茶油，于45℃浸渍25天，趁热过滤， 滤液静置冷却至室温，得到茶油提取物。
所述茶油组合物包含以下重量份的组分：卷柏1.0份、鹅不食草1.0份、 水芙蓉1.0份、辛夷1.0份、山白芷0.5份、徐长卿1.0份、山银花0.5份、 救必应0.5份、金不换1.0份、白半枫荷0.5份、荜澄茄0.5份、麻黄0.5份、 重楼0.25份、人字草0.25份、金线风0.25份、金耳环0.25份、一朵云0.25 份、吊黄0.25份、两面针1.0份、九里香1.0份、红花1.0份、水芙蓉1.0份、千里光1.0份、大头陈1.0份、当归1.0份、三七1.0份、肿节风1.0份、 鸡骨香1.0份、砂仁0.55份、独活0.55份、羌活0.55份、姜皮0.55份、陈 皮0.55份、香附0.5份、野菊花0.5份、桂枝0.5份、小罗伞0.5份、蔓荆 子0.5份、桔梗0.5份、紫珠叶0.5份、地胆草0.5份、细辛0.5份、五指柑 0.5份、肉豆蔻0.5份、木防己0.5份、三叉苦0.5份、地稔0.5份、防风0.5 份、半枝莲0.5份、铁包金0.5份、柴胡0.5份、飞天蠄蟧0.5份、鸡骨草0.5 份、荆芥0.5份、虎杖0.5份、钩藤0.5份、一枝黄花0.45份、白花灯笼0.43 份、白花蛇舌草0.43份、石仙桃0.25份、五月艾0.25份、皂角刺0.25份、 木香0.25份、山芝麻0.25份、益母草0.25份、紫苏叶0.25份、倒扣草0.25 份、侧柏叶0.25份、鱼腥草0.25份。
本实施例的预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物为外用制剂，制备方法 包括如下步骤：将茶油提取物与其他各组分混合搅拌均匀，静置5天，取澄清 液，加2倍体积的茶油稀释即得。
实施例2
本实施例提供了罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状 病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，所述药物为外用制剂， 其中，罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑30份、水杨酸甲酯280份、 松节油100份、薄荷素油300份、丁香罗勒油18份、樟油180份、八角茴香 油20份、肉桂油25份、冰片3份、薄荷脑30份、桉油45份、茶油提取物100 份。
而茶油提取物从茶油组合物中提取制得，具体的，是将茶油组合物粉碎成 粗粉，过30目筛，混匀后加入3倍体积的茶油，于60℃浸渍10天，趁热过滤， 滤液静置冷却至室温，得到茶油提取物。
所述茶油组合物包含以下重量份的组分：卷柏1.0份、鹅不食草1.0份、 水芙蓉1.0份、辛夷1.0份、山白芷0.5份、徐长卿1.0份、山银花0.5份、 救必应0.5份、金不换1.0份、白半枫荷0.5份、荜澄茄0.5份、麻黄0.5份、 重楼0.25份、人字草0.25份、金线风0.25份、金耳环0.25份、一朵云0.25 份、吊黄0.25份、两面针1.0份、九里香1.0份、红花1.0份、水芙蓉1.0份、千里光1.0份、大头陈1.0份、当归1.0份、三七1.0份、肿节风1.0份、 鸡骨香1.0份、砂仁0.55份、独活0.55份、羌活0.55份、姜皮0.55份、陈 皮0.55份、香附0.5份、野菊花0.5份、桂枝0.5份、小罗伞0.5份、蔓荆 子0.5份、桔梗0.5份、紫珠叶0.5份、地胆草0.5份、细辛0.5份、五指柑 0.5份、肉豆蔻0.5份、木防己0.5份、三叉苦0.5份、地稔0.5份、防风0.5 份、半枝莲0.5份、铁包金0.5份、柴胡0.5份、飞天蠄蟧0.5份、鸡骨草0.5 份、荆芥0.5份、虎杖0.5份、钩藤0.5份、一枝黄花0.45份、白花灯笼0.43 份、白花蛇舌草0.43份、石仙桃0.25份、五月艾0.25份、皂角刺0.25份、 木香0.25份、山芝麻0.25份、益母草0.25份、紫苏叶0.25份、倒扣草0.25 份、侧柏叶0.25份、鱼腥草0.25份。
本实施例的预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物为外用制剂，制备方法 包括如下步骤：将茶油提取物与其他各组分混合搅拌均匀，静置5天，取澄清 液，加2倍体积的茶油稀释即得。
实施例3
本实施例提供了罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状 病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，所述药物为外用制剂， 其中，罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑20份、水杨酸甲酯200份、 松节油80份、薄荷素油200份、丁香罗勒油10份、樟油100份、八角茴香油 10份、肉桂油10份、冰片2份、薄荷脑20份、桉油30份、茶油提取物40 份。
而茶油提取物从茶油组合物中提取制得，具体的，是将茶油组合物粉碎成 粗粉，过30目筛，混匀后加入2倍体积的茶油，于50℃浸渍15天，趁热过滤， 滤液静置冷却至室温，得到茶油提取物。
所述茶油组合物包含以下重量份的组分：卷柏1.0份、鹅不食草1.0份、 水芙蓉1.0份、辛夷1.0份、山白芷0.5份、徐长卿1.0份、山银花0.5份、 救必应0.5份、金不换1.0份、白半枫荷0.5份、荜澄茄0.5份、麻黄0.5份、 重楼0.25份、人字草0.25份、金线风0.25份、金耳环0.25份、一朵云0.25 份、吊黄0.25份、两面针1.0份、九里香1.0份、红花1.0份、水芙蓉1.0份、千里光1.0份、大头陈1.0份、当归1.0份、三七1.0份、肿节风1.0份、 鸡骨香1.0份、砂仁0.55份、独活0.55份、羌活0.55份、姜皮0.55份、陈 皮0.55份、香附0.5份、野菊花0.5份、桂枝0.5份、小罗伞0.5份、蔓荆 子0.5份、桔梗0.5份、紫珠叶0.5份、地胆草0.5份、细辛0.5份、五指柑 0.5份、肉豆蔻0.5份、木防己0.5份、三叉苦0.5份、地稔0.5份、防风0.5 份、半枝莲0.5份、铁包金0.5份、柴胡0.5份、飞天蠄蟧0.5份、鸡骨草0.5 份、荆芥0.5份、虎杖0.5份、钩藤0.5份、一枝黄花0.45份、白花灯笼0.43 份、白花蛇舌草0.43份、石仙桃0.25份、五月艾0.25份、皂角刺0.25份、 木香0.25份、山芝麻0.25份、益母草0.25份、紫苏叶0.25份、倒扣草0.25 份、侧柏叶0.25份、鱼腥草0.25份。
本实施例的预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物为外用制剂，制备方法 包括如下步骤：将茶油提取物与其他各组分混合搅拌均匀，静置5天，取澄清 液，加2倍体积的茶油稀释即得。
实施例4
本实施例提供了罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状 病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，所述药物为外用制剂， 其中，罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑40份、水杨酸甲酯300份、 松节油110份、薄荷素油300份、丁香罗勒油20份、樟油200份、八角茴香 油30份、肉桂油30份、冰片4份、薄荷脑35份、桉油50份、茶油提取物120 份。
而茶油提取物从茶油组合物中提取制得，具体的，是将茶油组合物粉碎成 粗粉，过30目筛，混匀后加入4倍体积的茶油，于55℃浸渍14天，趁热过滤， 滤液静置冷却至室温，得到茶油提取物。
所述茶油组合物包含以下重量份的组分：卷柏1.0份、鹅不食草1.0份、 水芙蓉1.0份、辛夷1.0份、山白芷0.5份、徐长卿1.0份、山银花0.5份、 救必应0.5份、金不换1.0份、白半枫荷0.5份、荜澄茄0.5份、麻黄0.5份、 重楼0.25份、人字草0.25份、金线风0.25份、金耳环0.25份、一朵云0.25 份、吊黄0.25份、两面针1.0份、九里香1.0份、红花1.0份、水芙蓉1.0份、千里光1.0份、大头陈1.0份、当归1.0份、三七1.0份、肿节风1.0份、 鸡骨香1.0份、砂仁0.55份、独活0.55份、羌活0.55份、姜皮0.55份、陈 皮0.55份、香附0.5份、野菊花0.5份、桂枝0.5份、小罗伞0.5份、蔓荆 子0.5份、桔梗0.5份、紫珠叶0.5份、地胆草0.5份、细辛0.5份、五指柑 0.5份、肉豆蔻0.5份、木防己0.5份、三叉苦0.5份、地稔0.5份、防风0.5 份、半枝莲0.5份、铁包金0.5份、柴胡0.5份、飞天蠄蟧0.5份、鸡骨草0.5 份、荆芥0.5份、虎杖0.5份、钩藤0.5份、一枝黄花0.45份、白花灯笼0.43 份、白花蛇舌草0.43份、石仙桃0.25份、五月艾0.25份、皂角刺0.25份、 木香0.25份、山芝麻0.25份、益母草0.25份、紫苏叶0.25份、倒扣草0.25 份、侧柏叶0.25份、鱼腥草0.25份。
本实施例的预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物为外用制剂，制备方法 包括如下步骤：将茶油提取物与其他各组分混合搅拌均匀，静置5天，取澄清 液，加2倍体积的茶油稀释即得。
实施例5
本实施例提供了罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状 病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，所述药物为外用制剂， 其中，罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑28份、水杨酸甲酯250份、 松节油95份、薄荷素油250份、丁香罗勒油15份、樟油160份、八角茴香油 25份、肉桂油25份、冰片3份、薄荷脑30份、桉油45份、茶油提取物110 份。
而茶油提取物从茶油组合物中提取制得，具体的，是将茶油组合物粉碎成 粗粉，过30目筛，混匀后加入3倍体积的茶油，于55℃浸渍14天，趁热过滤， 滤液静置冷却至室温，得到茶油提取物。
所述茶油组合物包含以下重量份的组分：卷柏1.0份、鹅不食草1.0份、 水芙蓉1.0份、辛夷1.0份、山白芷0.5份、徐长卿1.0份、山银花0.5份、 救必应0.5份、金不换1.0份、白半枫荷0.5份、荜澄茄0.5份、麻黄0.5份、 重楼0.25份、人字草0.25份、金线风0.25份、金耳环0.25份、一朵云0.25 份、吊黄0.25份、两面针1.0份、九里香1.0份、红花1.0份、水芙蓉1.0份、千里光1.0份、大头陈1.0份、当归1.0份、三七1.0份、肿节风1.0份、 鸡骨香1.0份、砂仁0.55份、独活0.55份、羌活0.55份、姜皮0.55份、陈 皮0.55份、香附0.5份、野菊花0.5份、桂枝0.5份、小罗伞0.5份、蔓荆 子0.5份、桔梗0.5份、紫珠叶0.5份、地胆草0.5份、细辛0.5份、五指柑 0.5份、肉豆蔻0.5份、木防己0.5份、三叉苦0.5份、地稔0.5份、防风0.5 份、半枝莲0.5份、铁包金0.5份、柴胡0.5份、飞天蠄蟧0.5份、鸡骨草0.5 份、荆芥0.5份、虎杖0.5份、钩藤0.5份、一枝黄花0.45份、白花灯笼0.43 份、白花蛇舌草0.43份、石仙桃0.25份、五月艾0.25份、皂角刺0.25份、 木香0.25份、山芝麻0.25份、益母草0.25份、紫苏叶0.25份、倒扣草0.25 份、侧柏叶0.25份、鱼腥草0.25份。
本实施例的预防或治疗呼吸系统感染性疾病的药物为外用制剂，制备方法 包括如下步骤：将茶油提取物与其他各组分混合搅拌均匀，静置5天，取澄清 液，加2倍体积的茶油稀释即得。
效果实施例：
实施例6：罗浮山百草油对冠状病毒OC43的作用研究
1实验材料
1.1实验药物
罗浮山百草油(实施例1)，批号：L20G041，由广东罗浮山国药股份有限 公司提供。
1.2细胞/毒株
人结直肠腺癌细胞(HRT18细胞)，人肺癌细胞(A549细胞)置于液氮保 存，复苏后使用RPMI 1640培养基培养(含有10％胎牛血清，1％青霉素、1％链 霉素)。
冠状病毒：Human coronavirus OC43株受赠于广州医科大学杨子锋教授， 病毒于-80℃冰箱中保存。所有病毒实验于南方医科大学药学院生物安全二级 实验室开展。
2实验方法
2.1药物配制方法
实验中罗浮山百草油使用吐温-20按照1：1的比例均匀混合后，使用PBS 稀释10倍作为母液，实验时使用相应培养基稀释至所需浓度。实验过程中考 虑到吐温的影响，使用茶油：吐温-20按照1：1的比例均匀混合后，使用PBS 稀释10倍作为母液，实验时使用相应培养基稀释至吐温-20的浓度为100 μg/mL加入正常组、病毒组。
2.2药物毒性实验
将生长状态较好的HRT18细胞以及A549细胞以2×104个/孔均匀接种于 96孔板中，在5％CO2，37℃的条件下培养24h至细胞单层铺满；使用不含有 血清的培养基对罗浮山百草油及其组分从400μg/mL开始进行2倍梯度稀释， 以每孔100μL加入到96孔板中，设置只加培养基的细胞对照组，在5％CO2， 37℃条件下培养72h；
弃去培养上清液，向96孔板中每孔加入100μL的MTT溶液(0.5mg/mL)， 在5％CO2，37℃中继续培养4h，于显微镜下观察是否活细胞中出现紫色结晶 沉淀，轻轻吸弃上清液，后加入150μL DMSO振荡15-20min，溶解紫色结晶； 使用酶标仪在波长570nm波长处检测各个孔的吸光度。
2.3抗病毒实验
将生长状态较好的HRT-18细胞以1×105个/孔均匀接种于24孔板中，在5％CO2，37℃的条件下培养24h至细胞单层铺满；吸弃培养基后使用PBS洗涤 细胞2次，从-80℃冰箱中取出病毒原液置于4℃溶化，使用不含有血清的培养 基将病毒稀释到所需滴度100倍TCID50，向每孔加入400μL病毒液，于5％CO2， 37℃的条件下培养1h；弃去病毒溶液，换为含不同浓度罗浮山百草油的培养 基，继续在5％CO2，37℃条件下培养72h，收集细胞备用。
2.4 RT-PCR实验
HRT18细胞吸弃上清，使用RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA；使用2720 ThermalCycler PCR仪将已知浓度的RNA逆转录成cDNA使用LightCycler480 RT-PCR仪检测细胞中IP-10、IL-1β、IL-6、mRNA的表达情况。
2.5统计方法
RT-PCR结果采用2-ΔΔCt法计算，组间采用单因素方差分析，以P<0.05为 差异具有统计学意义。
3实验结果
3.1罗浮山百草油的细胞毒性
本实验检测了罗浮山百草油对HRT18细胞以及A549细胞的细胞毒性，结 果发现，对于A549细胞，罗浮山百草油在100μg/mL及以下没有明显细胞毒 性，对于HRT18细胞，罗浮山百草油在50μg/mL及以下没有明显细胞毒性， 结果如图1所示。
3.2罗浮山百草油对冠状病毒OC43的抑制作用
冠状病毒OC43感染HRT18细胞72小时后，细胞内可检测到大量病毒量基 因(冠状病毒OC43株NP基因)，给予罗浮山百草油25μg/mL及50μg/mL 两个剂量后，细胞内的病毒量均有明显减少，结果如图2所示。
3.3罗浮山百草油对冠状病毒OC43引起细胞因子表达的抑制作用
冠状病毒感染HRT18细胞72h后，细胞内IL-1β，IL-6以及IP-10的表 达明显升高，给与罗浮山百草油25μg/mL及50μg/mL两个剂量后，细胞内 IL-1β，IL-6以及IP-10的表达均有明显减少，结果如图3所示。
4实验结论
罗浮山百草油可有效抑制冠状病毒OC43株在HRT18细胞内的复制，可抑 制病毒引起的IL-1β，IL-6以及IP-10mRNA的表达，表明罗浮山百草油在体 外能够有效抑制冠状病毒OC43感染。
实施例7：罗浮山百草油对新冠病毒SARS-Cov-2的作用研究
1实验样品
罗浮山百草油(实施例2)，6mL装，生产批号：L20F301；药物制剂对 照，均由广东罗浮山国药股份有限公司提供。
储存方法：常温避光保存，使用时，按照50μL药物+50μL Tween-20+900 μL的PBS配制，浓度为50μL/mL。
2实验材料
1)细胞系：Vero细胞，本实验室保存；
2)病毒株：新冠病毒SARS-CoV-2本实验委托中国疾病预防控制中心病毒 预防控制所完成；
3)阳性对照药物：瑞德西韦(吉利德公司)；
3试验设计
3.1罗浮山百草油对细胞毒性的测定
1)提前一天接种Vero细胞于96孔板中，每孔约2×104个(96孔板最外 侧孔加入PBS，不作为试验孔)。
2)观察细胞状态，达到90％时，将罗浮山百草油用含2％FBS的DMEM培养 基进行不同浓度的稀释(设置浓度为0.5/0.25/0.125/0.063/0.031μL/mL)； 药物制剂对照也按照相同浓度设置。
3)以100μL/孔加至细胞板中，每个浓度设置3个重复；同时设置对照 组和空斑组，放置与37℃，5％CO2的培养基中培养。
4)于药物加入后48h，在细胞培养基中加入1/10体积的CCK8试剂，充 分混合，避免产生气泡。于37℃中培养约1h至颜色变为橙色，以空白组调零， 用多功能酶标仪读取在450nm处的吸收光，按照下列公式进行计算：存活率 (％)＝加药组OD450/对照组OD450×100％，用Graphpad 5.0软件计算药物的CC50值。
3.2罗浮山百草油对新冠病毒SARS-CoV-2的抑制效果评价
在Vero细胞模型上进行抗病毒活性测定，每次试验设置3个复孔，根据 罗浮山百草油在Vero细胞上的细胞毒性，设置药效学的药物浓度分别为 0.25/0.125/0.0625/0.031/0.0156μL/mL浓度。
于96孔接种Vero细胞(2×104个细胞/孔)中，以37℃，5％CO2条件下 培养24小时。在病毒感染前1h，将罗浮山百草油和药物制剂对照配制为 0.25/0.125/0.0625/0.031/0.0156μL/mL浓度，100μL/孔至细胞中孵育。 再加入病毒(感染复数，MOI为0.01)感染细胞1小时，吸去病毒，DMEM培养 基洗一次，再将罗浮山百草油、药物制剂对照(0.25/0.125/0.063/0.031/0.016 μL/mL)和阳性对照药物瑞德西韦(50/10/2/0.4/0.08μM)，加入至细胞中。 孵育培养48小时后，拍照记录细胞病变情况。
收集100μL细胞上清液，并在裂解缓冲液中裂解灭活病毒，以进行进一 步试验。取收集灭活的100μL细胞培养上清液，使用西安天隆科技有限公司 的病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。RNA在70μL无核糖核酸酶的水中洗脱。 使用带有gDNA Eraser的逆转录试剂盒进行逆转录，并在带有TB Green Premix Ex Taq II的StepOne Plus Real-time PCR系统上进行qRT-PCR(Taqman探针 法)。使用GraphPad
Figure BDA0003323714140000131
5.0软件绘制病毒RNA拷贝相对于药物浓度的剂 量反应曲线，重复试验3次。
计算每种浓度下的药物抑制率。抑制率(％)＝1-试验组病毒RNA拷贝数/ 不含药物组病毒RNA拷贝数×100％。
4实验结果
4.1罗浮山百草油对Vero细胞的半数毒性浓度(CC50)
表1，罗浮山百草油的细胞毒性试验结果
Figure BDA0003323714140000132
4.2罗浮山百草油在Vero细胞中抑制新冠病毒SARS-CoV-2的效果评价
依据罗浮山百草油在Vero细胞中的细胞毒性，药物组总共设置5组，浓 度分别为0.25、0.125、0.0625、0.031、0.0156μL/mL，共5组，每组设置 3个复孔，重复3次试验；药物制剂对照设置同罗浮山百草油。
在Vero细胞中，以不同药物浓度作用于Vero细胞，感染后48h，阳性药 物瑞德西韦在50、10、2μM均未见显著细胞病变效应(cytopathic effect， CPE)，0.4和0.08μM有明显CPE出现，与文献报道基本相符。药物制剂对 照组可见显著的CPE，罗浮山百草油组在较低亦可观察到CPE，与瑞德西韦变 化趋势一致，见图4。
收集各组细胞上清，进行核酸提取、荧光定量PCR检测病毒的拷贝数，计 算药物的抑制率，绘制抑制率和浓度作用图，结果显示对照药物瑞德西韦组(图 5)，有显著的抗新冠病毒活性(EC50＝0.8μM)；罗浮山百草油药物处理组抑 制病毒药效如图6，药物制剂对照组没有明显抑制新冠病毒SARS-CoV-2的活性； 罗浮山百草油在0.25μL/mL浓度时，抑制新冠病毒SARS-CoV-2的活性约为 50％，即其EC50≈0.25μL/mL。
5实验结论
体外抗新冠病毒SARS-CoV-2药效学研究中，对照组药物瑞德西韦在Vero 细胞模型中，有显著的抗病毒作用，其EC50＝0.8μM，与文献报道的抗病毒效 果相符。药物制剂对照组对Vero细胞的CC50为0.19μL/mL，没有抗新冠病毒 效果。试验组药物罗浮山百草油对Vero细胞的CC50为0.38μL/mL，在0.25 μL/mL浓度时，抑制新冠病毒SARS-CoV-2的活性约为50％，即其EC50约为0.25 μL/mL，SI约为1.52。上述结果表明表明罗浮山百草油在体外能够有效抑制 新冠病毒SARS-CoV-2感染。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发 明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及 其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑20-40份、水杨酸甲酯200-300份、松节油80-110份、薄荷素油200-300份、丁香罗勒油10-20份、樟油100-200份、八角茴香油10-30份、肉桂油10-30份、冰片2-4份、薄荷脑20-35份、桉油30-50份、茶油提取物40-120份。
2.根据权利要求1所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑25-30份、水杨酸甲酯240-280份、松节油90-100份、薄荷素油220-300份、丁香罗勒油11-18份、樟油120-180份、八角茴香油14-20份、肉桂油15-25份、冰片2-3份、薄荷脑25-30份、桉油35-45份、茶油提取物60-100份。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑25份、水杨酸甲酯240份、松节油90份、薄荷素油220份、丁香罗勒油11份、樟油120份、八角茴香油14份、肉桂油15份、冰片2份、薄荷脑25份、桉油35份、茶油提取物60份；或者，所述罗浮山百草油包含以下重量份的组分：樟脑30份、水杨酸甲酯280份、松节油100份、薄荷素油300份、丁香罗勒油18份、樟油180份、八角茴香油20份、肉桂油25份、冰片3份、薄荷脑30份、桉油45份、茶油提取物100份。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述茶油提取物从茶油组合物中提取制得，所述茶油组合物包含以下重量份的组分：卷柏1.0份、鹅不食草1.0份、水芙蓉1.0份、辛夷1.0份、山白芷0.5份、徐长卿1.0份、山银花0.5份、救必应0.5份、金不换1.0份、白半枫荷0.5份、荜澄茄0.5份、麻黄0.5份、重楼0.25份、人字草0.25份、金线风0.25份、金耳环0.25份、一朵云0.25份、吊黄0.25份，所述茶油提取物是将茶油组合物粉碎成粗粉，混匀后加入茶油，浸渍10-30天，过滤，即得所述茶油提取物。
5.根据权利要求4所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述茶油组合物还包括以下重量份的组分：两面针1.0份、九里香1.0份、红花1.0份、水芙蓉1.0份、千里光1.0份、大头陈1.0份、当归1.0份、三七1.0份、肿节风1.0份、鸡骨香1.0份、砂仁0.55份、独活0.55份、羌活0.55份、姜皮0.55份、陈皮0.55份、香附0.5份、野菊花0.5份、桂枝0.5份、小罗伞0.5份、蔓荆子0.5份、桔梗0.5份、紫珠叶0.5份、地胆草0.5份、细辛0.5份、五指柑0.5份、肉豆蔻0.5份、木防己0.5份、三叉苦0.5份、地稔0.5份、防风0.5份、半枝莲0.5份、铁包金0.5份、柴胡0.5份、飞天蠄蟧0.5份、鸡骨草0.5份、荆芥0.5份、虎杖0.5份、钩藤0.5份、一枝黄花0.45份、白花灯笼0.43份、白花蛇舌草0.43份、石仙桃0.25份、五月艾0.25份、皂角刺0.25份、木香0.25份、山芝麻0.25份、益母草0.25份、紫苏叶0.25份、倒扣草0.25份、侧柏叶0.25份、鱼腥草0.25份。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述冠状病毒选自SARS-Cov-2(2019-nCov)、SARS-CoV、HCoV 229E、NL63、OC43、HKU1或MERS-CoV，所述药物具有抑制或杀灭冠状病毒的作用。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述呼吸系统感染性疾病选自上呼吸道感染或下呼吸道感染。
8.根据权利要求7所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于：所述上呼吸道感染选自：鼻炎、扁桃体炎或咽喉炎，所述下呼吸道感染选自：支气管炎、病毒性肺炎、新冠肺炎、严重急性呼吸综合征或中东呼吸综合征。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述药物为外用制剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的罗浮山百草油在制备预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染引起的呼吸系统感染性疾病的药物中的用途，其特征在于，所述药物的给药方式为吸入或穴位涂擦。
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