CN113973818A

CN113973818A - 白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉中的应用

Info

Publication number: CN113973818A
Application number: CN202111306900.5A
Authority: CN
Inventors: 孔庆军; 任雪艳; 李祎晗; 曾庆梽
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN113973818B

Abstract

本发明属于扩展青霉抑制技术领域，涉及一种白藜芦醇及其衍生物在抑制扩展青霉中的应用，应用为白藜芦醇及其衍生物在抑制扩展青霉菌丝生长中、在抑制扩展青霉孢子萌发中、在破坏扩展青霉细胞壁和细胞膜中、在诱导扩展青霉孢子ROS生成中的应用。本发明通过白藜芦醇及其衍生物能最大限度的抑制扩展青霉的生成，且安全无毒，操作便捷，适用于各种扩展青霉的场合中。

Description

白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉中的应用

技术领域

本发明属于扩展青霉抑制技术领域，涉及一种白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉中的应用。

背景技术

真菌等病害会导致采后果蔬的腐烂变质，产生巨大的经济损失。其中扩展青霉菌对果蔬具有很强的感染性。扩展青霉Penicilliumexpansum，其菌落小斑点状，草绿色；背面肉桂色，中央有红色的小点；分生孢子梗长达500微米以上，壁光滑或稍粗糙，帚状分布1-2次；间枝3-6个，(10-15)微米×(2.2-3.0)微米；小梗5-8个，(8-12)微米×3微米；分生孢子呈链状着生于小梗上，椭圆形至亚球形，光滑，长径33.5微米。

扩展青霉易侵染柑橘、苹果、猕猴桃和梨等水果，其产生的青霉素，可加剧青霉的侵染,尤其是苹果，主要危害近成熟及成熟期的果实，也是苹果运输和贮藏期的一种重要病害；并且当发生霉变时，扩展青霉产生的展青霉素会产生引起动物的胃肠道功能紊乱，肾脏水肿等病症，并且因为展青霉素与细胞膜的结合过程是不可逆的，会对细胞造成长期的损伤，甚至有致癌的可能，即使切除苹果的霉变部分，但是霉菌产生的展青霉素可以扩散到果实的其他部位。此外，扩展青霉易随果蔬进入各加工环节，危害人体健康。因此，要对扩展青霉进行抑制防止其带来的危害。

现有抑制扩展青霉的方法有化学药物、生物防治、物理辐射等，化学杀菌剂防治方法因价格低廉、操作方便等特点，被应用于控制果实采后青霉病，其中，水杨酸、噻菌灵、柠檬酸、嘧霉胺、丙酸钠等最为常用。化学杀菌剂的长期使用会引起扩展青霉抗药性增加，且化学残留会影响果蔬品质。存在的问题在于其安全性低，毒性大，成本高，环境污染，处理条件苛刻，处理方法受到环境限制等。所以，研究者们研发新的物质和方法来抑制扩展青霉的生长。芪类化合物作为一类重要的天然多酚，经研究发现在抑菌方面有很好的生物活性，与果蔬生长发育过程中的抗病性密切相关。当植物体受到环境刺激物，包括紫外线(UV)辐射、化学毒素、真菌和细菌感染时，芪类化合物作为植保素会在植物体内积累以防止植物体受到损伤，被认为是一种潜在的、安全的、高效的化学药剂的替代。

发明内容

针对现有扩展青霉抑制方法存在的问题，本发明提供一种白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉中的应用，通过白藜芦醇或其衍生物能最大限度的抑制扩展青霉的生成，且安全无毒，操作便捷，适用于各种扩展青霉的场合中。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉中的应用。

进一步的，所述白藜芦醇衍生物为紫檀芪。

进一步的，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉菌丝生长中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥1.6mmol/L。

进一步的，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉孢子萌发中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥0.8mmol/L。

进一步的，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在破坏扩展青霉细胞壁中的应用。

进一步的，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在诱导扩展青霉孢子ROS生成中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥0.8mmol/L。

进一步的，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在加快扩展青霉菌遗传物质分解中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥0.4mmol/L。

进一步的，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在破坏扩展青霉细胞膜中的应用。

进一步的，所述扩展青霉为Penicilliumexpansum。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过白藜芦醇或白藜芦醇衍生物抑制扩展青霉菌丝生长，阻止孢子萌发，诱导孢子中ROS的生长，破坏细胞壁和细胞膜的完整，加快扩展青霉菌遗传物质的分解，从而加大的抑制扩展青霉的生成，找到了一种抑制扩展青霉的新途径。

2、本发明采用的抑制原料为白藜芦醇或者其衍生物，安全无毒，操作便捷，适用于各种扩展青霉的场合中。

3、本发明在抑制扩展青霉过程中，白藜芦醇衍生物选择紫檀芪时，能在较低浓度0.1mmol/L时就表现出抑制活性，且随着浓度升高，抑制明显增强；白藜芦醇在较高浓度时开始有较为明显的抑制活性。

附图说明

图1为白藜芦醇对扩展青霉菌丝生长抑制的曲线图；

图2为紫檀芪对扩展青霉菌丝生长抑制的曲线图；

图3为白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉菌丝生长的抑制菌落示意图；

图4为白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉孢子萌发的显微镜示意图；

图5为白藜芦醇对扩展青霉细胞壁的破坏结果示意图；

图6为紫檀芪对扩展青霉细胞壁的破坏结果示意图；

图7为白藜芦醇对扩展青霉中ROS生长的抑制曲线图；

图8为紫檀芪对扩展青霉中ROS生长的抑制曲线图；

图9为白藜芦醇对扩展青霉孢子中的遗传物质分解趋势示意图；

图10为紫檀芪对扩展青霉孢子中的遗传物质分解趋势示意图；

图11为白藜芦醇对扩展青霉的细胞膜破坏结果示意图。

图12为紫檀芪对扩展青霉的细胞膜破坏结果示意图。

具体实施方式

现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。

本发明利用白藜芦醇或者白藜芦醇衍生物对扩展青霉进行抑制。

本发明抑制扩展青霉时，主要表现在对扩展青霉菌丝生长和孢子萌发的抑制，诱导孢子中ROS的生长，破坏细胞壁和细胞膜的完整，加快扩展青霉菌遗传物质的分解，从而达到对扩展青霉最大限度的抑制作用。

本发明采用的白藜芦醇(3-4'-5-trihydroxystilbene)是一种非黄酮类多酚化合物，其化学名称为3,4',5-三羟基-1,2-二苯基乙烯(3,4',5-芪三酚)，分子式为C₁₄H₁₂O₃，分子量为228.25。白藜芦醇的纯品外观为白至淡黄色粉末，无味，难溶于水，易溶于乙醚、三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素，可在葡萄叶及葡萄皮中合成，是葡萄酒和葡萄汁中的生物活性成分。口服容易吸收，代谢后通过尿液及粪便排出。体外实验及动物实验表明，白藜芦醇有抗氧化、抗炎、抗癌及心血管保护等作用。

本发明采用的白藜芦醇衍生物为紫檀芪。

本发明采用的紫檀芪，别名3,5-二甲氧基-4'-羟基二苯乙烯、(E)-3,5-二甲氧基-4'-羟基苯乙烯、(E)-4-[2-(3,5-二甲氧基苯基)-乙烯基]-苯酚和4-[(1E)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-乙烯基]-苯酚，是一种来源于紫檀、蓝莓、葡萄和花榈木等植物的有效成分。紫檀芪为白色或类白色粉末结晶，有着丰富的药用价值，是血竭制品中抗真菌活性成分，属多羟基二苯乙烯类化合物，为白藜芦醇的同系物，其药理作用除与白藜芦醇有部分相似之外，还具有较强的抗真菌活性；有抗癌、抗炎、抗氧化和镇痛剂的作用，对于癌症，高血压，高血脂的治疗都有一定的效果。

下面以白藜芦醇及其衍生物对扩展青霉的具体抑制进行说明。

实施时，扩展青霉为Penicilliumexpansum。保藏编号CCTCC 20111515，购自中国典型微生物培养中心。

实施时，白藜芦醇及其衍生物紫檀芪购自南京源植生物科技有限公司(纯度>98％)。

实施例1白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉菌丝生长的影响

取出购买贮藏的扩展青霉菌菌种，用接种环挑取扩展霉粉末在PDA培养基上划线活化，于28℃下培养5d后，用含0.1％(v/v)吐温20的无菌水冲洗活化培养的扩展青霉孢子，得到扩展青霉孢子悬浮液，用血球计数板计数，用备好的无菌水将悬浮液浓度为调至1×10⁷spores/mL。取10份50mL PDA培养基，将其分为两组，在40℃左右，在第一组的5份培养基中分别加入500μL白藜芦醇，使白藜芦醇的终浓度C1对应0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol/L，在第二组的5份培养基中分别加入500μL紫檀芪，使得紫檀芪C2终浓度对应为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol/L,白藜芦醇与紫檀芪均用1mL的DMSO溶解；

然后倒入到平板中待其凝固后，吸取5μL的1×10⁷spores/mL扩展青霉孢子悬浮液滴在平板中心，用封口膜封口，在28℃下培养5d。在CK组(CK组为含5μL的1×10⁷spores/mL扩展青霉孢子的溶液)中加入等体积的DMSO作为空白对照。每个处理做三个重复。十字交叉法测量菌落直径。白藜芦醇和紫檀芪两种化合物对扩展青霉菌丝生长的影响结果如图1和图2所示。

由于，实验数据均以平均值±标准差来表示，图1和图2中误差棒即为标准差，上方的字母a、b、c、d等代表显著性差异，对最终结果不产生影响。

参见图1和图2，两种化合物对扩展青霉的抑制作用存在显著差异。其中，紫檀芪对扩展青霉菌丝生长的抑制效果随着浓度的增加而增加，培养五天时浓度为0.1mmol/L的紫檀芪即表现出一定的抑制效果，0.4mmol/L时抑制效果显著增加；而白藜芦醇对扩展青霉的抑制效果较差，在浓度低于0.8mmol/L时内对扩展青霉菌丝生长几乎没有影响，在1.6mmol/L时开始有较为明显的抑制效果；低浓度白藜芦醇对扩展青霉菌丝的生长没有显著影响。

实施例2白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉孢子萌发的影响

取10份50mL PDA培养基，将其分为两组，在40℃左右，在第一组的5份培养基中分别加入500μL白藜芦醇，使白藜芦醇C1的终浓度对应0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol/L；在第二组的5份培养基中分别加入500μL紫檀芪，使得紫檀芪C2终浓度对应为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol/L；

然后将上述含有不同浓度白藜芦醇和紫檀芪的PDA培养基，分别涂在无菌的载玻片上，待其凝固后，吸取20μL的1×10⁷spores/mL扩展青霉孢子悬浮液(实施例1中制得的)分别滴加到培养基上。在28℃下培养10h后用光学显微镜观察孢子萌发情况。结果如图3和图4所示。

参见图3和图4，白藜芦醇浓度C1低于0.8mmol/L时对扩展青霉分生孢子萌发无明显的抑制作用，白藜芦醇浓度C1为1.6mmol/L时，扩展青霉分生孢子萌发率降低，芽管长度也明显变短；而紫檀芪对扩展青霉孢子萌发的抑制作用随浓度的增加而增强，且当浓度为1.6mmol/L时，紫檀芪完全抑制了扩展青霉孢子的萌发。同时，紫檀芪的处理不仅抑制了扩展青霉孢子的萌发，而且芽管长度也明显变短。

实施例3白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉细胞壁完整性的影响

先取100μL的1×10⁷spores/mL扩展青霉孢子悬浮液(实施例1中制得的)，接种至准备好的灭菌的PDB液体培养基中培养24h，然后均等分开多份，分别按比例对应加入白藜芦醇和紫檀芪溶液，使白藜芦醇的终浓度C1和紫檀芪的终浓度C2均分别为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol/L，同时设置空白组(即CK组为含5μL的1×10⁷spores/mL扩展青霉孢子的溶液)，空白组中只加入1mL的DMSO溶液。在摇床中培养12h后，按照AKP碱性磷酸酶试剂盒的要求测定。结果如图5和图6所示。由于，实验数据均以平均值±标准差来表示，图5和图6中误差棒即为标准差，上方不同字母a、b、c、d等代表显著性差异，对最终结果不产生直接影响。

参见图5和图6，当细胞膜或细胞壁破坏后，细胞透性增加，存在细胞膜与细胞壁之间的碱性磷酸酶会大量渗透到细胞外。分别加入一定比例的白藜芦醇和紫檀芪后，在多功能微孔板酶标仪下测得的AKP的吸光度值都有一定的增加，且随着化合物浓度升高，吸光度值也逐渐增加，表明随着化合物浓度的增加，渗透的出的AKP逐渐增多，表明两种化合物都对扩展青霉的细胞壁有一定的破坏作用，且随着浓度最大，破坏效果增强。

实施例4白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉ROS含量的影响

将白藜芦醇和紫檀芪分别按照实施例2中的浓度，加入PDA培养基中，倒入平板待凝固后，加入扩展青霉培养5d后。用0.1％(v/v)吐温20的无菌水冲洗孢子，200目细胞筛过滤，制备得不同处理下的孢子悬浮液。磷酸缓冲液冲洗三次，在4℃，8000rpm下离心2min取沉淀，用0.5μL ROS染液4℃避光染色30min，染色结束后用磷酸缓冲液冲洗三遍，洗去染液，在荧光倒置显微镜下观察荧光，用微孔板酶标仪检测荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为617nm。结果如图7和图8所示。由于，实验数据均以平均值±标准差来表示，图7和图8中误差棒即为标准差，上方不同字母a、b、c、d等代表显著性差异，对最终结果不产生直接影响。

参见图7和图8，白藜芦醇和紫檀芪处理后对扩展青霉孢子ROS生成有明显差异，扩展青霉孢子受到白藜芦醇及紫檀芪刺激，体内的氧化应激作用增强，ROS含量增加。空白组孢子荧光强度弱，活性氧生成量少；处理组中活性氧含量增多发出明显荧光，且紫檀芪处理后孢子生成大量活性氧，孢子的荧光强度大于白藜芦醇处理组。在浓度低于0.8mmol/L时白藜芦醇对扩展青霉中ROS的诱导效果较弱，而紫檀芪随浓度的升高，能明显的诱导扩展青霉中ROS的生成。

实施例5白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉遗传物质的影响

将白藜芦醇和紫檀芪按上述浓度加入PDA培养基中(配制方法可参见实施例2)，倒入平板待凝固后，加入扩展青霉培养5d后。用0.1％(v/v)吐温20的无菌水冲洗孢子，200目细胞筛过滤，制备得不同处理下的孢子悬浮液，磷酸缓冲液冲洗三次除去抑菌物质，在4℃，12000rpm下离心2min取沉淀，用0.5μL AO染液4℃避光染色10min，染色结束后用磷酸缓冲液冲洗三遍，在荧光倒置显微镜下观察荧光，用微孔板酶标仪检测荧光强度，样品激发波长为488nm，发射波长为515nm。结果如图9和图10所示。由于，实验数据均以平均值±标准差来表示，图9和图10中误差棒即为标准差，上方不同字母a、b、c、d等代表显著性差异，对最终结果不产生直接影响。

参见图9和图10所示，两种化合物处理后，DNA降解程度有明显差异，孢子在受到外界胁迫时致使DNA双链解旋变为单链与吖啶橙结合发出明亮绿色荧光。对照组中孢子荧光强度弱，荧光孢子数目较少，表明孢子中DNA降解量少；而紫檀芪处理后扩展青霉孢子发出明显荧光DNA降解增多同时荧光孢子数与浓度呈线性关系，且浓度为0.8mmol/L处理组比浓度为1.6mmol/L处理组中的荧光孢子数要少；当白藜芦醇浓度大于0.4mmol/L处理后，扩展青霉孢子荧光数目明显变多，但孢子荧光孢子强度低于紫檀芪处理。

实施例6白藜芦醇和紫檀芪对扩展青霉细胞膜的影响

先取100μL准备好的的1×10⁷spores/mL扩展青霉孢子悬浮液(实施例1中制得的)，接种至准备好的灭菌的PDB液体培养基中培养24h，然后均等分开多份，分别按比例对应加入白藜芦醇和紫檀芪溶液，使白藜芦醇的终浓度C1和紫檀芪的终浓度C2均分别为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mmol/L，同时设置空白组(CK组为含100μL的1×10⁷spores/mL扩展青霉孢子的溶液)，空白组中只加入1mL的DMSO溶液。在摇床中培养12h后，200目细胞筛过滤，磷酸缓冲液冲洗三次除去残留的白藜芦醇和紫檀芪，在4℃，8000rpm下离心5min取沉淀，用0.5μLPI染液4℃避光染色30min，染色结束后用磷酸缓冲液冲洗三遍。微孔板酶标仪检测荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为617nm。荧光倒置显微镜参数：10×平场荧光物镜，视野数为25mm，N.A0.32；40×超级荧光物镜，N.A0.60；明场为单色高灵敏度SCMOS显微镜摄像头；荧光场为彩色高像素显微镜摄像头；滤块为可透过红光波块。结果如图11和图12所示。由于，实验数据均以平均值±标准差来表示，图11和图12中误差棒即为标准差，上方不同字母a、b、c、d等代表显著性差异，对最终结果不产生直接影响。

参见图11和图12，紫檀芪和白藜芦醇处理扩展青霉孢子后PI染色荧光强度存在明显的差异，紫檀芪对扩展青霉的作用效果明显强于白藜芦醇。PI染色的荧光强度变强，表明扩展青霉孢子膜受到一定程度的破损，在抑菌物质的处理下导致细胞膜的破裂。低浓度的白藜芦醇对扩展青霉细胞膜没有表现出破坏作用，而紫檀芪表现出很好的破坏效果。

综上所述，紫檀芪对扩展青霉菌丝生长和孢子萌发的抑制效果最强，白藜芦醇的抑制效果较差。在抑制扩展青霉菌丝生长方面，紫檀芪在较低浓度0.1mmol/L时就表现出抑制活性，且随着浓度升高，抑制明显增强，白藜芦醇效果较弱，低浓度时无明显抑制效果；两者都表现出一定的抑制孢子萌发的能力，紫檀芪效果更显著，能在抑制孢子萌发的同时，抑制芽管的长度。

经紫檀芪和白藜芦醇处理后，扩展青霉AKP，AO染色，PI染色的结果显示，两种化合物对扩展青霉的细胞壁和细胞膜都造成了一定的破坏，且紫檀芪的破坏效果最强，而白藜芦醇在低浓度是无明显作用。同时对两种化合物处理后，扩展青霉中ROS的含量进行了测定，发现处理后ROS的含量明显增加，两种物质诱导ROS生成，氧化应激作用增强，对扩展青霉细胞结构造成严重损害，抑制扩展青霉的生成。

Claims

1.一种白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白藜芦醇衍生物为紫檀芪。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉菌丝生长中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥1.6mmol/L。

4.根据如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在抑制扩展青霉孢子萌发中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥0.8mmol/L。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在破坏扩展青霉细胞壁中的应用。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在诱导扩展青霉孢子ROS生成中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥0.8mmol/L。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在加快扩展青霉菌遗传物质分解中的应用；所述白藜芦醇的终浓度C1≥0.4mmol/L。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为白藜芦醇或白藜芦醇衍生物在破坏扩展青霉细胞膜中的应用。

9.根据权利要求1-8任一项所述的应用中，其特征在于，所述扩展青霉为Penicilliumexpansum。