CN113933501A - 一种免疫磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents

一种免疫磁珠及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113933501A
CN113933501A CN202111319980.8A CN202111319980A CN113933501A CN 113933501 A CN113933501 A CN 113933501A CN 202111319980 A CN202111319980 A CN 202111319980A CN 113933501 A CN113933501 A CN 113933501A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic
core
beads
immunomagnetic
shell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111319980.8A
Other languages
English (en)
Inventor
赵礼义
陈东亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin China Science And Technology Co ltd
Original Assignee
Jilin China Science And Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin China Science And Technology Co ltd filed Critical Jilin China Science And Technology Co ltd
Priority to CN202111319980.8A priority Critical patent/CN113933501A/zh
Publication of CN113933501A publication Critical patent/CN113933501A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开了一种免疫磁珠及其制备方法和应用，该免疫磁珠结构式为A‑CONH‑B或A‑COO‑B或A‑CO‑O‑CO‑B或A‑CO‑B。其中A代表核‑壳结构的磁珠，核为表面功能化的磁性纳米粒子，壳为二氧化硅或带有活泼基团的有机共价化合物或葡萄糖；B代表抗体，是CD45、CD31或CD14中的一种或两种以上任意组合。制备方法包括：1、共沉淀法制备磁性纳米粒子；2、制备表面修饰的磁性纳米粒子：3、COFs包覆磁性纳米粒子；4、化学交联制备免疫磁珠。本发明还提供了该免疫磁珠在CTC检测和分离中的应用。本发明公开的免疫磁珠粒径小、磁响应好、分散稳定性好，对CTC的分离快速、高效。

Description

一种免疫磁珠及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种免疫磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
作为癌细胞的可替代来源，循环肿瘤细胞(CTC)在肿瘤转移的早期检测、预防和生物学机制研究中的重要性受到学界越来越多的关注。CTC是存在于原发肿瘤组织外周血中的肿瘤细胞，其位置、数量是判断肿瘤是否转移的重要参考。因此，CTC检测与分析被认为是许多肿瘤(乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等)的独立预后因素，为患者分期和系统治疗提供重要的临床意义，被称为癌症患者独特的实时“液体活检”。尽管临床上已经提出了相当多的技术来促进检测、分析CTC，但在外周血中CTC的技术仍难以突破瓶颈，实现高敏感准确定量的技术要求。
临床上CTC的检测与分析主要运用磁珠法(磁珠表面吸附的抗体与细胞表面的抗原特异性结合，通过电荷作用将带有磁珠的细胞分离和富集)将全血中的白细胞(包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)分离后，进一步提纯CTC，最后通过荧光染色-荧光原位杂交(i·FISHR CTC)技术检测、分析CTC的形态，而非直接通过磁珠富集血浆中的CTC进行计数和分析，因为强大的磁力会破坏CTC的结构从而无法得到完整结构无法对其进行分型。简单地，利用带有CD45免疫磁珠结合表达CD45抗原的白细胞进行分离，此法可去除大部分表达CD45的白细胞，并将全部类型的CTCs富集分选出来。但是分选后仍存在剩余白细胞中的单核细胞(表达CD14抗原)和离心后残留的少量血小板(表达CD31抗原)，并且磁珠的含磁量不足导致在磁吸附过程中难以将所有磁珠取出，最终剩余的细胞中仅能获得0.01％～1％的CTC。此外，CTC在外周血中的浓度非常低，通常在约109个血细胞(包括红细胞、白细胞和血小板)中仅有数个CTCs，分选(梯度离心)后CTCs与白细胞悬液混在一起，所以通过磁珠法获得CTC的关键是将白细胞的去除率提高至99.9％以上。目前临床上磁珠法可以除去97％的白细胞，相对于CTC在全血中的个数而言仍不能达到理想效果。临床上所用的磁珠法不能完全除去白细胞存在两个问题：1.磁珠的含磁量不够；2.磁珠表面吸附抗体含量低或抗体种类少。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种免疫磁珠，具体地，其结构式为A-CONH-B或A-COO-B或A-CO-O-CO-B或A-CO-B，其中A代表磁珠，B代表抗体，所述磁珠具有典型的核-壳结构，所述核-壳结构中的核为表面功能化的磁性纳米粒子，所述核-壳结构中的壳为二氧化硅或带有活泼基团的有机共价化合物或葡萄糖，所述抗体为CD45、CD31或CD14中的一种或两种以上任意组合。
优选地，所述核-壳结构中的核的粒径为300-1000nm。
优选地，所述核-壳结构中的壳的厚度为300-1000nm，且所述壳的厚度大于所述核的粒径。
优选地，所述带有活泼基团的有机共价化合物上的活泼基团为为羟基、氨基、醛基、硼酸基、卤素、羧基、硝基和氰基中的一种或两种以上的任意组合。
优选地，所述带有活泼基团的有机共价化合物为均苯三甲醛、4-羟基间苯三甲醛、2,5-二羟基对苯二甲醛、2,3-二羟基对苯二甲醛、三醛基间苯三酚、1,3,5-三甲酰基间苯三酚、1,3,5-三氨基苯盐酸盐、1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐、1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐、1,4-二氨基-2,5-二乙烯基苯、对二氨基偶氮苯、三(4-氨基苯基)胺、1,4-苯二硼酸、四(4-硼酸基苯基)乙烯、苯-1,3,5--三基三硼酸、5,5'-二溴-2,2'-联吡啶、4,4',4”-三(溴甲基)三苯胺、4,4',4”-三(溴甲基)三苯胺、1,2,4,5-四羟基苯、1,3,5,7-四羟基金刚烷、2,5-二羟基对苯二磷酸、2,2'-联吡啶-5,5'-二甲醇、四(4-硝基苯基)甲烷、四-(4-硝基苯)乙烯、7,7,8,8-四氰基对苯二醌二甲烷、1,2,4,5-苯四甲腈中的一种或两种以上的任意组合。
优选地，所述核-壳结构中的核的表面功能基团为羟基或羧基中的一种或者两种。
优选地，所述核-壳结构中的核为Fe3O4顺磁性纳米粒子，所述核-壳结构中的壳为带有活泼基团的有机共价化合物。
本发明还提供了上述免疫磁珠的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、磁性纳米粒子的制备：
在氮气保护下，将30mLNH3·H2O加入到二价铁盐和三价铁盐的混合溶液中，搅拌使混合溶液由橙红色逐渐变成黑色，再继续搅拌15min后停止，对混合溶液进行离心操作，使用去离子水反复洗涤至PH＝7后移去上清液，在60℃下真空干燥24h，再超声即得到Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤2、表面修饰的磁性纳米粒子的制备：
将步骤1制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散在去离子水中并超声20min，取5mL分散液并除去分散液中的氧气，向除去氧气的分散液中加入柠檬酸钠后继续超声，使柠檬酸钠和Fe3O4磁性纳米粒子在分散液中混合均匀，保持无氧的条件下，加热60℃并机械搅拌1h后结束反应。用钕铁硼磁铁进行磁分离，用去离子水洗涤去除多余的拧檬酸钠，直至磁分离不能获得澄清的上清液为止，最后重新分散在5mL去离子水中，制得柠檬酸修饰的水溶性Fe3O4，即表面带有大量羧基的Fe3O4-COOH磁性纳米粒子；
步骤3、COFs有机物包覆磁性纳米粒子：
将步骤2制得的Fe3O4-COOH磁性纳米粒子干燥后分散在o-DCB和正丁醇的混合溶液中，加入0.15mL吡咯烷作为催化剂，随后对上述溶液进行三次冻泵-解冻循环，之后将混合溶液在120℃下反应72h，对产品过滤收集，用丙酮洗涤后，在40℃下真空干燥48h，随后超声分散在乙醇中，分别加入NH2-PEG-COOH和吡咯烷进行激烈超声，使COFs壳体上残留的醛基与PEG链的端胺基反应，将混合液保持在50℃反应12h，之后用乙醇和去离子水清洗微球去除反应物剩余，即得到Fe3O4-COOH@COF磁珠。
步骤4、免疫磁珠的制备：
取10mg步骤3制得的Fe3O4-COOH@COF磁珠分散在去离子水中，用EDC.HCl和sulfo-NHS活化羧基，摇床37℃活化1h后进行磁分离，并用去离子水洗涤3遍；
将5μL粒子浓度为5mmol/L粒子的二甲基甲酰胺溶液加入到100μL浓度为10μmol/L的粒子CD45抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到氨基修饰的CD45抗体，再用同样的方法分别得到氨基修饰的CD31、CD14抗体；
将25℃下在pH＝6.0的PBS缓冲液中混合反应2h后，进行磁分离后得到CD45、CD31、CD14抗体交联磁珠的CD45、CD31、CD14免疫磁珠。
优选地，步骤(1)中所述的二价铁盐和三价铁盐分别为FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O，所述的二价铁盐和三价铁盐的摩尔比1:1。
本发明提供的免疫磁珠在CTC检测和分离中的应用，具体地，所述检测和分离的对象为白细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.粒子应用本发明提供方法制备的免疫磁珠粒径小、磁响应好、分散稳定性好，对所捕获白细胞的空间位阻小，检测灵敏度高，在初始聚合过程中可以通过改变单体的投料量可以调整磁珠壳的厚度，使得磁珠的含磁量达到理想效果，从而达到对白细胞快速高效分离的效果。
2.粒子本发明对磁珠进行活泼基团修饰和活化，并且对抗体进行氨基或羧基活化，用化学交联法在磁珠表面大量接枝抗体，包括CD45、CD31和CD14，提高了磁珠的免疫性，进一步提高CTC的去除率。
附图说明
图1为实施例1制备的免疫磁珠的标尺为4μm的SEM粒径分析图；
图2为实施例1制备的免疫磁珠的标尺为2μm的SEM粒径分析图；
图3为医用磁珠的标尺为5μm的SEM粒径分析图；
图4为医用磁珠的标尺为2μm的SEM粒径分析图；
图5为实施例1制备的免疫磁珠与医用磁珠磁分离能力的测试对比图；
图6为实施例1制备的免疫磁珠与医用磁珠磁分散稳定性测试对比图；
图7为实施例1制备的免疫磁珠与医用磁珠分离白细胞后残留数量的对比图；
图8为实施例1制备的免疫磁珠与医用磁珠在CTC检测中的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，但不应理解成对本发明的限制，需要说明的是，实施例中用于对比的医用磁珠购买于赛特生物，货号为HC-01R3。
实施例1：
步骤1、磁性纳米粒子的制备：
将含有1.39g粒子FeSO4·7H2O和1.35g粒子FeCl3·6H2O的混合溶液加入到三口烧瓶中，在氮气保护下加入30mL粒子NH3·H2O，搅拌20min，使混合溶液由橙红色逐渐变成黑色，再继续搅拌15min后停止，对混合溶液进行离心操作，使用去离子水反复洗涤至PH＝7后移去上清液，在60℃下真空干燥24h，再超声即得到Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤2、表面修饰的磁性纳米粒子的制备：
将步骤1制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散在去离子水中并超声20min，取5mL分散液置于三口烧瓶中，通氮气1h除去分散液中的氧气，向除去氧气的分散液中加入0.4g柠檬酸钠后继续超声，使柠檬酸钠和Fe3O4磁性纳米粒子在分散液中混合均匀，保持无氧的条件下，加热60℃并机械搅拌1h后结束反应。用钕铁硼磁铁进行磁分离，用去离子水洗涤去除多余的拧檬酸钠，直至磁分离不能获得澄清的上清液为止，最后重新分散在5mL去离子水中，制得柠檬酸修饰的水溶性Fe3O4，即表面带有大量羧基的Fe3O4-COOH磁性纳米粒子；
步骤3、COFs有机物包覆磁性纳米粒子：
将步骤2制得的Fe3O4-COOH磁性纳米粒子干燥后分散在o-DCB和正丁醇的混合溶液中，加入0.15mL吡咯烷作为催化剂，随后对上述溶液进行三次冻泵-解冻循环，之后将混合溶液在120℃下反应72h，对产品过滤收集，用丙酮洗涤后，在40℃下真空干燥48h，随后超声分散在乙醇中，分别加入NH2-PEG-COOH和吡咯烷进行激烈超声，使COFs壳体上残留的醛基与PEG链的端胺基反应，将混合液保持在50℃反应12h，之后用乙醇和去离子水清洗微球去除反应物剩余，即得到Fe3O4-COOH@COF磁珠。
步骤4、免疫磁珠的制备：
取10mg步骤3制得的Fe3O4-COOH@COF磁珠分散在去离子水中，用EDC.HCl和sulfo-NHS活化羧基，摇床37℃活化1h后进行磁分离，并用去离子水洗涤3遍；将5μL粒子浓度为5mmol/L粒子的二甲基甲酰胺溶液加入到100μL浓度为10μmol/L的粒子CD45抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到氨基修饰的CD45抗体，再用同样的方法分别得到氨基修饰的CD31、CD14抗体；将25℃下在pH＝6.0的PBS缓冲液中混合反应2h后，进行磁分离后得到CD45、CD31、CD14抗体交联磁珠的CD45、CD31、CD14免疫磁珠。
用Nanodrop2000分光光度计测得，消耗的抗体量与加入的抗体总量的比例为85％，这说明大量抗体成功地与磁珠发生了交联反应，磁珠表面接枝了大量的抗体。
效果例1：
粒径比较：
运用SEM电子成像法对磁珠粒径进行分析，图1为实施例1制备的免疫磁珠的标尺为4μm的SEM粒径分析图，图2为实施例1制备的免疫磁珠的标尺为2μm的SEM粒径分析图，图3为医用磁珠的标尺为5μm的SEM粒径分析图，图4为医用磁珠的标尺为2μm的SEM粒径分析图，可以看出实施例1制备的免疫磁珠分布均匀，粒径大小介于600～1200粒子nm之间，远小于医用磁珠的粒径(约2700粒子nm)，且磁珠表面带有丰富的电荷，这有利于磁珠在水溶液中具有良好的分散稳定性。小粒径的免疫磁珠可减少对所捕获白细胞的空间位阻，增加了捕获效率，提高检测灵敏度和检测效率，从而在CTC检测中实现快速、准确的捕获并分离白细胞。
效果例2：
磁分离能力的比较：
在磁分离实验中，以溶液中磁分离出来磁珠的含量占溶液中总磁珠含量的百分比即磁珠的收集率作为比较标准，对比实施例1制得的免疫磁珠与医用磁珠的分离能力。
首先分别取5mg实施例1制得的免疫磁珠和医用磁珠，分别分散在5mL的去离子水中，超声15min使磁珠在溶剂中分散均匀，然后同时用钕铁硼磁铁靠近装有分散液的外壁，记录不同时间点被吸附磁珠的含量，从而计算磁珠的收集率。图5为测试过程中的对比图，可以看到，外加磁场1min时，两种磁珠都表现出良好的吸附能力，并没有明显差异，2min后实施例1的免疫磁珠收集率明显大于医用磁珠的收集率，在5min内实现了100％收集，但医用磁珠不能达到100％收集，其收集率最高达到98％左右，这就说明有2％的白细胞不能被捕获，全血中白细胞的数量很多，2％的白细胞仍然数量巨大，在后期镜下读片时仍有一些障碍。上述实验可以证明本发明实施例制备的免疫磁珠的磁分离能力优于医用磁珠。
效果例3：
磁分散稳定性比较：
本实例制备的免疫磁珠分散稳定性与医用磁珠作对比，分别将本实例磁珠与医用磁珠以相同浓度分散在去离子水中，此时溶液成为胶体，通过不同时间的激光照射形成的丁达尔效应展示实施例1制得的免疫磁珠的分散稳定性。从图6看出，在20min内两类磁珠的稳定性没有显著差异，均表现出良好的分散稳定性，但随着时间增加，两类磁珠的分散稳定性出现明显差异，120min后实施例1制得的免疫磁珠没有出现分层，仍展示明显的丁达尔现象，而医用磁珠开始出现明显的分层，展示微弱的丁达尔现象，通过计算得到，120min内医用磁珠沉降了13％，而实施例1制得的免疫磁珠只沉降了2％，这表明实施例1制得的免疫磁珠具有良好的分散稳定性，优于医用磁珠。
效果例4：
分离白细胞后的残留数量比较：
采健康志愿者的血样6粒子mL，通过梯度离心将大量血小板和红细胞去除。具体步骤如下：
1、将采血管配平，头尾颠倒后室温下以1600r/min的转速离心15min。弃上清至棕红色沉淀上方5mm处，加入清洗液至采血管标签6mL刻度处，盖上黄色管帽，头尾颠倒10次，使混合液与清洗液混合均匀；
2、向50mL离心管中加入3mL样本密度分离液，用电动移液枪将采血管中的血细胞沿离心管壁液面处缓慢的加入到分离液顶层，叠加后可见清晰的分界面，少量的红细胞慢慢沉降至管底，配平后以1400r/min的转速离心6min；
3、离心后可见明显三层液体，上层为黄色液体，中间层为透明或淡红色液体，下层为深棕色红细胞沉积，将上、中层液体移至新50mL离心管中，混合均匀；
4、将实施例1制备的免疫磁珠按每管300μL的量缓慢加入到步骤3中所述的50mL离心管中，并在摇床上室温摇动20min；
5、将装有混合液的离心管置于钕铁硼磁力架上，1min后使用枪头将离心管内液体轻轻吹打3-5次，5min后用枪头将液体缓慢的在离心管壁流动，以提高吸附效率和洗涤吸附磁珠；
6、将离心管里面的液体析出置于新的50mL离心管中，并加入清洗液至45粒子mL，配平后以1400r/min的转速离心5min，取上清液100μL，将带有荧光标记的CD45抗体(特异性结合白细胞)与100μL液体孵育20min后涂片镜下观察。
7、用以上方法在相同条件下对医用磁珠进行实验，对比实施例1制备免疫磁珠的与医用磁珠分离白细胞后所剩溶液中残留白细胞的数量，结果如图7所示，医用磁珠处理后的样品中的白细胞残留数量远大于实施例1制得的免疫磁珠处理后的样品中的白细胞数量，可以证明本实施例制备磁珠分离白细胞的效果优于医用磁珠。
效果例5：
在CTC检测中的比较：
采某结肠癌志愿者的血样6粒子mL，用效果例4中所述的方法得到100μL的样品，后续通过荧光染色-荧光原位杂交法分析血液中CTC的数量和形态，结果如图8所示，可以看到，经实施例1制备的免疫磁珠和医用磁珠处理后的血样中都出现CTC，不同的是医用磁珠处理后的样品中残留大量的白细胞(红色荧光)和血小板(绿色荧光)，反观本实例磁珠处理后的样品中白细胞(红色荧光)和血小板(绿色荧光)的量明显减少。这进一步说明了本实例制备的磁珠在捕获和分离白细胞时效果更加明显，在后续CTC检测时更加精确。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理以及权利要求的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (10)

1.一种免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠结构式为A-CONH-B、A-COO-B、A-CO-O-CO-B或A-CO-B，其中A代表磁珠，B代表抗体，所述磁珠具有核-壳结构，所述核-壳结构中的核为表面功能化的磁性纳米粒子，所述核-壳结构中的壳为二氧化硅、葡萄糖或带有活泼基团的有机共价化合物，所述抗体为CD45、CD31或CD14中的一种或两种以上任意组合。
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述核-壳结构中的核的粒径为300-1000nm。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述核-壳结构中的壳的厚度为300-1000nm，且所述壳的厚度大于所述核的粒径。
4.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述带有活泼基团的有机共价化合物上的活泼基团为羟基、氨基、醛基、硼酸基、卤素、羧基、硝基或氰基中的一种或两种以上的任意组合。
5.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述带有活泼基团的有机共价化合物为均苯三甲醛、4-羟基间苯三甲醛、2,5-二羟基对苯二甲醛、2,3-二羟基对苯二甲醛、三醛基间苯三酚、1,3,5-三甲酰基间苯三酚、1,3,5-三氨基苯盐酸盐、1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐、1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐、1,4-二氨基-2,5-二乙烯基苯、对二氨基偶氮苯、三(4-氨基苯基)胺、1,4-苯二硼酸、四(4-硼酸基苯基)乙烯、苯-1,3,5-三基三硼酸、5,5'-二溴-2,2'-联吡啶、4,4',4”-三(溴甲基)三苯胺、4,4',4”-三(溴甲基)三苯胺、1,2,4,5-四羟基苯、1,3,5,7-四羟基金刚烷、2,5-二羟基对苯二磷酸、2,2'-联吡啶-5,5'-二甲醇、四(4-硝基苯基)甲烷、四-(4-硝基苯)乙烯、7,7,8,8-四氰基对苯二醌二甲烷、1,2,4,5-苯四甲腈中的一种或两种以上的任意组合。
6.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述核-壳结构中的核的表面功能基团为羟基和/或羧基。
7.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述核-壳结构中的核为Fe3O4顺磁性纳米粒子，所述核-壳结构中的壳为带有活泼基团的有机共价化合物。
8.一种制备权利要求1-4中任一项所述的免疫磁珠的方法，包括以下步骤：
步骤1、磁性纳米粒子的制备：
在氮气保护下，将20-40mL NH3·H2O加入到二价铁盐和三价铁盐的混合溶液中，搅拌使混合溶液由橙红色逐渐变成黑色，再继续搅拌10-20min后停止，对混合溶液进行离心操作，使用去离子水反复洗涤至PH为7后移去上清液，在50-70℃下真空干燥，再超声处理，即得到Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤2、表面修饰的磁性纳米粒子的制备：
将步骤1制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散在去离子水中并超声10-30min，取1-6mL分散液并除去分散液中的氧气，向除去氧气的分散液中加入0.2-0.6g柠檬酸钠后继续超声，使柠檬酸钠和Fe3O4磁性纳米粒子在分散液中混合均匀，保持无氧的条件下，加热40-60℃并机械搅拌0.5-1.5h后结束反应；用钕铁硼磁铁进行磁分离后，用去离子水洗涤去除多余的拧檬酸钠，直至磁分离不能获得澄清的上清液为止，最后分散在4-7mL去离子水中，制得表面带有大量羧基的Fe3O4-COOH磁性纳米粒子，作为磁珠的核；
步骤3、COFs包覆的磁珠制备：
将步骤2制得的Fe3O4-COOH磁性纳米粒子干燥后分散在o-DCB和正丁醇的混合溶液中，加入0.15-0.2mL吡咯烷作为催化剂，随后对上述溶液进行三次冻泵-解冻循环，之后将混合溶液在120-150℃下反应，对产品过滤收集，用丙酮洗涤后，在40-60℃下真空干燥，并超声分散在乙醇中，随后分别加入NH2-PEG-COOH和吡咯烷进行激烈超声，使COFs壳体上残留的醛基与PEG链的端胺基反应，将混合液保持在40-60℃反应一定时间，之后用乙醇和去离子水清洗微球去除反应物剩余，即得到COFs壳体包覆着的Fe3O4-COOH磁性纳米粒子的磁珠。
步骤4、免疫磁珠的制备：
取10-15mg步骤3制得的Fe3O4-COOH@COF磁珠分散在去离子水中，用EDC.HCl和sulfo-NHS活化羧基，摇床37℃活化1h后进行磁分离，并用去离子水洗涤；将5-7μL浓度为5-7mmol/L的二甲基甲酰胺溶液加入到100-200μL浓度为10-20μmol/L的CD45抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到氨基修饰的CD45抗体，再用同样的方法分别得到氨基修饰的CD31、CD14抗体；将25℃下在pH＝6.0的PBS缓冲液中混合反应2h后，进行磁分离后得到CD45、CD31、CD14抗体交联磁珠的CD45、CD31、CD14免疫磁珠。
9.根据权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的二价铁盐和三价铁盐分别是FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O，所述的二价铁盐和三价铁盐的摩尔比1:1-2。
10.根据权利要求1所述的免疫磁珠在CTC检测和分离中的应用，其特征在于所述检测和分离的对象为白细胞。
CN202111319980.8A 2021-11-09 2021-11-09 一种免疫磁珠及其制备方法和应用 Pending CN113933501A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111319980.8A CN113933501A (zh) 2021-11-09 2021-11-09 一种免疫磁珠及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111319980.8A CN113933501A (zh) 2021-11-09 2021-11-09 一种免疫磁珠及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113933501A true CN113933501A (zh) 2022-01-14

Family

ID=79286195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111319980.8A Pending CN113933501A (zh) 2021-11-09 2021-11-09 一种免疫磁珠及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113933501A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115417809A (zh) * 2022-09-05 2022-12-02 天津药明康德新药开发有限公司 一种4,4-二吡咯-2,2-联吡啶的制备方法
CN115869899A (zh) * 2022-12-27 2023-03-31 中国检验检疫科学研究院 一种氧化石墨烯修饰的磁性纳米粒及其制备方法和应用
CN117517650A (zh) * 2023-12-08 2024-02-06 中国检验检疫科学研究院 一种功能化介孔磁性微球及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104914241A (zh) * 2014-03-14 2015-09-16 中国科学院过程工程研究所 一种免疫磁珠及其制备方法和应用
CN111450803A (zh) * 2020-03-16 2020-07-28 哈尔滨工业大学 一种吸附三苯甲烷类染料的磁性共价有机骨架化合物的制备方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104914241A (zh) * 2014-03-14 2015-09-16 中国科学院过程工程研究所 一种免疫磁珠及其制备方法和应用
CN111450803A (zh) * 2020-03-16 2020-07-28 哈尔滨工业大学 一种吸附三苯甲烷类染料的磁性共价有机骨架化合物的制备方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
彭祥倩等: "功能化核- 壳式结构Fe3O4/聚合物的合成及应用", 齐鲁工业大学学报, vol. 29, no. 2, 30 June 2015 (2015-06-30), pages 1 - 8 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115417809A (zh) * 2022-09-05 2022-12-02 天津药明康德新药开发有限公司 一种4,4-二吡咯-2,2-联吡啶的制备方法
CN115869899A (zh) * 2022-12-27 2023-03-31 中国检验检疫科学研究院 一种氧化石墨烯修饰的磁性纳米粒及其制备方法和应用
CN117517650A (zh) * 2023-12-08 2024-02-06 中国检验检疫科学研究院 一种功能化介孔磁性微球及其制备方法和应用
CN117517650B (zh) * 2023-12-08 2024-05-28 中国检验检疫科学研究院 一种功能化介孔磁性微球及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113933501A (zh) 一种免疫磁珠及其制备方法和应用
US7169618B2 (en) Magnetic particles and methods of producing coated magnetic particles
Gao et al. Preparation and characterization of uniformly sized molecularly imprinted polymers functionalized with core–shell magnetic nanoparticles for the recognition and enrichment of protein
CN103903827B (zh) 一种磁性二氧化硅复合微球的制备方法及其应用
US6773812B2 (en) Magnetically-responsive microspheres
EP3043905B1 (en) New diagnostic assay using particles with magnetic properties
Xu et al. Creating magnetic ionic liquid-molecularly imprinted polymers for selective extraction of lysozyme
JP6661368B2 (ja) マルチソート細胞分離法
CN108355625B (zh) 一种基于团队硼亲和的糖蛋白表面印迹聚合物及其制备方法和应用
US10788487B2 (en) Solid-phase support, ligand-binding solid-phase support, method for detecting or separating target substance, and method for producing the solid-phase support
EP3193172B1 (en) Solid phase carrier, ligand-bound solid phase carrier, method for detecting or separating target substance, and method for producing solid phase carrier
CN111826351A (zh) 一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇
CN109490276B (zh) 一种拉曼传感器及其制备方法
EP3608670B1 (en) Hydrophilic coloring cellulose microparticles
Yu et al. Functional and biocompatible polymeric ionic liquid (PIL)-decorated immunomagnetic nanospheres for the efficient capture of rare number CTCs
CN110261604B (zh) 抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及应用
JPWO2007126151A1 (ja) 機能性粒子およびそれを用いた標的物質の分離方法
CN112877274A (zh) 一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用
CN111269366A (zh) 高选择性头孢曲松钠磁性分子印迹聚合物的制备方法
CN106279421B (zh) 一种cd133、cd24、cd44多重抗体免疫磁珠及其制备方法
CN111551740B (zh) 幽门螺杆菌尿素酶IgG和IgM抗体联合检测装置及制备方法
Nekounam et al. Application of functional magnetic nanoparticles for separation of target materials: a review
EP0543988B1 (en) Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
CN109283330A (zh) 一种基于拉曼光谱法的快速检测癌细胞的方法
CN114441489A (zh) 一种基于荧光微球和碳点的比率型荧光生物探针制备方法及在刀豆球蛋白a检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination