CN113925929A - 石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制血栓药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制血栓药物中的应用，石斛生物碱组分对血栓形成有显著抑制作用，而且石斛生物碱安全性良好，长期使用毒性小，具有良好的应用前景石斛生物碱可用于制备抗血栓药物，提供了石斛生物碱的新用途，也为血栓性疾病的治疗提供了新的药物。

Description

石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制 血栓药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体为一种石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制血栓药物中的应用。

背景技术

血栓性疾病可分为动脉血栓和静脉血栓。动脉血栓的起始原因是动脉受损或粥样硬化，斑块破溃引起血小板粘附聚集进而启动凝血过程。动脉血栓脱落堵塞血管即出现器官和肢体的缺血或坏死。静脉血栓是由于静脉血流迟缓，在血液高凝状态及血管内膜损伤条件下，静脉发生急性非化脓性炎症，并继发血栓而形成的疾病，主要包括整形外科手术后形成的深层静脉血栓和由其引发的肺栓塞。

西医在治疗血栓的过程中，主要采用抗血小板聚集药物、抗凝血药物和溶血栓药等药物，容易引起出血并发症，造成皮肤、血液等系统的不良反应。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供石斛生物碱在制备治疗抑制血栓药物中的应用。

本发明还提供了一种用于治疗抑制血栓的药物，所述用于治疗抑制血栓的药物中含有石斛生物碱。

本发明还提供了一种石斛生物碱的制备方法，用于制备上述应用和药物中的石斛生物碱。

根据本发明第一方面实施例的石斛生物碱在制备治疗抑制血栓药物中的应用。

根据本发明第二方面实施例的用于治疗抑制血栓的药物，所述用于治疗抑制血栓的药物中含有石斛生物碱。

根据本发明第三方面实施例的石斛生物碱的制备方法，包括以下步骤：

S1、霍山石斛60℃烘干至恒重；

S2、将步骤S1获得的石斛粉碎，称取20g，放入500mL圆底烧瓶中，加入50mL含己活化纤维素酶的缓冲液，搅拌均匀，获取混合液A；

S3、将步骤S2获得的混合液A放在37℃环境中进行酶解，3小时后升温至90℃对酶灭活；

S4、加入无水乙醇溶液200mL，在60℃环境下，水浴冷凝回流浸提3 次，每次2小时，过滤合并获得滤液B；

S5、对步骤S4获得的滤液B减压浓缩至100mL，加入等体积氯仿萃取 3次，回收氯获得总石斛生物碱。

根据本发明第三方面实施例的石斛生物碱的制备方法，包括以下步骤：

S1、霍山石斛60℃烘干至恒重；

S2、将步骤S1获得的石斛粉碎，称取20g，放入500mL圆底烧瓶中，加入50mL含己活化纤维素酶的缓冲液，搅拌均匀，获取混合液A；

S3、将步骤S2获得的混合液A放在37℃环境中进行酶解，3小时后升温至90℃对酶灭活；

S4、加入无水乙醇溶液200mL，在60℃环境下，水浴冷凝回流浸提3 次，每次2小时，过滤合并获得滤液B；

S5、对步骤S4获得的滤液B减压浓缩至100mL，加入等体积氯仿萃取 3次，回收氯获得总石斛生物碱。

根据本发明实施例石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制血栓药物中的应用，石斛生物碱组分对血栓形成有显著抑制作用，而且石斛生物碱安全性良好，长期使用毒性小，具有良好的应用前景石斛生物碱可用于制备抗血栓药物，提供了石斛生物碱的新用途，也为血栓性疾病的治疗提供了新的药物。

附图说明

图1为小鼠尾巴的对照图；

图2为24h和48h时间点小鼠尾部血栓形成率对比图；

图3为对照组小鼠尾部血管腔在距尾尖2cm处血栓情况图；

图4为对照组小鼠肝血管中血栓情况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-4所示描述根据本发明实施例的石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制血栓药物中的应用。

根据本发明第一方面实施例的石斛生物碱在制备治疗抑制血栓药物中的应用。

根据本发明第二方面实施例的用于治疗抑制血栓的药物，所述用于治疗抑制血栓的药物中含有石斛生物碱。

根据本发明第三方面实施例的石斛生物碱的制备方法，包括以下步骤：

S1、霍山石斛60℃烘干至恒重；

S2、将步骤S1获得的石斛粉碎，称取20g，放入500mL圆底烧瓶中，加入50mL含己活化纤维素酶的缓冲液，搅拌均匀，获取混合液A；

S3、将步骤S2获得的混合液A放在37℃环境中进行酶解，3小时后升温至90℃对酶灭活；

S4、加入无水乙醇溶液200mL，在60℃环境下，水浴冷凝回流浸提3 次，每次2小时，过滤合并获得滤液B；

S5、对步骤S4获得的滤液B减压浓缩至100mL，加入等体积氯仿萃取 3次，回收氯获得总石斛生物碱。

根据本发明实施例石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制血栓药物中的应用，石斛生物碱组分对血栓形成有显著抑制作用，而且石斛生物碱安全性良好，长期使用毒性小，具有良好的应用前景石斛生物碱可用于制备抗血栓药物，提供了石斛生物碱的新用途，也为血栓性疾病的治疗提供了新的药物。

下面参照具体实施例描述根据本发明实施例的石斛生物碱的制备方法。

1、石斛中生物碱组分的提取纯化

60℃烘干至恒重的霍山石斛，粉碎，称取20g，放入500mL圆底烧瓶中，加入50mL含己活化纤维素酶的缓冲液，搅拌均匀，37℃酶解3小时后立即升温至90℃对酶灭活，无水乙醇溶液200mL，60℃水浴冷凝回流浸提3次，每次2小时，过滤合并滤液，减压浓缩至100mL，加入等体积氯仿萃取3次，回收氯仿得总生物碱(生物碱得率0.4％)。

2、石斛生物碱对角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓形成有抑制作用

2.1选取20只雄性约8周龄昆明小鼠，重约22g，经1周适应性喂养，随机分为对照组(对照组)和石斛生物碱处理组(石斛碱组)，每组10只。 Ctrl组小鼠，每天灌胃200μL生理盐水；石斛碱组小鼠，以每天0.1g/kg 小鼠体重的石斛碱灌胃，约200μL。连续灌胃10天，所有小鼠均自由进食饮水。在第8天时，所有小鼠于腹腔注射110μL 1％角叉菜胶溶液(相当于50mg/kg体重)，记录24h、48h尾部血栓变化。48h后，将小鼠安乐死，快速拍摄小鼠尾巴，分别采集尾巴、肝脏等标本。附图1为拍摄的小鼠尾巴，出示具有代表性的照片，图2为24h、48h时小鼠尾部血栓形成率。由图可以看出小鼠尾部形成血栓并随时间推移而进展，石斛生物碱组分对小鼠尾部血栓形成有显著抑制作用。

3、石斛碱抑制角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓形成

3.1小鼠尾部切片及HE染色

尾部切片：为了确定小鼠尾静脉内形成的血栓，在不同的位置(离尾尖的距离)收集一片小鼠尾巴，置于4％多聚甲醛通用组织固定液中固定48h，然后以30％蔗糖溶液脱水24h。将脱水后的组织置于OCT中包埋，冰冻切片机切片，切片厚度为5μm，存放于-20℃冰箱。

HE染色：将冰冻切片从冰箱拿出，在室温放置30min，然后在PBS中浸泡5min脱包埋。样本周围用吸水纸吸干，苏木精染液染1min，蒸馏水冲洗返蓝。伊红复染5min，在装有蒸馏水的烧杯中漂洗，以去除多余染液。用中性树脂封片，待封片干燥后，在显微镜下进行拍照。

3.2实验结果

如附图3所示，对照组小鼠尾部血管腔在距尾尖2cm处几乎完全被血栓占据。与此同时,在距尾尖3cm处,对照组血栓几乎填满血管腔且显著多于石斛碱组。染色结果图表明石斛碱抑制小鼠尾静脉血栓形成。

4、石斛碱抑制角叉菜胶诱导的小鼠肝血栓形成

4.1.小鼠肝脏切片及HE染色

肝脏切片：为了确定小鼠肝脏内形成的血栓，将收集的每只小鼠的新鲜肝脏剪切一块置于4％多聚甲醛通用组织固定液中固定48h，然后以30％蔗糖溶液脱水24h。将脱水后的组织置于OCT中包埋，冰冻切片机切片，切片厚度为5μm，存放于-20℃冰箱。

HE染色：将冰冻切片从冰箱拿出，在室温放置30min，然后在PBS中浸泡5min脱包埋。样本周围用吸水纸吸干，苏木精染液染1min，蒸馏水冲洗返蓝。伊红复染5min，在装有蒸馏水的烧杯中漂洗，以去除多余染液。用中性树脂封片，待封片干燥后，在显微镜下进行拍照。

2.实验结果

如图4所示，我们在对照组小鼠肝血管中发现了多个严重血栓。相比之下，石斛碱组肝脏血管中血栓显著减少。结果表明石斛碱显著抑制肝脏血管形成血栓。

综上所述，根据本发明实施例石斛生物碱的制备方法和具有其的药物及其在制备治疗抑制血栓药物中的应用，石斛生物碱组分对血栓形成有显著抑制作用，而且石斛生物碱安全性良好，长期使用毒性小，具有良好的应用前景石斛生物碱可用于制备抗血栓药物，提供了石斛生物碱的新用途，也为血栓性疾病的治疗提供了新的药物。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.石斛生物碱在制备治疗抑制血栓药物中的应用。

2.一种用于治疗抑制血栓的药物，其特征在于：所述用于治疗抑制血栓的药物中含有石斛生物碱。

3.根据权利要求1所述的石斛生物碱在制备治疗抑制血栓药物中的应用中的石斛生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、霍山石斛60℃烘干至恒重；

S2、将步骤S1获得的石斛粉碎，称取20g，放入500mL圆底烧瓶中，加入50mL含己活化纤维素酶的缓冲液，搅拌均匀，获取混合液A；

S3、将步骤S2获得的混合液A放在37℃环境中进行酶解，3小时后升温至90℃对酶灭活；

S4、加入无水乙醇溶液200mL，在60℃环境下，水浴冷凝回流浸提3次，每次2小时，过滤合并获得滤液B；

S5、对步骤S4获得的滤液B减压浓缩至100mL，加入等体积氯仿萃取3次，回收氯获得总石斛生物碱。

4.根据权利要求2所述的用于治疗抑制血栓的药物的石斛生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、霍山石斛60℃烘干至恒重；

S2、将步骤S1获得的石斛粉碎，称取20g，放入500mL圆底烧瓶中，加入50mL含己活化纤维素酶的缓冲液，搅拌均匀，获取混合液A；

S3、将步骤S2获得的混合液A放在37℃环境中进行酶解，3小时后升温至90℃对酶灭活；

S4、加入无水乙醇溶液200mL，在60℃环境下，水浴冷凝回流浸提3次，每次2小时，过滤合并获得滤液B；

S5、对步骤S4获得的滤液B减压浓缩至100mL，加入等体积氯仿萃取3次，回收氯获得总石斛生物碱。

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