CN113925866A

CN113925866A - 激酶抑制剂在制备雄性避孕药品或者制品中的应用

Info

Publication number: CN113925866A
Application number: CN202111399487.1A
Authority: CN
Inventors: 李怀标; 蔡英; 李娜; 王骁
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN113925866B

Abstract

本申请涉及激酶抑制剂在制备雄性避孕药品或者制品中的应用，抑制剂为N‑[2‑(3,4‑二氢‑3‑氧代‑2‑喹喔啉基)‑4‑(1‑甲基乙基)苯基]‑2‑噻吩甲酰胺、其药学上可接受的盐、溶剂化物和药学上可接受的盐的溶剂化物中的至少一种。该激酶抑制剂能够降低附睾尾中精子浓度，以抑制精子形成，并且不会对精原细胞产生影响。停药后，精子形成会恢复到给药前水平，实现可逆避孕。相对于已有的抑制睾酮生成的男性避孕药，该激酶抑制剂不会影响睾酮等雄性激素的合成，因而雄性性征不会出现改变，性生活质量不会降低。

Description

激酶抑制剂在制备雄性避孕药品或者制品中的应用

技术领域

本申请涉及激酶抑制剂的应用技术领域，尤其涉及激酶抑制剂在制备雄性避孕药品或者制品中的应用。

背景技术

现有技术中，男性的避孕方式一般包括避孕套和输精管结扎方式。研究表明，避孕套的避孕率不能保证100％，且会降低性生活的质量；而输精管结扎属于一种有创方式，术后有并发出血的危险等，存在诸多弊端。此外，如输精管结扎病人希望恢复生育能力，需再进行手术对输精管进行复通，风险加大。因此，高效、安全、简便、无创的用于雄性的可逆性避孕方式亟待。

发明内容

弱精子症是男性不育的常见病因之一，而细胞信号传导系统对精子的活力有重要影响。磷脂酞肌醇3激酶(PI3K)是近年来发现的细胞内肌醇磷脂信使系统的重要组成部分，Feng等于1998年发现小鼠精子上有PI3K的表达，并经现代研究证实PI3K的特异性抑制剂LY294002能增强人类精子的运动能力和精卵结合能力而不影响顶体反应。

有鉴于此，本申请的目的在于至少提供一种将激酶抑制剂应用于雄性避孕的用途。

本申请实施例公开了激酶抑制剂在制备雄性避孕药品或者制品中的应用，所述抑制剂为N-[2-(3,4-二氢-3-氧代-2-喹喔啉基)-4-(1-甲基乙基)苯基]-2-噻吩甲酰胺、其药学上可接受的盐、溶剂化物和药学上可接受的盐的溶剂化物中的至少一种。

在本申请实施例中，所述药品或制品由包含所述抑制剂的溶液制备而得。

在本申请实施例中，所述抑制剂能够降低附睾尾中精子浓度，以抑制精子形成，所述抑制剂产生抑制的作用浓度不高于100mg/kg体重。

第二方面，本申请实施例公开了一种雄性避孕药品或者制品，为N-[2-(3,4-二氢-3-氧代-2-喹喔啉基)-4-(1-甲基乙基)苯基]-2-噻吩甲酰胺、其药学上可接受的盐、溶剂化物和药学上可接受的盐的溶剂化物中的至少一种。

在本申请实施例中，所述药学上可接受的盐选自氯盐、溴盐、乳清酸盐、天冬氨酸盐、酸式天冬氨酸盐、酸式柠檬酸盐、柠檬酸镁盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、延胡索酸盐、酸式延胡索酸盐、延胡索酸镁盐、乳酸盐、马来酸盐、酸式马来酸盐、草酸盐、酸式草酸盐、巴莫酸盐、酸式巴莫酸盐、硫酸盐、酸式硫酸盐、磷酸葡萄糖盐、酒石酸盐、酸式酒石酸盐、甘油磷酸盐、粘酸盐、酒石酸镁盐、2-氨基一乙磺酸盐、2-氨基乙磺酸镁盐、甲磺酸盐、酒石酸胆碱盐、三氯乙酸盐和三氟乙酸盐。

在本申请实施例中，所述溶剂化物选自乙醇、丙酮或二甲基亚砜的溶剂化物。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

本申请发现了一种激酶抑制剂能够降低附睾尾中精子浓度，以抑制精子形成，并且不会对精原细胞产生影响。停药后，精子形成会恢复到给药前水平，实现可逆避孕。相对于已有的抑制睾酮生成的男性避孕药，该激酶抑制剂不会影响睾酮等雄性激素的合成，因而雄性性征不会出现改变，性生活质量不会降低。

附图说明

图1为实施例1中Phos-tag PAGE分析YZJ处理后STK33磷酸化条带的变化。标注星号的条带为磷酸化STK33。

图2为实施例2中单次腹腔注射YZJ后小鼠7天的体重(A)及睾丸指数(B)的变化；图2A中箭头标注的是给药时间点；图2B中“ns”表示无统计学差异。

图3为实施例3中为期14天的YZJ腹腔给药，雄鼠每天的体重变化幅度曲线图。

图4为实施例3中为期14天的YZJ腹腔给药后，小鼠附睾尾部内的精子浓度变化(A)；H&E染色分析证明YZJ处理组雄鼠附睾尾内部的精子数量显著减少(B)；“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01。

图5为实施例3中为期14天的YZJ腹腔给药后雄鼠睾丸图(A)及睾丸指数(B)；图5C表示PAS染色的睾丸切片染色图；“ns”表示无统计学差异。

图6为实施例4的提供的动物实验结果；图6A表示动物实验流程图；

图6B为YZJ处理2周后和停药处理后的附睾尾部的精子浓度结果图；

图6C为YZJ处理2周后和停药处理后的附睾头部的精子浓度结果图；

“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“ns”表示无统计学差异。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本申请发明人经推测，腹腔注射小分子激酶抑制剂能够靶向生精细胞的激酶，抑制精子的形成以实现可逆性避孕，该激酶抑制剂有望为雄性避孕提供新方法，为生殖医学的发展起到积极作用。

具体的，为验证其对生精细胞以及生精细胞所在有机体的影响，本申请进行了如下实施过程。

体外细胞实验

1、实验材料

HEK-293细胞，货号为CL-0001，武汉普诺赛；FLAG-STK33表达质粒，上海吉满生物科技。

(N-[2-(3,4-二氢-3-氧代-2-喹喔啉基)-4-(1-甲基乙基)苯基]-2-噻吩甲酰胺)，检测为YZJ，购自MedChemExpress，完全溶解于DMSO中，获得浓度为10mM的澄清溶液，保存于-80℃中。

2、实验过程

利用Effectene转染试剂(购自QIAGEN)将FLAG-STK33表达质粒转染进HEK293细胞。转染24小时后，将10mM的YZJ溶液按1:1000比例加入到培养基中。48小时后收集细胞进行裂解。相同体积的裂解液分别上样于SDS-PAGE及Phos-tag PAGE胶，进行蛋白电泳。电泳结束后进行转膜，将PAGE胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，利用FLAG抗体检测带了FLAG标签的STK33蛋白的迁移。

3、实验结果

如图1所示，经SDS-PAGE胶分离后，利用抗FLAG抗体在硝酸纤维素膜上可检测到一条STK33条带，采用Phos-tag PAGE胶进行分离时，对照组中抗FLAG抗体可检测出两条STK33条带(图1)，说明Phos-tag PAGE可以将磷酸化和非磷酸化的STK33区分开来。其中迁移较慢的条带为磷酸化STK33蛋白，说明STK33可以自磷酸化(图1)。当用YZJ处理细胞48小时后，迁移较慢的磷酸化STK33蛋白条带消失了(图1中“*”所示条带)，证明YZJ可抑制STK33的激酶活性。

YZJ注射浓度的确定

1、实验动物

8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自协同医药生物工程有限责任公司。

2、供试品

YZJ，完全溶解于DMSO中，获得浓度为100mg/ml澄清溶液，保存于-80℃中，作为供试品母液待用。将100mg/mL的母液用玉米油稀释成10mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL的工作溶液。

3、实验过程

8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分成5组，每组3只，分别腹腔注射YZJ一次，给药剂量为0.1mg/kg体重、1mg/kg体重、10mg/kg体重、100mg/kg体重，DMSO组作为对照组，观察一周，记录体重，七天后取睾丸进行称重及石蜡包埋。

4、结果

如图2A所示，单次给予不同剂量的YZJ后，一周内雄鼠的体重无明显变化，均在正常范围内波动。

如图2B所示，单次给药YZJ后各组间的睾丸指数(睾丸重量/体重)未见统计学差异。

以上结果说明YZJ在体内无明显的毒副作用。此外。在解剖取材过程中，发明人发现100mg/kg剂量组动物腹腔内部有淡黄色固体附着于器官表面，推测是YZJ药物析出形成的颗粒，说明此浓度过高，不适用于后续的实验。

腹腔注射YZJ对精子形成的抑制作用

1、实验动物

2、供试品：

将YZJ母液(100mg/mL)依次用PEG300、Tween80和生理盐水进行稀释，获得2mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL的澄清工作溶液。

3、实验过程

8周龄C57BL/6雄性小鼠分4组：DMSO组、YZJ 20mg/kg剂量组、YZJ 10mg/kg剂量组、YZJ 1mg/kg剂量组；每天腹腔注射YZJ工作溶液，连续给药14天，同时观察实验动物健康状况，记录体重，14天后取材，进行精子计数及病理分析。

精子计数的方法：切除下来的附睾尾部置于F10培养基中，剪碎，37℃水浴孵育30分钟，取上清，按1:1比例与4％多聚甲醛溶液混匀，取10微升接种于血球计数板上，在显微镜下对精子个数进行计数。

病理分析的方法：附睾和睾丸组织切除下来后，置于4％多聚甲醛溶液中，室温放置过夜，脱水后包埋于石蜡中，切片，用苏木素及伊红(H&E)进行染色，用奥林巴斯SV120显微镜对染色后的切片进行扫描，获得组织的数字切片用于分析。

4、实验结果

如图3所示，小鼠体重在给药期间体重无明显变化，在正常范围内波动，仅高剂量组动物(20mg/kg体重组)在第10天体重出现小幅度下降。

取附睾尾部进行精子计数，结果显示不同剂量的YZJ给药均显著降低附睾尾部的精子浓度(图4A)。H&E染色分析进一步证实，与DMSO组相比，YZJ处理组附睾内精子出现明显的减少(图4B)。这些结果说明腹腔给药YZJ可以降低精子浓度。

对给药2周后的小鼠睾丸进行分析，发现YZJ处理后睾丸外观上没有出现明显的萎缩(图5A)，睾丸的重量(睾丸指数＝睾丸重量/动物体重)也没有出现显著下降(图5B)。

曲细精管内部生精细胞的分布有异质性，可分为12期。PAS染色方法可以将睾丸切片里处于不同时期的曲细精管区分开来，成形精子主要出现在VII-VIII期间。PAS染色分析证明，YZJ处理组睾丸的曲细精管内依然可以观察到不同类型的精母细胞(L和P，图5C)和圆形精子(rSt，图5C)，说明YZJ处理不影响精母细胞的减数分裂。这些结果也暗示YZJ导致的精子浓度下降是可逆的。

YZJ对精子形成的可逆抑制

1、实验动物

8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。

2、供试品：

将YZJ母液(100mg/ml)依次用PEG300、Tween80和生理盐水进行稀释，获得1mg/mL的澄清工作溶液。

3、实验过程

如图6A所示，8周龄C57BL/6雄性小鼠分2组：DMSO组及YZJ10mg/kg组；每天腹腔注射YZJ工作溶液，连续给药14天，同时观察实验动物健康状况，记录体重，14天后各组取一半实验动物，进行脱颈处死，取睾丸和附睾，进行精子计数及病理分析；余下一半实验动物停止给药，继续观察健康状况，记录体重，14天后取材，进行精子计数及病理分析。

4、实验结果

鉴于精母细胞没有受到YZJ的影响，YZJ导致的精子浓度下降是可逆的，由此，本申请进一步开展了动物实验，实验流程如图6A所示。与实施例3的结果一致，与对照组相比，YZJ处理2周后，附睾尾部的精子浓度出现显著下降(图6B)。当停止YZJ处理后，精子浓度恢复至对照组水平(图6B)。附睾头部的精子浓度和尾部的变化一致(图6C)。这些结果说明，YZJ对精子形成的抑制作用是可逆的。

以上结果证明STK33抑制剂YZJ能够抑制精子形成，降低附睾尾中精子浓度，但不影响曲细精管里的精母细胞，验证了该小分子抑制剂YZJ应用于雄性避孕中的可能性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.激酶抑制剂在制备雄性避孕药品或者制品中的应用，所述抑制剂为N-[2-(3,4-二氢-3-氧代-2-喹喔啉基)-4-(1-甲基乙基)苯基]-2-噻吩甲酰胺、其药学上可接受的盐、溶剂化物和药学上可接受的盐的溶剂化物中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品或制品由包含所述抑制剂的溶液制备而得。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂能够降低附睾尾中精子浓度，以抑制精子形成，所述抑制剂产生抑制的作用浓度不高于100mg/kg体重。

4.一种雄性避孕药品或者制品，为N-[2-(3,4-二氢-3-氧代-2-喹喔啉基)-4-(1-甲基乙基)苯基]-2-噻吩甲酰胺、其药学上可接受的盐、溶剂化物和药学上可接受的盐的溶剂化物中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的雄性避孕药品或者制品，其特征在于，所述药学上可接受的盐选自氯盐、溴盐、乳清酸盐、天冬氨酸盐、酸式天冬氨酸盐、酸式柠檬酸盐、柠檬酸镁盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、延胡索酸盐、酸式延胡索酸盐、延胡索酸镁盐、乳酸盐、马来酸盐、酸式马来酸盐、草酸盐、酸式草酸盐、巴莫酸盐、酸式巴莫酸盐、硫酸盐、酸式硫酸盐、磷酸葡萄糖盐、酒石酸盐、酸式酒石酸盐、甘油磷酸盐、粘酸盐、酒石酸镁盐、2-氨基一乙磺酸盐、2-氨基乙磺酸镁盐、甲磺酸盐、酒石酸胆碱盐、三氯乙酸盐和三氟乙酸盐。

6.根据权利要求4所述的雄性避孕药品或者制品，其特征在于，所述溶剂化物选自乙醇、丙酮或二甲基亚砜的溶剂化物。