CN113917065A - 一种利用离子色谱同时测定乳糖-n-丙糖ii和乳糖-n-新四糖的检测方法 - Google Patents

一种利用离子色谱同时测定乳糖-n-丙糖ii和乳糖-n-新四糖的检测方法 Download PDF

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陈尚卫
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罗国聪
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Abstract

本发明公开了一种利用离子色谱同时测定乳糖‑N‑丙糖II和乳糖‑N‑新四糖的检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先用超纯水溶解乳糖‑N‑四糖(LNnt)和乳糖四糖II(LNT II)标准品，配置成不同浓度的标准溶液，进行阴离子交换色谱‑脉冲安培法进行检测获得标准曲线，再对待测样品中LNT II和LNnT的浓度。本发明中LNT II的仪器检出限为1.4mg/L、定量限为15.1mg/L，LNnT仪器检出限为2.8mg/L、定量限为16.4mg/L。本发明对LNT II和LNnT的回收率均在95％‑103％之间，具有良好的重现性，能够用于准确检验合成过程是否完成。

Description

一种利用离子色谱同时测定乳糖-N-丙糖II和乳糖-N-新四糖 的检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用离子色谱同时测定乳糖-N-丙糖II和乳糖-N-新四糖的检测方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
人乳寡糖(HMO)作为天然母乳中重要的营养成分，因其糖苷键与单糖的连接方式不同，在人体内以多种不同结构的形式存在，因而也呈现出不同的功能特性。为了给不能提供母乳喂养的家庭出生的婴儿也能够摄入人乳寡糖，近些年出现了多种基于不同生化原理的人乳寡糖的人工合成研究。已有研究表明，在半乳糖基转移酶的作用下，以UDP-半乳糖和乳糖-N-丙糖II(LNT II)为原料可以合成乳糖-N-新四糖(LNnt)。此外，乳糖-N-丙糖II(LNTII)和乳糖-N-新四糖(LNnt)与其他人乳寡糖的混合物可用于治疗和预防肠道和呼吸道的病毒感染。因而，一种灵敏度高、分离效果好的应用于同时检测乳糖-N-丙糖II(LNT II)和乳糖-N-新四糖(LNnt)含量的检测方法亟待开发。
发明内容
[技术问题]
现有技术暂无应用于同时检测乳糖-N-丙糖II(LNT II)和乳糖-N-新四糖(LNnt)含量的灵敏度高、分离效果好的检测方法。
[技术方案]
本发明利用阴离子交换色谱-脉冲安培法同时检测乳糖-N-丙糖II(LNT II)和乳糖-N-新四糖(LNnt)，即实现了同时检测当使用LNT II作为底物生产LNnT时的底物和产物的方法，能够用于准确检验合成过程是否完成，也可应用于人乳寡糖混合物中两种物质的含量是否达到相应要求。
为了实现上述目的，本发明的具体的技术方案为：一种利用离子色谱同时测定乳糖-N-丙糖II(LNT II)和乳糖-N-新四糖(LNnT)的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)配制标准储备液：称取LNT II和LNnT的标准品，加水定容得到标准储备液，备用；
(2)配制标准工作液：移取标准储备液配置成LNT II和LNnT质量比为1:1的不同浓度的混合标准工作液；
(3)利用阴离子交换色谱-脉冲安培法测定混合标准工作液中的LNT II和LNnT的含量并得到标准曲线，其中，
色谱条件为：保护柱：DionexCarboPacTM PA10 3mm*50mm Guard；分析柱：DionexCarboPacTM PA10 3mm*250mm Analytical，进样量20μL，流动相比例为：0min 80％A相+20％D相，10min 80％A相+20％D相，15min 80％A相+20％D相，20min 60％A相+40％D相，30min 60％B相+40％D相，31～40min 80％A相+20％D相，流动相流速为1mL/min；其中，A相：超纯水；B相：1mol/L CH3COONa；D相：250mmol/L NaOH；
脉冲安培条件：工作电极Au、参比电极Ag/AgCl，检测电位波形为
Figure BDA0003289552330000021
(4)按照步骤(3)的方法检测待测样品中LNT II和LNnT的出峰面积，并代入步骤(3)得到的标准曲线中计算得到待测样品中LNT II和LNnT的浓度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，标准储备液放置于4℃密封保存。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中标准储备液的浓度优选为200mg/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述混合标准工作液的浓度为1～100mg/L的梯度浓度，优选为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的标准曲线以LNT II和LNnT的出峰面积为横坐标，浓度为纵坐标。
本发明还提供了上述检测方法在制备LNnT过程的应用。
本发明取得的有益效果：
(1)本发明利用阴离子交换色谱-脉冲安培法同时检测乳糖-N-丙糖II(LNT II)和乳糖-N-新四糖(LNnt)，即实现了同时检测当使用LNT II作为底物生产LNnT时的底物和产物的方法，能够用于准确检验合成过程是否完成；
(2)本发明中LNT II的仪器检出限为1.4mg/L、定量限为15.1mg/L，LNnT仪器检出限为2.8mg/L、定量限为16.4mg/L。本发明对LNT II和LNnT的回收率均在95％-103％之间，具有良好的重现性。
附图说明
图1乳糖-N-丙糖II(LNT II)和乳糖-N-新四糖(LNnt)的色谱图。
图2为不同洗脱条件下，两种物质的色谱图，其中，(a)表示洗脱程序为75mmol/LNaOH等度洗脱；(b)表示洗脱程序为100mmol/L NaOH等度结合0-15min，CH3COONa 0-600mmol/L梯度洗脱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)标准储备液配制：分别称取200mg LNT II和LNnT的标准品，加水定容至10mL，放置于4℃密封保存；
(2)标准工作液的配置：准确移取标准储备液配置成浓度分别为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L的混合标准工作液，混合标准工作液中LNT II和LNnT的质量比为1:1。；
(3)
色谱条件为：
保护柱：DionexCarboPacTM PA10 3mm*50mm Guard
分析柱：DionexCarboPacTM PA10 3mm*250mm Analytical
进样量20μL
流动相为：A相超纯水；B相1mol/L CH3COONa；D相250mmol/L NaOH，洗脱程序见表1；
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0003289552330000031
脉冲安培条件：工作电极Au、参比电极Ag/AgCl，检测电位波形见表2。
表2检测电位波形
Figure BDA0003289552330000032
Figure BDA0003289552330000041
(4)标准曲线的绘制：以两种人乳寡糖的出峰面积为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线，得到线性方程，相关系数及仪器检出限见表3，可见，本方法灵敏度较高，准确性好，两种糖的分离度好，具有较强的可靠性。
表3标准曲线及相关系数
Figure BDA0003289552330000042
为验证方法的准确性，本实验对两种人乳寡糖进行了加标回收试验，取乳样品进行加标回收实验，以样品浓度的50％和100％分两组添加质量比为1:1的混标，结果为6次实验的平均值，经计算LNT II和LNnT的回收率均在95％-103％之间，相对标准偏差均小于3.1％，表明本方法具有良好的重现性。
对比例1
在应用于糖类分离的色谱柱中，根据柱填料基质粒径和柱容量的不同，有CarboPac PA1、PA10、PA20、PA100、PA200等色谱柱。其中，PA20主要用于分离单糖，本实验中的四糖在该色谱柱上的保留时间过长，不适用于该色谱柱；CarboPacPA100和PA200主要用于分离聚合度相对较高的低聚糖；而CarboPac PA1针对分子量接近的三糖四糖，分离度偏低；最终选择CarboPac PA10色谱柱对两种人乳寡糖进行分离，并能够实现快速、准确的分离。
对比例2
在确定了选用CarboPac PA10色谱柱后，比较了不同洗脱条件针对两种人乳寡糖的洗脱效果，图2中的(a)表示洗脱程序为75mmol/L NaOH等度洗脱，发现只出现了一个色谱峰，(b)表示洗脱程序为100mmol/L NaOH等度结合0-15min，CH3COONa 0-600mmol/L梯度洗脱，发现未能实现两种物质较好的分离。因此，最终确定先用梯度的氢氧化钠将LNT II洗脱下来，再加入醋酸钠进行梯度洗脱，使得LNnT出峰，实现两种物质更好的分离度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种利用离子色谱同时测定乳糖-N-丙糖II(LNT II)和乳糖-N-新四糖(LNnT)的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)配制标准储备液：称取乳糖-N-丙糖II和乳糖-N-新四糖的标准品，加水定容得到标准储备液，备用；
(2)配制标准工作液：移取标准储备液配置成LNT II和LNnT质量比为1:1的不同浓度的混合标准工作液；
(3)利用阴离子交换色谱-脉冲安培法测定混合标准工作液中的LNT II和LNnT的含量并得到标准曲线；
(4)按照步骤(3)的方法检测待测样品中LNT II和LNnT的出峰面积，并代入步骤(3)得到的标准曲线中计算得到待测样品中LNT II和LNnT的浓度；
其中，阴离子交换色谱的色谱条件为：保护柱：DionexCarboPacTM PA10 3mm*50mmGuard；分析柱：DionexCarboPacTM PA10 3mm*250mm Analytical，进样量20μL，流动相比例为：0min 80％A相+20％D相，10min 80％A相+20％D相，15min 80％A相+20％D相，20min60％A相+40％D相，30min 60％B相+40％D相，31～40min 80％A相+20％D相，流动相流速为1mL/min；其中，A相：超纯水；B相：1mol/L CH3COONa；D相：250mmol/L NaOH。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)的检测器条件为：工作电极Au、参比电极Ag/AgCl，检测电位波形为
Figure FDA0003289552320000011
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，标准储备液放置于4℃密封保存。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，标准储备液的浓度为200mg/L。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合标准工作液的浓度为1～100mg/L的梯度浓度。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述混合标准工作液的浓度为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的标准曲线分别以LNTII和LNnT的出峰面积为横坐标，浓度为纵坐标。
8.根据权利要求1～7任一项所述的检测方法在制备LNnT过程的应用。
9.根据权利要求1～7任一项所述的检测方法在食品领域中的应用。
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