CN113913296A - 一种肠道菌群的离心提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肠道菌群的离心提取方法，属于菌群提取技术领域，包括以下步骤：步骤(1)样本采集；步骤(2)样本处理；步骤(3)一次离心处理；步骤(4)二次离心处理；步骤(5)产品获取；本发明公开的一种在确保得率与菌群活性的情况下，降低离心成品中除优质肠道菌群以外杂质的含量，建立一套兼顾高菌群得率、高活菌比例且能维持稳定菌群结构的完整、高效的离心工艺。
Description
技术领域
本发明涉及菌群提取技术领域，尤其涉及一种肠道菌群的离心提取方法。
背景技术
诸多研究表明，菌群移植能够有效治疗艰难梭菌感染、IBD等各种传统治疗手段难以根治的疾病，同时在肿瘤等一些难以治愈的重大疾病上有着明显的辅助治疗能力；粪便中只有四分之一是固体物质，其成分大多是蛋白质、无机物、脂肪、未消化的食物纤维、残余消化液、从肠道脱落的细胞、细菌以及细菌的代谢产物；对于获取更多、更优质的肠道菌群较多的研究侧重于利用过滤或离心的方式进行除杂以收集菌体，却没有一个完整有效的方案流程；因此，如何有效的分离出肠道菌群，除去菌群以外的其他成分，保持肠道菌群的数量、活性及菌群丰度，成为亟待解决的问题。
研究表明，离心力的大小、离心时间等参数对收集的菌群质量和数量有较大影响，如离心条件直接影响菌群的得率、活菌数量以及菌群多样性等；离心条件对收集菌群至关重要，而现有技术中，一部分研究主要集中在菌群的品质纯度上，牺牲了菌群得率；而另一部分研究重心则放在菌群的得率上，牺牲了菌群的活性，收集到的菌泥中含有大量菌泥以外的杂质成分，在离心工艺上无法兼顾品质与得率。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提出一种在确保得率与菌群活性的情况下，降低离心成品中除优质肠道菌群以外杂质的含量，建立一套兼顾高菌群得率、高活菌比例且能维持稳定菌群结构的完整、高效的离心工艺.
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种肠道菌群的离心提取方法，包括以下步骤：
步骤(1)样本采集：准备三个健康供体(新鲜粪便)D份，分别溶解于E份0.9％NaCl溶液中，经粪便分析前处理仪处理去除残渣，得到F份的菌液a；
步骤(2)样本处理：将获得的菌液a倒入烧杯中，于磁力搅拌器上以400rpm的速度进行搅拌混合均匀，吸取菌液a于离心设备中；
步骤(3)一次离心处理：将步骤(2)中的菌液a，在25℃下进行离心处理，离心时间设置为15min，得到经过离心处理后的菌液b，对菌液b的得率、活菌率以及总菌量进行检测；
步骤(4)二次离心处理：将步骤(3)中离心15min后得到的菌液b，弃去上清液，用生理盐水重悬后按照离心时间为15min进行二次离心，得到经过二次离心处理后的菌液c，对菌液c的得率、活菌率以及总菌量进行检测；
步骤(5)产品获取：二次离心后的菌液c，加入相应的冻存保护剂后放入-80℃冰箱中进行冷冻保存。
本发明优选地技术方案在于，所述步骤(1)中所有样本均来自经过严格条件进行筛选的供体，样本的重量、形状和颜色均符合试验要求。
本发明优选地技术方案在于，所述步骤(3)和步骤(4)中获得的菌液b和菌液c分别用生理盐水稀释后，用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit染料对样本中的微生物进行染色，使用BD Accuri C6流式细胞仪进行区分，使用BD AccuriTM C6 PlusSoftware软件分析样本的活菌率和总菌数。
本发明优选地技术方案在于，所述步骤(3)和步骤(4)中，通过分析天平分别称取离心后收集菌群的重量，并进行得率的计算。
本发明优选地技术方案在于，试验数据采用SpSS 22.0 Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子，并进行方差分析并进行Duncan氏多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。
本发明优选地技术方案在于，所述统计显著性水平为p<0.05，极显著性水平为p<0.01。
本发明优选地技术方案在于，试验所涉及的器材包括高速离心仪、移液枪、生物安全柜、高通量测序机、流式细胞仪、电子天平、涡旋振荡器、Illumina HiSeq2500、粪便分析前处理仪及配套耗材。
本发明优选地技术方案在于，在二次离心的基础上，分别对三个供体进行取样，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini KIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本，基于16S rRNA V3-V4区段基因序列进行文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，借助生信分析平台通过Usearch进行OTU聚类分析获得菌群丰度和组成信息。
本发明优选地技术方案在于，所述步骤(3)和步骤(4)中，离心转速设置为5000rpm。
本发明的有益效果为：本发明综合考量离心成品的得率、活性以及总菌数等指标，得到最优的离心时间为：一次离心15min后弃去上清液，用生理盐水重悬后再次离心15min；同时结合高通量测序进一步从丰度上进行评估验证，发现该离心条件下对菌群丰度无显著影响；实现了在确保得率与菌群活性的情况下，降低离心成品中除优质肠道菌群以外杂质的含量，建立一套兼顾得率和品质的完整、高效的离心工艺及相关参数。
本发明提供的一种在确保得率与菌群活性的情况下，降低离心成品中除优质肠道菌群以外杂质的含量，建立一套兼顾高菌群得率、高活菌比例且能维持稳定菌群结构的完整、高效的离心工艺。
附图说明
图1是本发明一次离心试剂对菌群得率、活菌率及菌数影响情况表；
图2是本发明一次离心时间对菌群得率、活菌率及菌数影响情况示意图；
图3是本发明二次离心试剂对菌群得率、活菌率及菌数影响情况表；
图4是本发明二次离心时间对菌群得率、活菌率及菌数影响情况示意图；
图5是本发明三个供体10min、15min、20min处理组主成分分析PCA图；
图6是本发明三个供体二次离心10min、15min、20min处理组菌群结构丰度图；
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
一种肠道菌群的离心提取方法，包括以下步骤：
步骤(1)样本采集：准备三个健康供体(新鲜粪便)D份，分别溶解于E份0.9％NaCl溶液中，经粪便分析前处理仪处理去除残渣，得到F份的菌液a；
步骤(2)样本处理：将获得的菌液a倒入烧杯中，于磁力搅拌器上以400rpm的速度进行搅拌混合均匀，吸取菌液a于离心设备中；
步骤(3)一次离心处理：将步骤(2)中的菌液a，进行离心处理，离心时间设置为15min，得到经过离心处理后的菌液b，对菌液b的得率、活菌率以及总菌量进行检测；
步骤(4)二次离心处理：将步骤(3)中离心15min后得到的菌液b，弃去上清液，用生理盐水重悬后按照离心时间为15min进行二次离心，得到经过二次离心处理后的菌液c，对菌液c的得率、活菌率以及总菌量进行检测；
步骤(5)产品获取：二次离心后的菌液c，加入相应的冻存保护剂后放入-80℃冰箱中进行冷冻保存。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，所述步骤(1)中所有样本均来自经过严格条件进行筛选的供体，样本的重量、形状和颜色均符合试验要求。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中获得的菌液b和菌液c分别用生理盐水稀释后，用LIVE/DEADTMBacLightTM Bacterial Viability Kit中的PI和SYTO9染料对样本进行染色，使用BD Accuri C6流式细胞仪进行区分，使用BDAccuriTM C6 Plus Software软件分析活菌率和总菌数。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，所述所述步骤(3)和步骤(4)中，通过分析天平分别称取离心后收集菌群的重量，并进行得率的计算。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，试验数据采用SpSS 22.0Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子进行方差分析并进行Duncan氏多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，所述显著性水平为p<0.05，极显著性水平为p<0.01。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，试验所涉及的器材包括高速离心机、移液枪、生物安全柜、高通量测序仪、流式细胞仪、电子天平、涡旋振荡器、IlluminaHiSeq2500、粪便分析前处理仪(承葛生物科技有限公司)及配套耗材。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，在二次离心的基础上，分别对三个供体进行取样，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini KIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本，基于16S rRNA V3-V4区段基因序列进行文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，借助生信分析平台通过Usearch进行OTU聚类分析获得菌群丰度和组成信息。
作为本方案的一种可能的实施方式，优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中，离心转速设置为5000rpm。
本实施例中，D、E与F的比例为：D为100～200g，E为750～1000mL，F为600～850mL；
对菌液a在3min、6min、10min、15min、20min的时间设置下，进行一次离心处理，每组试验3个重复，取3个重复组的平均值，获得如附图1和附图2关于在不同时间下，一次离心处理对菌群得率、活菌率以及菌数的影响情况，其中A为三供体样本一次离心不同时间的菌群重量；B为三供体样本一次离心不同时间的菌群活性；C为三供体样本一次离心不同时间的菌群总菌量，因此采用一次离心对菌液a在不同时间处理下所获得计算得率(菌种重量g)、活菌率(％)和总菌数(个)的菌液b的数据情况如下：
(1)从菌泥重量来看，供体1离心15min组重量显著大于其余组(p<0.05)；供体2离心3min和10min组重量与6min和15min组无显著区别(p>0.05)但大于20min组(p<0.05)；供体3离心15min组重量与离心10min和20min组无显著区别(p>0.05)但大于3min和6min组(p<0.05)；
(2)从活性来看，供体1离心15min和20min组活性与离心10min组无显著区别(p>0.05)但大于3min和6min组(p<0.05)；供体2各组间无显著区别(p>0.05)；供体3离心15min组活性与离心6min组无显著区别(p>0.05)但大于3min、10min和20min组(p<0.05)；
(3)从总菌量来看，供体1离心15min总菌量与离心10min和20min组无显著区别(p>0.05)但大于3min、6min组(p<0.05)；供体2离心15min总菌量显著大于其余各组(p<0.05)；供体3离心15min组总菌量和20min组无显著差异(p>0.05)，但显著大于3min、6min和10min组(p<0.05)；
根据三个供体的一次离心处理情况可知，在同等条件下离心15min获得的菌泥重量、活性以及总菌数为最优，即在保证菌群得率和活性的情况下同时获得的菌群含量最高，因此得出结论：一次离心的最优时长为15min。
二次离心是在一次离心15min的基础上，将一次离心产物(菌液b)用生理盐水重悬后再按照离心时长3min、6min、10min、15min、20min的时间设置进行二次离心，每组试验3个重复，取3个重复组的平均值，获得如附图3和附图4关于在不同时间下，二次离心处理对菌群得率、活菌率以及菌数的影响情况，其中A为三供体样本二次离心不同时间的菌群重量；B为三供体样本二次离心不同时间的菌群活性；C为三供体样本二次离心不同时间的菌群总菌量，因此采用二次离心对菌液b在不同时间处理下所获得计算得率(菌种重量g)、活菌率(％)和总菌数(个)的菌液c的数据情况如下：
(1)从重量上看，供体1离心15min重量显著大于其余组(p<0.05)；供体2各组间重量无显著性差异(p>0.05)；供体3离心15min组重量与3min、10min和20min组无显著性差异(p>0.05)，但显著大于6min组(p<0.05)；
(2)从活性上看，供体1离心10min、15min和20min组活性显著大于3min组和6min组(p<0.05)；供体2离心10min和15min组活性与6min和20min组无显著差异(p>0.05)，但大于3min组(p<0.05)；供体3离心6min、10min、15min和20min组活性显著大于3min组(p<0.05)；
(3)从总菌量上看，供体1离心15min和20min组总菌量与10min组无显著性差异(p>0.05)，但大于3min和6min组(p<0.05)；供体2离心10min、15min和20min组总菌量显著大于3min和6min组(p<0.05)；供体3离心15min组总菌量显著大于其余各组(p<0.05)；
根据三个供体二次离心处理后的情况可知，在同等条件下，离心15min获得的菌泥重量、活性以及总菌数为最优，即在保证菌群得率和活性的情况下同时获得的菌群含量最高，因此得出结论：二次离心的最优时长为15min。
从菌群结构进一步对离心效果进行检测，在二次离心的基础上，分别对三个供体10min、15min、20min处理组进行取样(每组3个重复)，QIAamp Fast DNA Stool Mini KIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本后基于16S rRNA V3-V4区段基因序列进行文库构建，并于Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，分析获得菌群的菌群丰度；
测试结果如附图5和附图6所示，三组菌群丰度差异不大，丰度最高的均为Prevotella_9菌属，其次为Bacteroides、Alloprevotella、Megamonas等菌属；同时，从三个供体二次离心10min、15min、20min处理组的Principal Component Analysis(PCA)图来看，离心时间对菌群丰度无显著影响(p＝0.984)，其中PCA图中含量从上到下依次为Prevotella_9、Bacteroides、Alloprevotella、Megamonas、Faecalibacterium、Roseburia、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-001、Akkermansla、Escherichia-Shigella、Desuifovibrio、Sutterella、Parasutterlla、Phascolarctobacterium、un_f_Muribaculaceae、Veillonella、Parabacteroides、Ruminococcaceae_UCG-003、Prevotella_2、Others；
综上所述，通过以得率、活性及总菌量为指标对肠道菌群提取过程中的离心时间进行研究，得到最优的离心时间为：一次离心15min后弃去上清液，用生理盐水重悬后再次离心15min；同时结合高通量测序进一步从丰度上进行评估验证，发现在该离心条件下对菌群丰度无显著影响。
本发明是通过优选实施例进行描述的，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，其他落入本申请的权利要求内的实施例都属于本发明保护的范围。
Claims (9)
1.一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)样本采集：准备三个健康供体(新鲜粪便)D份，分别溶解于E份0.9％NaCl溶液中，经粪便分析前处理仪处理去除残渣，得到F份的菌液a；
步骤(2)样本处理：将获得的菌液a倒入烧杯中，于磁力搅拌器上以400rpm的速度进行搅拌混合均匀，吸取菌液a于离心设备中；
步骤(3)一次离心处理：将步骤(2)中的菌液a，在25℃下进行离心处理，离心时间设置为15min，得到经过离心处理后的菌液b，对菌液b的得率、活菌率以及总菌量进行检测；
步骤(4)二次离心处理：将步骤(3)中离心15min后得到的菌液b，弃去上清液，用生理盐水重悬后按照离心时间为15min进行二次离心，得到经过二次离心处理后的菌液c，对菌液c的得率、活菌率以及总菌量进行检测；
步骤(5)产品获取：二次离心后的菌液c，加入相应的冻存保护剂后放入-80℃冰箱中进行冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
所述步骤(1)中所有样本均来自经过严格条件进行筛选的供体，样本的重量、形状和颜色均符合试验要求。
3.根据权利要求1所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
所述步骤(3)和步骤(4)中获得的菌液b和菌液c分别用生理盐水稀释后，用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit染料对样本中的微生物进行染色，使用BDAccuri C6流式细胞仪进行区分，使用BD AccuriTMC6 Plus Software软件分析样本的活菌率和总菌数。
4.根据权利要求1所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
所述步骤(3)和步骤(4)中，通过分析天平分别称取离心后收集菌群的重量，并进行得率的计算。
5.根据权利要求1所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
试验数据采用SpSS 22.0 Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子进行方差分析并进行Duncan氏多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。
6.根据权利要求5所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
所述统计显著性水平为p<0.05，极显著性水平为p<0.01。
7.根据权利要求1所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
试验所涉及的器材包括高速离心机、移液枪、生物安全柜、高通量测序仪、流式细胞仪、电子天平、涡旋振荡器、Illumina HiSeq2500、粪便分析前处理仪及配套耗材。
8.根据权利要求1所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
在二次离心的基础上，分别对三个供体进行取样，使用QIAamp Fast DNA Stool MiniKIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本，基于16S rRNA V3-V4区段基因序列进行文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，借助生信分析平台通过Usearch进行OTU聚类分析获得菌群丰度和组成信息。
9.根据权利要求1所述的一种肠道菌群的离心提取方法，其特征在于：
所述步骤(3)和步骤(4)中，离心转速设置为5000rpm。
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Non-Patent Citations (1)
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| 董鹏飞: "肠道菌群DNA提取与鉴别技术研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑, no. 02, pages 23 - 24 * |
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