CN113908127B - 一种用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的囊泡 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗由幽门螺杆菌感染引起的疾病的囊泡,其中所述囊泡包括:构成囊泡主体的脂质双分子层;以及嵌入在所述脂质双分子层中的用于修复宿主细胞脂筏结构阻断免疫逃逸的胆固醇、幽门螺杆菌敏感性抗生素以及用于恢复自噬溶酶体对细菌降解作用来杀灭胞内幽门螺杆菌的钙三醇;其中,所述脂质为磷脂或/和鼠李糖脂。本发明还涉及一种药物组合物,其包含该治疗由幽门螺杆菌感染引起疾病的囊泡及药学上可接受的载体。本发明的囊泡在能够清除菌膜‑杀死游离菌‑抑制残余菌再黏附的基础上,通过恢复免疫应答并增强胞内菌杀伤作用,进一步提高幽门螺杆菌的清除率。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的囊泡。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一种螺杆形状、微需氧的革兰氏阴性菌,被发现定植于胃上皮细胞的腔表面。已有报告指出,H. pylori感染是一种疾病状态,除非有抗衡因素,否则所有H. pylori感染者都应该接受根除治疗。但大剂量和长期使用抗生素会诱发耐药菌株的产生,导致H. pylori治疗面临更严重的挑战。
H. pylori在体外对很多抗生素敏感,但是大多数抗生素不能抵抗胃酸环境。此外,胃黏膜的存在也削弱了抗生素的递送效果。根除H. pylori失败与多种因素有关,其中H. pylori与宿主的关系起着重要的作用。在宿主体内,大部分细菌处于游离形式或者菌膜(对抗菌药物耐受性更高)的形式黏附定植于胃上皮细胞表面。菌膜(biofilm)指H. pylori嵌入自身分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)内并附着在生物或非生物表面的群落,其中,EPS主要由多糖和蛋白质组成。此外,通过耗竭宿主胃上皮细胞膜脂筏中的胆固醇,H. pylori会损伤脂筏中的相关细胞因子受体结构,阻断下游免疫通路,无法刺激巨噬细胞吞噬清除病原菌,从而H. pylori实现免疫逃逸。同时,H. pylori是一种兼性胞内病原体,不仅能在非吞噬细胞中存活,甚至在吞噬细胞中同样有侵袭和存活的能力。H. pylori已经在自噬体中被检测到,这表明自噬体是H. pylori增殖及维持细胞内感染的特殊生态位。这种存活在细胞内的H. pylori可以避免很多抗菌药物的直接接触,增加了后续治疗的难度。因此,H. pylori能够以胞内存活形式来逃脱药物治疗,进而导致感染的复发。
因此,现存的H. pylori根除疗法仍有较大的局限性。如何实现对H. pylori的根除性治疗是本领域急需解决的问题。
发明内容
本发明一方面提供一种用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的囊泡,其中所述囊泡包括:构成囊泡主体的脂质双分子层;以及嵌入在所述脂质双分子层中的用于修复脂筏结构的胆固醇(阻断免疫逃逸)、幽门螺杆菌敏感性抗生素以及用于恢复自噬溶酶体对细菌降解作用(治疗胞内感染)的钙三醇;其中,所述脂质为磷脂或/和鼠李糖脂。
在一些实施方式中,其中所述脂质为鼠李糖脂。在一些实施方式中,其中所述鼠李糖脂为水溶性鼠李糖脂。在一些实施方式中,当所述鼠李糖脂是脂溶性鼠李糖脂时,所述胆固醇为PEG修饰的胆固醇。在一些实施方式中,其中鼠李糖脂双分子层中进一步包载有DSPE-PEG。在一些实施方式中,其中所述鼠李糖脂与所述胆固醇的质量比为8~1:1~0.5。在一些实施方式中,其中所述幽门螺杆菌敏感性抗生素选自阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、四环素、左氧氟沙星、呋喃唑酮或其组合。在一些实施方式中,其中所述囊泡的粒径为小于200nm。
本发明另一方面提供一种药物组合物,其包含上述的囊泡中的任意一种及药学上可接受的载体。
在一些实施方式中,所述药物组合物还包含质子泵抑制剂、铋剂或其组合。在一些实施方式中,其中所述质子泵剂选自奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、艾司奥美拉唑、艾普拉唑、埃索美拉唑和莱米诺拉唑。在一些实施方式中,所述铋剂选自枸橼酸铋钾、胶体果胶铋、碱式水杨酸铋和碱式硝酸铋。
本发明再一方面提供上述的囊泡中任一种在制备用于治疗由幽门螺杆菌感染引起疾病的药物中的应用。
在一些实施方式中,其中所述疾病选自慢性胃炎、消化性溃疡、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌。
本发明再一方面提供一种用于治疗由幽门螺杆菌引起疾病的混合物,其包含鼠李糖脂、用于修复宿主细胞脂筏结构的胆固醇、幽门螺杆菌敏感性抗生素以及用于恢复自噬溶酶体对细菌降解作用的钙三醇。
本发明的囊泡是以鼠李糖脂(RHL)为载体材料构建包载胆固醇(Chol)、幽门螺杆菌敏感抗生素和钙三醇的多功能囊泡,其中构成囊泡脂质双分子层的RHL可与H. pylori菌膜融合,破坏菌膜结构释放出内部细菌,分散的细菌可快速恢复对抗生素的敏感性;囊泡还可抑制未被杀灭的残留细菌的再黏附从而抑制菌膜的再形成。被H. pylori破坏的宿主细胞膜上脂筏结构可通过囊泡中的Chol的补充得以修复,重构相关细胞因子受体,恢复下游免疫应答,从而诱导巨噬细胞吞噬残余细菌;钙三醇则可上调相关受体蛋白水平,恢复溶酶体H+、Ca2+正常交换,从而恢复溶酶体的正常酸化,促进自噬溶酶体降解胞内存活的H. pylori,进一步提高杀菌效果。本发明的囊泡在“清除菌膜-杀死游离细菌-抑制残余细菌再黏附”的基础上,进一步通过恢复免疫应答以及增强胞内杀菌作用,三管齐下,以达到提高H. pylori清除率的目的。
附图说明
图1为表征水溶性RHL制备的囊泡(water soluble-RHL vesicle, WRV)(a)和脂溶性RHL制备的囊泡(liposoluble-RHL vesicle, LRV)(b)的透射电镜图。
图2 为结晶紫染色法评价囊泡对菌膜的清除效果。*P < 0.05 and **P < 0.01,vs. model; #P < 0.05, vs. CLR+RHL.
图3 为通过扫描电镜评价囊泡对菌膜的清除效果。
图4 为通过苯酚硫酸法和BCA试剂盒检测法分别测定囊泡对EPS中多糖与蛋白质的清除率。*P < 0.05, vs. control (polysaccharide); ##P < 0.01, vs. control(protein).
图5为荧光标记定性检测囊泡对EPS成分多糖的清除率。
图6 为扫描电镜评价囊泡对菌膜及细菌形态的影响。
图7 为幽门螺杆菌对囊泡的敏感性评价。
图8 为死活菌染色法评价囊泡对菌膜内部细菌的杀伤作用。
图9 为囊泡对分散菌的杀灭情况。
图10 为囊泡抑制菌膜形成的评价。*P < 0.05 and **P < 0.01, vs. 0.
图11 为囊泡增强巨噬细胞迁移的作用。
图12 为囊泡处理后细胞内幽门螺杆菌的存活率。*P < 0.05, **P < 0.01 and***P < 0.001, vs. control. # P < 0.05, vs. water soluble-RHL+CLR+Chol+calcitriol。
具体实施方式
术语“幽门螺杆菌敏感性抗生素”是指特定抗生素对在一定浓度能够抑制幽门螺杆菌生长或杀灭幽门螺杆菌。该抗生素的例子包括但不限于:阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、四环素、左氧氟沙星、呋喃唑酮或其组合。
实施例1囊泡的制备
薄膜分散法:称取水溶性或脂溶性RHL、Chol、CLR和钙三醇分别溶解于氯仿后进行超声分散。将分散好的RHL溶液(含1 mg RHL)、Chol溶液(含0.5 mg Chol)、CLR溶液(含8 μgCLR)与钙三醇溶液(含33.3 μg钙三醇)混合均匀后加入至圆底烧瓶中,减压旋蒸后水化并超声分散,过0.22 μm滤膜即得。
实施例2 多功能囊泡的表征
包封率:实施例1制备好的载药囊泡,甲醇破乳后进样测定。色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6 mm, 5 μm);以乙腈为流动A,以磷酸盐缓冲液为流动相B,按A:B= 48:52进行洗脱;流速为每分钟1 ml;柱温为45℃;检测波长为210 nm。根据下列公式计算包封率。
其中,W1为囊泡中包封的药物含量,W0为体系中加入的药物量。
实验结果:水溶性RHL制成的囊泡(water soluble-RHL vesicle, WRV)和脂溶性RHL制成的囊泡(liposoluble-RHL vesicle, LRV)的药物包封率如表1所示,结果表明,两种囊泡对CLR的包封率相似。
表1 WRV和LRV的药物包封率
Table 4-5 The drug encapsulation efficiency of WRV and LRV
囊泡的外观形态:使用TEM观察WRV和LRV的外观形态:取20 μl样品溶液滴于干净平整的平面上,倒置铜网盖于液滴上。静置1-2 min,用滤纸吸走多余的样品溶液。使用磷钨酸染色1 min,再次用滤纸吸走多余的染液,干燥后置于TEM下观察。
实验结果:WRV(参见图1a)和LRV(参见图1b)在TEM观察下,制备得到的囊泡粒径小于200 nm,符合黏液层穿透的粒径要求。
实施例3 囊泡对菌膜的清除作用
(1)使用含2% FBS的脑心浸液肉汤(BHI)稀释H. pylori菌悬液至OD600nm值为0.2,并接种于48孔板内,放入相应规格的微需氧产气袋用以保持适宜的气体环境(5%O2,85% N2,10% CO2),静置于37℃培养箱内培养72 h。(2)药物处理:①为探讨囊泡中主要成分对清除菌膜的影响,本发明在保持RHL含量不变的情况下,分别制备包载有不同含量的Chol及CLR的囊泡。将各载药囊泡进行稀释,使各组囊泡的最高浓度一致,均为含600 μg/ml RHL,并按二倍法进行稀释。将培养好的菌膜从密封罐内取出,用无菌PBS洗涤以除去游离H. pylori后,加入稀释好的药物,重新放入密封罐内(微需氧产气袋不可重复使用,需要更换)培养24h。②为考察囊泡清除菌膜的效果,设置组别如下:游离CLR、游离CLR+阿莫西林(amoxicillin, AMX;抗生素联用组)、游离RHL、游离CLR+RHL(物理混合组)以及空白和载药的WRV与LRV。同一种药物的浓度在各个组别中保持一致,其中抗生素联用组中根据临床治疗指南将AMX浓度配制为CLR的2倍。稀释方法与加药方法同上。(3)结晶紫染色检测:取出48孔板,用PBS洗涤以除去游离菌,加入甲醇固定剩余菌膜量(biofilm biomass),干燥后加入1%结晶紫染色15 min,用流动水冲洗去多余染液,再次干燥后加入95%乙醇溶解染液,测定其在570 nm处的吸光度。(4)SEM观察:培养菌膜时,将菌悬液接种于放置有细胞爬片的孔板内方便SEM拍摄。药物处理方法如上。SEM视野的放大倍数分别为500倍和15000倍。
实验结果:结晶紫可以同时使菌膜中细菌及EPS染色,因而可以反映整体菌膜。结晶紫染色法考察囊泡对H. pylori菌膜的清除,结果见图2。在RHL含量保持不变的情况下,RHL: Chol质量比在6:1、4:1、2:1以及RHL: CLR质量比在1000:1、125:1、50:1时囊泡清除菌膜的效率基本相同,即Chol和CLR对菌膜清除的不起主要作用。然而,随着囊泡中RHL浓度的增加,囊泡对菌膜的清除作用随之增强,呈浓度依赖性(图2a, b)。如图2c所示,各组(同一种药物的浓度在各个组别中保持一致)在最高浓度下对菌膜的清除率如下:CLR(58.85%)、CLR+AMX(58.12%)、RHL(63.79%)、CLR+RHL(78.81%)、空白LRV(83.36%)、载药LRV(88.11%)、空白WRV(77.43%)、载药WRV(90.41%)。CLR与CLR+AMX效果基本一致,表明抗生素联用对菌膜清除没有明显改善。然而,与单独使用CLR或RHL相比,RHL与CLR联用可提高菌膜清除率至少15%。此外,空白LRV和WRV(不含CLR)清除菌膜的能力比游离态RHL强。载药的LRV和WRV清除菌膜的能力均优于空白LRV和WRV以及其他组。
用SEM观察菌膜结构及囊泡对菌膜的清除效果。结果如图3 a,对照组H. pylori黏附于固体表面形成菌膜,菌体之间聚集明显,菌膜结构普遍分布于整个视野中。菌膜清除结果与结晶紫染色结果基本一致,在LRV和WRV处理后,H. pylori外膜形态被破坏(图3 b,c)。而CLR和CLR+AMX组,H. pylori的形态与模型对照组相似,外膜较为完整,表明其对菌膜清除效果较差。
实施例4 囊泡对菌膜胞外多聚物的清除作用
首先使用BCA试剂盒和苯酚硫酸法分别定量测定囊泡对菌膜胞外多聚物(EPS)中蛋白质和多糖的清除率,然后用ConA-FITC荧光染料对EPS中的多糖进行标记,通过CLSM可视化观察药物对多糖的清除效果。
(1)样品准备与总EPS的提取:
i. 菌膜的培养:含2% FBS的BHI稀释菌悬液至OD600nm值为0.2,以10 ml/皿接种于90 mm空白细菌培养皿中,放入相应规格的微需氧产气袋用以保持适宜的气体环境(5% O2,85% N2,10% CO2),静置于37℃培养箱内培养72 h。
ii. 药物孵育:设置组别为:含2% FBS的BHI(模型对照组)、游离CLR、游离CLR+AMX(抗生素联用组)以及载药的WRV与LRV。同一种药物的浓度在各个组别中保持一致,其中,CLR浓度为4.8 μg/ml,AMX浓度为9.6 μg/ml,WRV与LRV浓度为含600 μg/ml RHL和4.8 μg/ml CLR。将培养好的菌膜从密封罐内取出,用无菌PBS洗涤以除去游离H. pylori后,加入稀释好的药物,重新放入密封罐内孵育24 h。
iii. 总EPS的提取:取出药物处理后的菌膜,用无菌PBS洗涤以除去游离H. pylori,加入10 ml无菌PBS,使用细胞刮刀刮下培养皿上剩余菌膜后,使用超声波细胞破碎仪进行破碎,持续4 min(60 W功率)。液体转移入离心管内进行高速离心(11000 rpm,15min),上清液挤压过0.22 μm聚醚砜膜。滤液于3500 kDa透析袋中连续透析24 h,期间换水2-3次。将透析后的液体进行冷冻干燥,冻干粉末溶解于无菌二级水内,4℃保存待用。
(2)蛋白质的定量测定
i. 蛋白质标准品的配制:将2 mg/ml牛血清白蛋白标准品(BSA)依次稀释成800、250、125、50和10 μg/ml溶液。
ii. BCA工作液的配制:将BCA试剂A与试剂B以50:1比例混合,搅拌均匀,储存于密闭容器中,室温保存待用。
iii. 标准溶液与样品的测定:取25 μl各稀释浓度的标准品溶液和EPS样品溶液分别与200 μl BCA工作液混合加入到96微孔板内,在振荡器上震荡30 s使其充分混匀。将微孔板密封,60℃避光孵育60 min,测定其在562 nm处的吸光度值(OD562nm)。绘制标准曲线,并以此来计算各个样品的蛋白质浓度。
(3)多糖的定量测定
i. 葡萄糖标准溶液的配制:称取适量葡萄糖,溶解于二级水中,并依次稀释成500、200、80、50和10 μg/ml溶液。
ii. 标准溶液与样品的测定:取60 μl各稀释浓度的标准品溶液和EPS样品溶液分别、依次与60 μl 5%苯酚溶液、200 μl浓硫酸混合,用封口膜将其密封。90℃水浴避光孵育30 min,取200 μl反应后的样品溶液至96微孔板内,测定其在490 nm处的吸光度值(OD490nm)。绘制标准曲线,并以此来计算各个样品的多糖浓度。
(4)FITC-ConA标记多糖进行可视化观察
培养菌膜时,使用含2% FBS的BHI稀释菌悬液至OD600nm值为0.2,并接种于激光共聚焦皿中,静置培养72 h。药物处理与EPS的提取部分相同,浓度为其1/2。加入ConA-FITC染料避光孵育15 min,PBS洗去多余的染液,置于CLSM下观察(激发波长为488 nm)。
实验结果:
EPS成分清除的定量检测
EPS是菌膜的主要组成成分,而蛋白质和多糖又是EPS的主要成分,两者对维持菌膜结构有重要作用。将测得的吸光度(OD562nm值)代入蛋白质和葡萄糖的标准曲线,计算出各组EPS蛋白质和多糖的含量,经分析后得到不同组药物处理菌膜后对EPS中蛋白质与多糖的清除率。图4所示,LRV和WRV的清除效果优于CLR和CLR+AMX联用。
荧光标记EPS多糖的清除
ConA可选择性结合于多种糖类分子上,因此使用连接ConA的FITC进行菌膜EPS中多糖的标记,检测结果如图5。与上述定量检测结果一致,WRV和LRV能更有效地清除多糖,其清除效果优于CLR以及CLR+AMX联用。图5 a显示对照组有成团均匀分布的绿色荧光(菌膜)。抗生素及抗生素联用后多糖仍呈聚集分布,表明菌膜中的多糖网络结构仍然比较完整(图5d, e)。WRV和LRV组则显示菌膜中的多糖稀疏地分散于整个视野,表明WRV和LRV能提高多糖的清除率,从而破坏菌膜的完整性,进一步促使H. pylori从内部分散,最终提高菌膜的清除率。
实施例5 囊泡对菌膜内部细菌形态的影响
培养菌膜时,使用含2% FBS的BHI稀释菌悬液至OD600nm值为0.2,并接种于放置有细胞爬片的孔板内方便SEM拍摄。药物处理与实施例4(4)的样品准备部分相同。SEM视野的放大倍数为30000倍。
实验结果:用SEM观察H. pylori菌膜的结构和形态特征,结果如图6。对照组(图6a)中H. pylori呈现菌膜的典型特征,由长螺旋杆状变成类球形,且表面完整光滑,未见细胞膜损伤。经WRV和LRV处理后,H. pylori菌体细胞膜表面粗糙,部分表面皱缩凹陷,菌体之间呈现明显的融合(图6 b, c)。这表明经WRV和LRV处理后,菌膜中的H. pylori细胞膜完整性被破坏,这是由于WRV和LRV破坏了菌膜的EPS结构,使药物能更好地渗透进菌膜内部并发挥药效。理论上,CLR和AMX均会对细菌细胞膜产生影响。然而图6 d和6 e显示,CLR和CLR+AMX作用于H. pylori菌膜后,菌体与对照组相比未呈现明显差异。
实施例6 幽门螺杆菌对囊泡的敏感性评价
使用测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的方法表征游离H. pylori对囊泡的敏感性。(1)药物的稀释:配制并稀释游离CLR、WRV和LRV,使三者含CLR的量保持一致,用两倍法进行梯度稀释,使所含CLR的最高浓度均为768 ng/ml。(2)药物处理:收集菌落至含10% FBS的BHI中,并稀释菌悬液至OD600nm值为0.1,以150 μl/孔加至48孔板中。每孔加入50 μl药物溶液(此时所含CLR的最终最高浓度为192 ng/ml),模型对照组加入50 μl含10%FBS的BHI培养基。放入相应规格的微需氧产气袋用以保持适宜的气体环境(5%O2,85% N2,10% CO2),于37℃培养箱内振荡(100 rpm)培养72-96 h至对照组内菌悬液呈现浑浊状。(3)MIC值的测定:将培养好的48孔板取出,吸取48孔内液体至96孔板内,置于酶标仪上测定OD600nm值。抑制90% H. pylori生长的最低浓度即为MIC90值。
实验结果:为考察CLR被囊泡装载后是否会降低其活性,我们检测了载药囊泡对H. pylori的抑菌效果。MIC通常用于衡量抗菌药物抑制病原微生物生长的能力。游离H. pylori对CLR与WRV、LRV的敏感性检测(即MIC)结果如图7所示。三者在低浓度(<MIC,亚抑制浓度)时均促进H. pylori的生长。而当浓度达到MIC即24 ng/ml时能基本抑制(≥90%抑制率,且肉眼观察无浑浊)H. pylori的生长,且WRV、LRV与CLR的MIC无明显差异,这表明将CLR包封在囊泡内不会降低CLR的抗菌能力。
实施例 7 囊泡对菌膜内部细菌的杀伤作用
使用SYTO9/PI混合荧光染料标记药物处理后的菌膜,活菌为绿色(SYTO9)及死菌为红色(PI),以此来检测囊泡对菌膜内部H. pylori的杀灭情况。(1)菌膜的培养:选择含2%FBS的BHI稀释菌悬液至OD600nm值为0.2,接种于激光共聚焦皿中,静置培养72 h。(2)药物处理:配制游离CLR溶液,使其浓度分别为24 μg/ml(1000× MIC)、12 μg/ml(500× MIC)、4.8μg/ml(200× MIC)和2.4 μg/ml(100× MIC)。固定RHL浓度为600 μg/ml,分别制备空白不载CLR的囊泡,以及包载有不同含量的CLR的囊泡:24 μg/ml(1000× MIC)、4.8 μg/ml(200× MIC)、2.4 μg/ml(100× MIC)、1.2 μg/ml(50× MIC)。模型对照组为含2% FBS的BHI。将培养好的菌膜从密封罐内取出,用无菌PBS洗涤以除去游离H. pylori,加入稀释好的药物,重新孵育培养24 h。(3)CLSM检测:取出激光共聚焦皿,PBS洗涤,加入SYTO9/PI混合染料避光孵育15 min,置于CLSM下观察。SYTO9的激发波长为488 nm,PI的激发波长为561 nm。
实验结果:CLR对菌膜内部细菌的杀伤作用如图8 a所示,在高浓度CLR的作用下,绿色荧光减少,这说明CLR在一定程度上能清除菌膜,且清除率随浓度的升高而缓慢增加。然而,即使浓度达到1000× MIC,CLR对菌膜也仅能部分清除,且无法完全杀灭菌膜内部的H. pylori,表明H. pylori形成菌膜后对CLR的抗性增强。如图8 b所示,用空白囊泡处理菌膜,绿色荧光呈星点稀疏分布,提示空白囊泡能有效清除绝大部分的菌膜;同时视野未看到红色荧光,说明空白囊泡对菌膜内部的H. pylori杀伤能力较弱。囊泡载入不同含量的CLR后,可见零星的绿色荧光及少量红色荧光,说明载药囊泡可杀灭菌膜内部细菌;其次,载药囊泡有较好的菌膜渗透性可杀死内部细菌。结果图显示,200× MIC的载药囊泡组红绿色荧光重合,说明200× MIC 的载药囊泡既能清除菌膜又能有效杀死内部H. pylori。综上,载有CLR的囊泡有效清除菌膜的同时,也能有效杀灭残存在分散状菌膜内部的H. pylori。
实施例8 囊泡对分散菌的杀灭作用
使用平板菌落计数法来检测囊泡对分散H. pylori的杀灭能力,具体方法如下:(1)使用含2% FBS的BHI稀释菌悬液至OD600nm值为0.2,接种于48孔板内,放入相应规格的微需氧产气袋用以保持适宜的气体环境(5%O2,85% N2,10% CO2),于37℃培养箱内静置培养72h。(2)药物处理:设置组别如下:游离CLR、游离CLR+AMX(抗生素联用组)、以及WRV与LRV。同一种药物的浓度在各个组别中保持一致,其中,参照临床治疗指南,抗生素联用组中AMX浓度为CLR的2倍。将培养好的菌膜从密封罐内取出,用无菌PBS洗涤以除去游离H. pylori后,加入稀释好的药物,重新放入密封罐内孵育。(3)凃板培养:取出孵育好的48孔板,吸取各组别的上层溶液,8000 rpm离心3 min除去上清液(含有药物)后,加入BHI轻微吹打使沉淀(H. pylori)重悬。吸取50 μl重悬液至哥伦比亚血平板内,加入等体积FBS,L型涂布棒均匀涂布。放入相应规格的微需氧产气袋用以保持适宜的气体环境(5%O2,85% N2,10% CO2),于37℃培养箱内静置培养72-96 h。(4)菌落数检查:取出培养好的血平板,进行菌落计数。
实验结果:如图9所示,对照组中平板上有大量菌落存在,提示未经药物处理时脱落的H. pylori中有大量活菌,包括未形成菌膜的H. pylori以及从菌膜中分散出来的H. pylori。经CLR或CLR+AMX处理的菌膜,平板上也有一些可见的菌落(图9 d和e),说明游离抗生素不能完全杀灭从菌膜中分散出来的H. pylori。而经WRV和LRV处理的菌膜,在平板上未见菌落分布(图9 b和c),表明囊泡对游离H. pylori和从菌膜中分散出来的H. pylori均有较高的杀灭作用,这是囊泡快速地破坏了菌膜的结构,使内部的H. pylori很快就被分散出来,这些被分散出来的H. pylori恢复对抗生素敏感。因此,囊泡能有效地杀灭从菌膜里分散出来的H. pylori,有效阻断了脱落的细菌伺机重新黏附、定植形成新的菌膜造成的反复感染。
实施例 9 囊泡抑制幽门螺杆菌的黏附及菌膜的形成
使用结晶紫染色法考察囊泡抑制H. pylori黏附形成菌膜的能力,具体方法如下:(1)药物的稀释:配制并稀释游离CLR、CLR+AMX以及WRV和LRV,使四者含CLR的量保持一致,且CLR的最高浓度为MIC即240 ng/ml。(2)药物处理:收集菌落至含2% FBS的BHI中稀释菌悬液至OD600nm值为0.2,并加至48孔板中。每孔加入药物溶液使所含CLR的最终最高浓度为24ng/ml,模型对照组加入含2% FBS的BHI培养基代替药物。①首先检测不同浓度的药物抑制H. pylori黏附形成菌膜的效果初评:药物与菌悬液充分混合后,放入相应规格的微需氧产气袋用以保持适宜的气体环境(5%O2,85% N2,10% CO2),于37℃培养箱内静置培养48 h。②其次考察药物在不同时期是否能维持有效抑制H. pylori的黏附:只取最高浓度的药物溶液与菌悬液进行共孵育,放入相应规格的微需氧产气袋用以保持适宜的气体环境(5%O2,85% N2,10% CO2),于37℃培养箱内分别静置培养4、8、12、24、48 h。(3)结晶紫染色检测:①菌膜培养48h后取出,用PBS洗涤以除去游离菌,加入甲醇固定剩余菌膜量,干燥后加入1%结晶紫染色15 min,用流动水冲洗去多余染液,再次干燥后加入95%乙醇溶解染液,测定其在570 nm处的吸光度。②菌膜分别培养4、8、12、24、48 h后取出进行结晶紫染色,方法同上。
实验结果:有效地清除菌膜,并且完全杀灭从菌膜中分散出来的H. pylori是一种理想状态。但是体内环境复杂,需要考虑有少量残留的H. pylori未被杀灭的情况。因此,囊泡抑制游离H. pylori再黏附、定植从而阻断新菌膜的形成与清除菌膜及杀灭脱落的H. pylori同等重要。因此,我们将囊泡与H. pylori共孵育48 h,考察在不同浓度下药物抑制H. pylori黏附的能力。如图10 a所示,囊泡呈浓度依赖性地抑制H. pylori的黏附。CLR、CLR+AMX、WRV和LRV分别抑制了70.9%、70.5%、89.8%和83.8%的H. pylori黏附。细菌与表面短时间接触(2-4 h)即可引发不可逆的黏附(初始黏附期),因此抑制细菌在初始黏附期的黏附非常关键。且囊泡发挥抑制黏附作用的持续时长也很重要。因此,接下来我们考察了囊泡在不同时间取点下对细菌黏附的抑制作用,抑制—时间曲线如图10 b所示。CLR和CLR+AMX在4-24 h内均无法有效地抑制H. pylori的黏附。而WRV和LRV不仅初始黏附期就能有效抑制H. pylori的黏附,并且随时间的延长黏附量始终不增加。
实施例 10 囊泡对巨噬细胞迁移的增强作用
构建双细胞共培养的体外模型,通过细胞迁移实验考察囊泡增强巨噬细胞迁移作用。(1)细胞培养:取出冻存的Raw264.7细胞和MGC-803细胞置于37℃水浴下快速解冻,分别将1 ml两种细胞悬液与9 ml培养基充分混匀,1000 rpm离心3 min除去上清液,加入7-8 ml新鲜培养基重悬后,分别加入至培养皿中,混匀,37℃、5% CO2环境中培养24-48 h至约有80-90%细胞贴壁率。(2)细胞种板与H. pylori处理:取对数生长期的MGC-803细胞,以2.5×105个/孔接种到Transwell-24孔板的下室内,将孔板置于37℃、5% CO2环境中培养24 h至细胞贴壁。使用H. pylori菌悬液感染下室MGC-803细胞。(3)药物处理:在下室中加入囊泡,同时以105个/孔的浓度将Raw264.7细胞接种在Transwell板的上室内。体系置于37℃、5% CO2环境中共同孵育。(4)结晶紫染色:取出Transwell上室,吸除孔中培养液,使用PBS洗涤,甲醇固定并晾干。0.1%结晶紫溶液染色20 min,用棉签轻轻擦去上室中未迁移的Raw264.7细胞,PBS洗涤后镜检。
实验结果:囊泡增强巨噬细胞位移的结果见图11,使用结晶紫对迁移的巨噬细胞进行染色,放置于光学显微镜下观察。图中白色圆孔为Transwell板的聚碳脂膜孔,当感受到相应的细胞因子刺激时,巨噬细胞可以通过这些聚碳脂膜孔从Transwell板的上室迁移至下室。因此,我们通过观察巨噬细胞的迁移情况,考察囊泡恢复免疫应答H. pylori的能力。如图11 a所示,H. pylori感染胃上皮细胞未能引起巨噬细胞的迁移,表明H. pylori进行免疫逃逸,阻断了下游的免疫应答。同时,CLR(图11 d)的处理也无法恢复巨噬细胞对H. pylori的应激,说明CLR没有调节免疫的作用。单独使用Chol(图11 e)可见少量巨噬细胞迁移。使用包载了Chol的WRV和LRV均可见明显的巨噬细胞迁移,说明构建的囊泡能增强巨噬细胞的迁移,有利于H. pylori的清除。此外,WRV和LRV促进巨噬细胞迁移的作用强于游离Chol。
实施例 11 囊泡对胞内幽门螺杆菌的清除效果
将Raw264.7细胞和MGC-803细胞培养于6孔板中,24 h细胞贴壁后加入H. pylori悬液进行感染。感染结束后,吸除旧培养基并加入含庆大霉素的无双抗培养基杀灭未进胞的H. pylori,继续培养2h。使用无菌PBS洗涤除去庆大霉素,并加入药物继续孵育培养。24h后使用0.1%皂苷溶液裂解细胞,收集细胞裂解液,凃板进行菌落数的检测。
实验结果:
Raw264.7细胞的胞内杀菌结果如图12 a所示,CLR处理后胞内仍存活超过50%的H. pylori;在此基础上,CLR与钙三醇联用后,胞内菌的存活率稍有下降,但效果不够理想。相比之下,使用WRV和LRV处理的胞内菌模型,显示较低的细菌存活率。两种囊泡处理后,胞内H. pylori的存活率均低于20%,其中LRV的效果更优,胞内H. pylori的存活率不足10%。MGC-803细胞的胞内杀菌结果与Raw264.7细胞结果相似,如图12 b所示。使用游离药物处理后,胞内菌的存活率均超过60%;而使用WRV和LRV处理后,胞内菌的存活率仅剩20%。将两种细胞结果进行对比,Raw264.7细胞内H. pylori的显示出更低的存活率,这与巨噬细胞本身的噬菌作用(吞噬与消化)有密不可分的关系。在两种细胞系的胞内菌模型中,WRV和LRV均能大大提高药物杀灭胞内H. pylori的能力。
Claims (15)
1.一种用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的囊泡,其中所述囊泡包括:
构成囊泡主体的脂质双分子层;以及嵌入在所述脂质双分子层中的用于修复宿主细胞脂筏结构的胆固醇、幽门螺杆菌敏感性抗生素以及用于恢复自噬溶酶体对细菌降解作用的钙三醇;其中,所述脂质为鼠李糖脂,或鼠李糖脂与磷脂。
2.根据权利要求1所述的囊泡,其中所述脂质为鼠李糖脂。
3.根据权利要求2所述的囊泡,其中所述鼠李糖脂为水溶性鼠李糖脂。
4.根据权利要求2所述的囊泡,其中当所述鼠李糖脂是脂溶性鼠李糖脂时,所述胆固醇是PEG修饰的胆固醇。
5.根据权利要求4所述的囊泡,其中鼠李糖脂双分子层中进一步包载有DSPE-PEG。
6.根据权利要求2所述的囊泡,其中所述鼠李糖脂与所述胆固醇的质量比为8~1:1~0.5。
7.根据权利要求1所述的囊泡,其中所述幽门螺杆菌敏感性抗生素选自阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、四环素、左氧氟沙星、呋喃唑酮或其组合。
8.根据权利要求1所述的囊泡,其中所述囊泡的粒径为小于200 nm。
9.一种用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的药物组合物,其包含权利要求1至8中任一项所述的囊泡及药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物,其还包含质子泵抑制剂、铋剂或其组合。
11.根据权利要求10所述的药物组合物,其中所述质子泵抑制剂选自奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、艾司奥美拉唑、艾普拉唑、埃索美拉唑和莱米诺拉唑。
12.根据权利要求10所述的药物组合物,其中所述铋剂选自枸橼酸铋钾、胶体果胶铋、碱式水杨酸铋和碱式硝酸铋。
13.权利要求1至8中任一项所述的囊泡在制备用于治疗由幽门螺杆菌感染引起疾病的药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用,其中所述疾病选自慢性胃炎、消化性溃疡、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌。
15.一种治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的混合物,其包含鼠李糖脂、用于修复宿主细胞脂筏结构的胆固醇、幽门螺杆菌敏感性抗生素以及用于恢复自噬溶酶体对细菌降解作用的钙三醇。
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