CN113897448A - 一种对利士曼原虫进行多重串联式pcr基因碟片检测的引物及方法和试剂盒 - Google Patents

一种对利士曼原虫进行多重串联式pcr基因碟片检测的引物及方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒。包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。具体引物如SEQ ID NO.1～16所示。本申请能够同时针对四种利什曼原虫特异DNA片段开展利什曼原虫高通量检测，灵敏度为100％，特异性为99.42％，准确性可达99.55％，可以缩短检测时间，提高检测效率。

Description

一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物 及方法和试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒。
背景技术
利什曼原虫病(Leishmaniasis)被世界卫生组织界纳入五大寄生虫病之列，由利什曼原虫(Leishmania spp)引起，致病性复杂，广泛分布于亚、欧、非、拉丁美洲等地。全世界每年有150万—200万人感染利什曼原虫病，大约80多个国家报告过利什曼原虫病，对3.5亿健康人群产生威胁。我国利什曼原虫病的发病率较低，维持在0.0372/10万的水平，主要是散发病例。国内对利什曼原虫快速检测方面开展的研究工作较少，缺乏快速检测的PCR商品化试剂。我国境外技术和劳务人员工作主要目的地，利什曼原虫病疫情不断出现，我国在多个入境口岸监测到疑似感染利什曼原虫的归国劳务人员。国内外疫情状况的差别，使得境外劳务人员感染利什曼原虫病后，入境时面临没有利什曼原虫检测试剂的局面，对病例后期诊断、救治等工作造成了很大困难。因此建立利什曼原虫高通量检测技术，第一时间确定感染利什曼原虫种类，是提高口岸防控利什曼原虫病效率的根本保证。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒，本申请能够同时针对四种利什曼原虫特异DNA片段开展利什曼原虫高通量检测，可以缩短检测时间，提高检测效率。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物，包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。
进一步地，引物包括至少四组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。
进一步地，引物如SEQ ID NO.1～16所示。
进一步地，利士曼原虫为杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫。
一种基于多重串联式PCR基因碟片检测利士曼原虫的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检样品DNA；
(2)采用上述引物中的内引物制备基因碟片，备用；
(3)采用上述引物中的外引物进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮扩增产物为模板，采用基因碟片进行第二轮PCR扩增即可。
进一步地，待检样品为含有杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫中至少一种基因的质粒标准品。
进一步地，基因碟片的制备过程为：
取11μL内引物，将其加入到扩增反应板中，调整浓度，使最终浓度达到0.4μmol/L。然后将扩增反应板放置于-50℃的条件下干燥处理20min，再使用封口膜封闭扩增反应板，最后将扩增反应板放置于4℃的条件下备用。
进一步地，第一轮PCR扩增反应体系包括：0.3μL Mix1、20ng核酸模板、0.2μmol/L外引物混合物，25μL Mix2，最后用ddH2O补足至50μL；
扩增程如下：95℃预变性10min；94℃变性30s；58℃退火60s；72℃延伸60s，共20个循环；最后72℃延伸1min。
进一步地，第二轮PCR扩增反应体系包括：检测试剂56μL、第一轮PCR产物稀释物4.5μL、ddH2O 52μL，均匀混合后，向基因碟片的扩增反应板中加入混合物，每孔25μL；
扩增程序如下：95℃预变性10min；94℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸1min。
一种用于检测利士曼原虫的试剂盒，包括上述引物。
本发明的有益效果：
本申请构建了4种利士曼原虫含有的ITS-1、ITS-2、P0、RACK目的基因片段重组质粒模板，设计引物，通过溶解温度差异直接区分四个基因群组，四个基因群组的扩增曲线差异明显，能够特异性检测四种利什曼原虫，特异性强。ITS-1、P0、ITS-2和RACK4个基因的检测限均可达到103copies/μL，检测限与GeXP多重基因检测技术在猪常见高致死病原检测中的检测限一致，检测结果清晰准确。针对4种利什曼原虫检测的灵敏度为100％，特异性为99.42％，准确性为99.55％。
本申请基于MT-PCR技术，建立了杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫和硕大利什曼原虫高通量检测技术，一次性检测4种利士曼原虫，具有较高特异性和灵敏度。本研究建立的检测技术，可应用于口岸一线对入境旅客利什曼原虫的快速检测，能在第一时间确定病原体或者缩小筛查范围，对病例及时救治和疫情快速控制具有重要意义。
附图说明
图1为检测杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫的扩增曲线和溶解曲线；
图2为ITS-1、P0、ITS-2、RACK基因的扩增曲线和溶解曲线；
图3为混合感染模型的灵敏度和重复性检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
主要试剂
脱氧核糖核酸提取试剂：Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega，A1120)，基因扩增检测试剂：SYBR Premix Ex Taq(Takara,DRR041A)，多基因扩增检测试剂：MμLtiplexPCR Assay Kit(Takara,RR062B)。主要仪器：真空冷冻干燥仪：Eppendorf，concentrator plus，核酸提取仪：赛默飞FLEX,荧光定量PCR仪：罗氏480。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例1引物设计
针对4种不同类型什曼原虫，构建4个分别含有ITS-1、ITS-2、P0、RACK目的基因片段的阳性重组质粒模板，提取质粒DNA保存于-80℃超低温冰箱。检索基因序列(GenBankaccession no:AF306777，JN673394，JN673389，JN673385，AB175625，AY297458，AF499109和M12691)，使用Primer Premier V5.0和Oligo V6.22进行引物设计和评价，建立巢式引物对，引物信息见表1。
表1.引物信息
Figure BDA0003356380110000041
Figure BDA0003356380110000051
实施例2多重串联式PCR
1、制作基因碟片
取11μL内引物，将其加入到扩增反应板中，调整浓度，使最终浓度达到0.4μmol/L。然后将扩增反应板放置于-50℃的条件下干燥处理20min，再使用封口膜封闭扩增反应板，最后将扩增反应板放置于4℃的条件下备用。
2、多重串联式PCR
第一轮PCR扩增反应体系包括：0.3μL Mix1、20ng核酸模板、0.2μmol/l外引物混合物(各组外引物等量加入)，25μL Mix2，最后用ddH2O补足至50μL；
扩增程如下：95℃预变性10min；94℃变性30s；58℃退火60s；72℃延伸60s，共20个循环；最后72℃延伸1min。
然后将第一轮PCR扩增反应的产物稀释25倍作为第二轮PCR扩增反应的模板。使用基因扩增检测试剂(基因碟片)开展第二轮PCR扩增反应，第二轮PCR扩增反应体系包括：SYBR Premix Ex Taq的SYBR扩增试剂56μL、第一轮PCR产物稀释物4.5μL、ddH2O 52μL，均匀混合后，向基因碟片的扩增反应板中加入混合物，每孔25μL；
扩增程序如下：95℃预变性10min；94℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸1min。
实施例3 MT-PCR体系特异性验证
按照模板DNA制备的方法分别提取含有的ITS-1、ITS-2、P0、RACK基因目的片段的阳性重组质粒模板DNA，然后运用建立好的体系检测检测阳性对照DNA、腺病毒(adenovirus，type 1和type 4)、甲型流感病毒(influenza A viruses，H1N1 pdm09，H3N2和H5N1)、乙型流感病毒(influenza B virus)、鼻病毒A(human rhinovirus A)和登革热病毒(dengue virus)逆转录的DNA，验证该体系的特异性。
实验结果显示，该体系检测阳性对照DNA、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、鼻病毒A、登革热病毒的阳性符合率、阴性符合率均＞95％，可以排除其他病毒核酸的干扰，准确性可靠，特异性符合要求。
多重扩增完成后分析熔解曲线，4个基因群组的扩增产物都可以形成明显的特异熔解峰，根据熔融曲线来看，扩增产物均为目标产物，4个基因的实验结果见图1和图2。
图1中，A为ITS-1基因的扩增曲线和溶解曲线，检测杜氏利什曼原虫；B为P0基因的扩增曲线和溶解曲线，检测婴儿利什曼原虫；C为ITS-2基因的扩增曲线和溶解曲线，检测热带利什曼原虫；D为RACK基因的扩增曲线和溶解曲线，检测硕大利什曼原虫。
大量试验数据统计分析确定ITS-1、P0、ITS-2、RACK基因扩增产物的Tm值分别为：84±0.33℃、89±0.11℃、86±0.37℃和88.5±0.16℃，阴性对照组没有明显的特异目的峰产生。并且4个基因群组的扩增曲线差异明显，表明此组引物可用于杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫和硕大利什曼原虫的多重检测研究。
实施例4 MT-PCR体系灵敏度及定量能力的验证
按照模板DNA制备的方法分别提取含有的ITS-1、ITS-2、P0、RACK基因目的片段的阳性重组质粒模板DNA，使用荧光光度法测定DNA浓度。通过DNA浓度，使用拷贝数计算公式：拷贝数(copies/μL)＝[(DNA浓度(ng/μL)×10-9)×(6.02×1023)]÷(质粒的碱基数×345)，计算出模板DNA的拷贝数。采用TE缓冲液，对模板DNA进行稀释，浓度达到1×106copies/μL，再以10倍的浓度梯度逐级进行稀释，每个稀释梯度重复3次，最后确定最低检测限。
为模拟自然情况下病毒的感染，构建混合感染模型，混合感染模型检测结果见图3。
ITS-1混合模型中，ITS-1标准品模板浓度依次稀释为105，104，103，102copies/μL时，P0、ITS-2、RACK标准品模板浓度固定为106copies/μL。
P0混合模型中，P0标准品模板浓度依次稀释为105，104，103，102copies/μL时，ITS-1、ITS-2、RACK标准品模板浓度固定为106copies/μL。
ITS-2混合模型中，ITS-2标准品模板浓度依次稀释为105，104，103，102copies/μL时，ITS-1、P0、RACK标准品模板浓度固定为106copies/μL。
RACK混合模型中，RACK标准品模板浓度依次稀释为105，104，103，102copies/μL时，ITS-1、P0、ITS-2标准品模板浓度固定为106copies/μL。
最终确定对于ITS-1、P0、ITS-2、RACK的检测限均可达到103copies/μL。三个浓度梯度的批内和批间重复变异系数都小于5％，表明实验重复性良好。
实施例5模拟临床样品检测
利用ITS-1、P0、ITS-2、RACK阳性质粒与临床检测得到的甲型流感病毒阳性标本、诺如病毒阳性标本、轮状病毒阳性标本和阴性标本做随机混合，制作出模拟临床样品，使用本研究建立的多种利什曼原虫方法进行检测，验证方法在进行临床样品检测的阳性符合率、阴性符合率、总符合率、灵敏度、特异性和方法效率，结果见表2。结果显示，针对4种利什曼原虫检测的灵敏度均为100％，特异性为99.42％，准确性为99.55％。其中杜氏利什曼原虫的特异性为97.62％，准确性为98.46％；婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫和硕大利什曼原虫的的特异性位和准确性都为100％。
表2模拟临床样品检测结果
Figure BDA0003356380110000081
序列表
<110> 四川国际旅行卫生保健中心
<120> 一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acataacgtg tcgcgatgga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgcaagcac cagagaggag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcagtaaag tgcgataagt gg 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatatggcat gcacgggga 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtacgagttc gaggagcaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgtctcctt cgttgttggt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgagttcgag gagcacaac 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagaagagac cgcccatgc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggcgtgtgt ttgtgttgtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaaatggcc aacgcgaagt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgcacacgt agacaagtca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgctttttgc aagcaccaga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcaagggcc acagcaacta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attactcggc gtcggagatg 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggagaggtct ctgtccgtg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtacagagtg ttgccgtcg 19

Claims (10)

1.一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物，其特征在于，包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物包括至少四组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.1～16所示。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述利士曼原虫为杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫。
5.一种基于多重串联式PCR基因碟片检测利士曼原虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检样品DNA；
(2)采用权利要求1～3任一项所述引物中的内引物制备基因碟片；
(3)采用权利要求1～3任一项所述引物中的外引物进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮扩增产物为模板，采用基因碟片进行第二轮PCR扩增即可。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待检样品为含有杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫中至少一种基因的质粒标准品。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因碟片的制备方法为：
将各内引物，分别成对加入到扩增反应板中，然后用ddH2O调整浓度为0.4μmol/L，再置于-50℃的条件下干燥处理20min，封闭扩增反应板，最后将扩增反应板放置于4℃条件下即可。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增反应体系包括：0.3μLMix1、20ng核酸模板、0.2μmol/l外引物混合物，25μL Mix2，最后用ddH2O补足至50μL；
扩增程如下：95℃预变性10min；94℃变性30s；58℃退火60s；72℃延伸60s，共20个循环；最后72℃延伸1min。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述采用基因碟片开展第二轮PCR扩增反应体系操作方法：SYBR Premix Ex Taq的SYBR扩增试剂56μL、第一轮PCR产物稀释物4.5μL、ddH2O 52μL，均匀混合后，向基因碟片的扩增反应板中加入混合物，每孔25μL；
扩增程序如下：95℃预变性10min；94℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸1min。
10.一种用于检测利士曼原虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的引物。
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