CN113861272A - 一种海参活性肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的实施例提供了一种海参活性肽及其制备方法，方法包括：将海参泡发，并进行均质前处理得到原料蛋白；将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物；将海参肽酶解产物进行超滤膜过滤，截留所需分子量的截留液；将截留液进行大孔树脂201分离，并进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到洗脱液；测定洗脱液的DPPH，并选择高DPPH的组分；采用RP‑HPLC反相高效液相色谱将高DPPH的组分进行分离、纯化。该海参活性肽在抗疲劳过程中，除了在保证细胞线粒体充足数量和维持线粒体功能，维持组织糖脂能量代谢，保持ATP酶活力，维持运动稳态具有重要作用。同时具有良好的抗氧化活性、降低自由基产生。

Description

一种海参活性肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及海参活性肽制备技术领域，尤其涉及一种海参活性肽及其制备方法。

背景技术

疲劳影响现代人的生活质量，生理健康以及精神状态，世界卫生组织报道，疲劳影响着全世界超过30％的人，疲劳不仅降低人的生活质量和工作效率，也加剧了睡眠障碍和抑郁症的发生。而且，长期疲劳是潜在病理或者慢性疾病如癌症，心力衰竭，肥胖、代谢性疾病等的发生、发展的重要原因之一。

运动时组织糖原大量分解消耗，电子传递链过载，当运动强度超过机体承受能力，往往导致体内自由基含量上升，细胞内线粒体损伤，线粒体数量下降，糖脂分解不能为组织细胞提供足够的ATP，细胞缺乏动能。表现为肌肉收缩力下降，脑组织缺氧，产生疲劳。运动疲劳源于机体能量稳态破坏，其中线粒体受损、功能下降是关键。当电子传递链过载、产生过量自由基，可导致线粒体损伤，线粒体水肿、嵴溶解，线粒体含量下降，影响细胞能量供给，肌肉收缩力下降。

已有的研究证实，海参肽是海参发挥抗疲劳功能的主要活性成分，其抗疲劳作用机制涉及提高细胞能量代谢，如脂肪分解代谢、糖异生、维持血糖和血脂稳定，维持组织氧化还原状态，降低血清乳酸含量，提高运动耐力，以及增强电子传递链功能。这预示着海参肽可能通过调节能量代谢以及增强线粒体功能发挥抗疲劳功效，从而维持耐力运动能量稳态以及增强线粒体可塑性。

但是，海参中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，而具有特定功能的活性肽如提高线粒体功能的肽，可能包含不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，仅采用通过常规的分离技术获得的海参肽，很多并不具有特定的功能，而同时具有较好的抗氧化和增强线粒体功能的海参肽更是甚少。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种海参活性肽及其制备方法，以从酶解海参中提取具备特定功效的成分的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的实施例提供了一种海参活性肽，其包括以下序列：序列1(G(Hyp)LQADY，甘氨酸-羟脯氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)，序列2(FD(Hyp)GA，苯丙氨酸-天冬氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸-丙氨酸)，序列3(LPGSDDF，亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸)，序列4(APGLTY，丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸)，序列5(GNFGGLP，甘氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸)，序列6(APLGF，丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸)。

一种制备如上所述的海参活性肽的制备方法，其包括以下步骤：

将海参泡发，并进行均质前处理得到原料蛋白；

将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物；

将海参肽酶解产物进行超滤膜过滤，截留所需分子量的截留液；

将截留液进行大孔树脂201分离，并进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到洗脱液；

测定洗脱液的DPPH，并选择高DPPH的组分；

采用RP-HPLC反相高效液相色谱将高DPPH的组分进行分离、纯化；

将分离、纯化的洗脱液进行减压浓缩、冻干得到海参活性肽。

其中，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤中，采用复合蛋白酶酶解，所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶。

其中，所述碱性蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量比例为(0.5-1)：(1-2)：(1-2)。

其中，所述碱性蛋白酶的酶活为50,000-500,000U/g，所述胰蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000U/g，所述中性蛋白酶的酶活为100,000-650,000U/g。

其中，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤中，复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.4-0.9％，料液质量比为5-15％。

其中，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤中，酶解温度为37-50℃，酶解时间为3-7小时。

其中，所述复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.1-0.2％，所述复合蛋白酶的酶活为80,000-250,000U/g，酶解温度为50-60℃，酶解时间0.5-1h。

其中，所述将海参肽酶解产物进行超滤膜过滤，截留所需分子量的截留液步骤中，超滤膜采用孔径为3000道尔顿超滤膜，收集的截留液为分子量大于3000的截留液。

其中，所述将截留液进行大孔树脂201分离，并进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到洗脱液步骤中，分级梯度洗脱液为浓度为60％、70％，75％，80％，85％，90％乙醇，洗脱峰为280nm。

与现有技术相比，本发明提供的海参活性肽，在抗疲劳过程中，除了在保证细胞线粒体充足数量和维持线粒体功能，维持组织糖脂能量代谢，保持ATP酶活力，维持运动稳态具有重要作用。同时具有良好的抗氧化活性、降低自由基产生。该海参肽序列，经过酶解、膜分离、大孔吸附树脂、RP-HPLC色谱方法分离，结合抗氧化功能测定筛选，再进行LC-MS/MS鉴定分析，得到候选肽，其中，有效氨基酸序列为(G(Hyp)LQADY)，(FD(Hyp)GA)，P3(LPGSDDF)，(APGLTY)，(GNFGGLP)，(APLGF)多肽的肽的含量≥80％。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明技术手段，可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征及优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。

附图说明

图1为本发明实施例的海参活性肽的制备方法流程图。

图2为本发明实施例的制备方法的RP-HPLC色谱图(A)及组分DPPH自由基清除能力(B)示意图。

图3为本发明实施例的制备方法的RP-HPLC色谱图F4-2的UPLC-Q-TOF-MS/MS质谱图。

图4为本发明实施例的制备方法的RP-HPLC色谱图F4-3的UPLC-Q-TOF-MS/MS质谱图。

图5为本发明实施例的制备方法的F4-1，F4-2，F4-4色谱图及DPPH自由基清除能力示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所述的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行结合和组合。

请参阅图1，本实施例公开了一种海参活性肽序列，经过大量研究发现，海参酶解后具备以下活性肽序列具备抗疲劳提高线粒体功能的成分，其包括以下序列：序列1(G(Hyp)LQADY，甘氨酸-羟脯氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)，序列2(FD(Hyp)GA，苯丙氨酸-天冬氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸-丙氨酸)，序列3(LPGSDDF，亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸)，序列4(APGLTY，丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸)，序列5(GNFGGLP，甘氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸)，序列6(APLGF，丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸)。由于海参中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，而具有特定功能的活性肽如提高线粒体功能的肽，可能包含不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，仅采用通过常规的分离技术获得的海参肽，很多并不具有特定的功能，而同时具有较好的抗氧化和增强线粒体功能的海参肽更是甚少，上述序列均为有效成分。

本实施例还提供了一种制备如上所述的海参活性肽的制备方法，其包括以下步骤：

步骤S100、将海参泡发，并进行均质前处理得到原料蛋白；所述前处理包括：将海参经泡发、摘除内脏、洗净，煮沸3-5min，匀浆得到原料蛋白液。

步骤S200、将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物；并将所述酶解物进行煮沸灭酶处理后，再进行过滤和目标肽的分离。

其中，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤S200中，采用复合蛋白酶酶解，所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶。

所述碱性蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量比例为(0.5-1)：(1-2)：(1-2)。

所述碱性蛋白酶的酶活为50,000-500,000U/g，所述胰蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000U/g，所述中性蛋白酶的酶活为100,000-650,000U/g。

其中，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤S200中，复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.4-0.9％，也即用于酶解的符合蛋白酶占海参蛋白原料的质量比例为0.4-0.9％，料液质量比为5-15％，也即固态物质占业态物质的比例为5-15％。酶解温度为37-50℃，酶解时间为3-7小时。

在另一实施例中，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤S200中，所述复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.1-0.2％，所述复合蛋白酶的酶活为80,000-250,000U/g，酶解温度为50-60℃，酶解时间0.5-1h。

步骤S300、将海参肽酶解产物进行超滤膜过滤，截留所需分子量的截留液；

其中，所述将海参肽酶解产物进行超滤膜过滤，截留所需分子量的截留液步骤S300中，超滤膜采用孔径为3000道尔顿超滤膜，收集的截留液为分子量大于3000的截留液，将分子量不大于3000的成分过滤掉。

步骤S400、将截留液进行大孔树脂201分离，并进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到洗脱液；

其中，所述将截留液进行大孔树脂201分离，并进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到洗脱液步骤S400中，分级梯度洗脱液为浓度为60％、70％，75％，80％，85％，90％乙醇，洗脱峰为280nm。

步骤S500、测定洗脱液的DPPH，并选择高DPPH的组分；也即洗脱峰在280nm下进行检测，收集各洗脱峰，进行DPPH自由基清除率测定，选取清除率高的组分。

步骤S600、采用RP-HPLC反相高效液相色谱将高DPPH的组分进行分离、纯化；分离条件如下：采用C18色谱柱，以含0.1％TFA的水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流速为1mL/min，收集6.5-11分钟分离的肽溶液，处理结果如附图2所示。

优选的，进一步的，该制备方法还包括步骤S700、将分离、纯化的洗脱液进行减压浓缩、冻干得到海参活性肽成品。

以下以其中具体制备过程为例，描述该制备方法的制备过程：

将海参泡发前处理后，进行酶解，酶解后的海参肽水解液，用截留分子量2000纳滤膜过滤，取分子量小于2000的蛋白肽先经过大孔树脂201分离，梯度洗脱液为60％、70％，75％，80％，85％乙醇，洗脱峰在280nm下进行检测，收集各洗脱峰，进行DPPH自由基清除率测定。选取清除率高的组分，海参水解肽配制成50mg/mL溶液，0.45μm针式过滤器过滤，再用RP-HPLC反相高效液相色谱分离、纯化；分离条件如下：采用C18色谱柱CST C18(Φ12nm 10μm)，以含0.1％TFA的水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流速为1mL/min，检测波长215nm和280nm。收集6.5-11分钟分离的肽洗脱液，海参肽含有质量百分含量为≥80％的功能肽，冻干为成品。

为了验证该制备方法制备的海参活性肽的功效，采用以下方法验证：

将上述6种序列海参活性肽单一或混合应用于动物，口服给予小鼠3周，用抓力测试仪测定抓力，可显著提高前肢抓力15％。疲劳转棒实验中，延长了转棒上持续时间2倍。

将上述6种序列海参活性肽应用于动物，口服给予小鼠5周，小鼠进行1小时5％体重的负重游泳(水深40cm左右、水温25±0.5℃游泳箱)，结束后取样测定。海参组增加小鼠负重游泳运动后心脏和骨骼肌中MtDNA含量(线粒体拷贝数)分别为10％和15％，提高组织的ATP酶活性10％，显著高于对照组；降低血清、肌组织乳酸和自由基含量，兼有良好抗氧化、促进运动时糖、脂供能、维持能量代谢的稳态。

C2C12细胞培养：(1)在细胞培养6孔板中，C2C12细胞用生长培养基(含有10％FBS，5mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM)中于5％CO2培养箱中37℃培养2天，将生长培养基替换为分化培养基(含2％马血清，5mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM)，再分化5天。(2)向6孔板中加入用500μmol/LH2O2处理诱导C2C12细胞12小时，建立氧化应激模型。(3)在上述建好的氧化应激模型中，以H2O2模型组(CON)为对照，分别加入N-乙酰半胱氨酸干预组(NAC，50μg/mL)、序列1干预组(P1(L(Hyp)GSDDF)，50μg/mL)、P2干预组(序列2(FD(Hyp)GA)，50μg/mL)，每组处理重复3次。继续培养12小时后，收集各孔细胞，测定细胞MDA(丙二醛)含量，总抗氧化能力(TAOC)，序列1、序列2组MDA含量比对照组下降30％，32％，TAOC及CAT提高28％、25％；炎性因子细胞IL6含量下降50、45％，与NAC组接近，具体请参阅附图3至图5。

本实施例制备的海参活性肽在制备食品或食品添加剂中的应用；优选地，所述食品或食品添加剂具有抗疲劳、提高线粒体功能，兼有维持体内氧化还原和免疫稳态的功能。

与现有技术相比，本发明提供的海参活性肽，在抗疲劳过程中，除了在保证细胞线粒体充足数量和维持线粒体功能，维持组织糖脂能量代谢，保持ATP酶活力，维持运动稳态具有重要作用。同时具有良好的抗氧化活性、降低自由基产生。该海参肽序列，经过酶解、膜分离、大孔吸附树脂、RP-HPLC色谱方法分离，结合抗氧化功能测定筛选，再进行LC-MS/MS鉴定分析，得到候选肽，其中，有效氨基酸序列为(G(Hyp)LQADY)，(FD(Hyp)GA)，P3(LPGSDDF)，(APGLTY)，(GNFGGLP)，(APLGF)多肽的肽的含量≥80％。

上述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种海参活性肽，其特征在于，包括以下序列：序列1(G(Hyp)LQADY，甘氨酸-羟脯氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)，序列2(FD(Hyp)GA，苯丙氨酸-天冬氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸-丙氨酸)，序列3(LPGSDDF，亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸)，序列4(APGLTY，丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸)，序列5(GNFGGLP，甘氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸)，序列6(APLGF，丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸)。

2.一种制备如权利要求1所述的海参活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将海参泡发，并进行均质前处理得到原料蛋白；

将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物；

将海参肽酶解产物进行超滤膜过滤，截留所需分子量的截留液；

将截留液进行大孔树脂201分离，并进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到洗脱液；

测定洗脱液的DPPH，并选择高DPPH的组分；

采用RP-HPLC反相高效液相色谱将高DPPH的组分进行分离、纯化；

将分离、纯化的洗脱液进行减压浓缩、冻干得到海参活性肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤中，采用复合蛋白酶酶解，所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量比例为(0.5-1)：(1-2)：(1-2)。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的酶活为50,000-500,000U/g，所述胰蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000U/g，所述中性蛋白酶的酶活为100,000-650,000U/g。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤中，复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.4-0.9％，料液质量比为5-15％。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述将原料蛋白进行酶解得到海参肽酶解产物步骤中，酶解温度为37-50℃，酶解时间为3-7小时。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.1-0.2％，所述复合蛋白酶的酶活为80,000-250,000U/g，酶解温度为50-60℃，酶解时间0.5-1h。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将海参肽酶解产物进行超滤膜过滤，截留所需分子量的截留液步骤中，超滤膜采用孔径为3000道尔顿超滤膜，收集的截留液为分子量大于3000的截留液。

10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将截留液进行大孔树脂201分离，并进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到洗脱液步骤中，分级梯度洗脱液为浓度为60％、70％，75％，80％，85％，90％乙醇，洗脱峰为280nm。

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