CN113834866A - 用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法，该方法基于还原氧化石墨烯rGO与Fe3O4@SiO2复合材料大的比表面积、好的电子传递性，引入分子印迹技术，以羟基化产物为模板分子，Fe3O4@SiO2‑rGO修饰的GCE为基底，采用电聚合的方法制备了能选择性识别羟基化产物的MIPs/Fe3O4@SiO2‑rGO/GCE电极；MIPs/Fe3O4@SiO2‑rGO/GCE电极与参比电极、对电极一起连接在电化学工作站上，以形成MIPs/Fe3O4@SiO2‑rGO/GCE分子印迹材料的电化学传感器，实现对羟基自由基的在线检测；导电材料rGO和MOFs材料Fe3O4@SiO2修饰玻碳电极，大大提高了电极在反应中检测信号的灵敏度；该电化学传感器对印迹分子响应快速、灵敏度高、稳定性好；能实时的对羟基自由基进行在线检测，检测无需取样等过程，简化了检测流程。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料和化学传感器技术领域，具体涉及一种羟基自由基电化学传感器的制备方法及在羟基自由基（·OH）检测中的应用。
背景技术
分子印迹技术（nolecular imprinting technonlogy）是一种制备对特定目标（模板分子）或目标分子群具有选择性识别的元件的技术。分子印迹技术定制的聚合物中，模板分子和功能单体通过氢键、静电作用和疏水作用自组装相互作用，从而在聚合物基体中进行印迹，洗脱后形成与模板分子的形状、大小和官能团相关的识别位点，由于分子印迹聚合物（MIPs）对模板分子的高选择性和高亲和力使其成为理想的传感器识别元，且MIPs易于大规模生产，稳定性高，成本低。电化学聚合方法能够形成刚性、均匀和致密的印迹膜，并且很好地附着在任意形状和尺寸的电极表面，而且可以通过控制聚合条件调节印迹膜的厚度和密度。
使用电聚合的方法制备分子印迹聚合物，能够使聚合膜能很容易的在电极表面生产并附着，而且膜的厚度也能通过控制多种条件进行调节。采用电化学方法制备的分子印迹聚合膜可以达到纳米级别，易于重复，极大的提高了传感器的灵敏度。
羟基自由基作为自由基中最常见、最重要的一种，它的氧化电位为2.8V，仅次于F2，其独特的生理性能，使其成为各学科领域的研究热点。羟基自由基可以破坏所有类型的大分子，如蛋白质、DNA、脂质、环境中各种类型的有机物等，为了能更好的探究羟基自由基对生物体的影响，以及其在降解环境中有机物的过程中发挥的作用，羟基自由基的定性定量分析就显得尤为重要。但由于其活性高、寿命短和相互之间容易转化的特点，使其分析检测成为研究的一个难点。传统的分析方法，如电子自旋共振法、色谱法和荧光法等，存在仪器昂贵、样品前处理过程复杂和操作过程中可能引进其他污染的问题，在一定程度上限制了其在某些领域的应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法；使用还原氧化石墨烯（rGO）和MOFs材料磁性Fe3O4@SiO2对玻碳电极GCE进行修饰，Fe3O4@SiO2比表面积大、孔隙率高，可作为电化学传感器的增敏剂；rGO具有高的导电率，两者结合在一起具有好的电子传递性能和较强的吸附能力；Fe3O4@SiO2-rGO修饰的玻碳电极为印迹基质，以羟基化产物为模板分子，通过电聚合的方法，制备出Fe3O4@SiO2-rGO功能化的MIPs材料，能够对特定的羟基化产物进行识别响应的MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极；将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE作为工作电极，与参比电极和对电极一起正确连接在电化学工作站上，以形成MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE分子印迹材料的电化学传感器，实现对羟基的在线检测；
本发明目的通过下述方案实现：
（1）将玻碳电极抛光，超声清洗，自然晾干，制得预处理玻碳电极；
所述玻碳电极使用金相砂纸1#～7#逐级抛光，再用粒径0.05μm、0.3μm、1.0μm的氧化铝粉末依次抛光打磨，最后电极依次用质量浓度40～50%硝酸溶液、丙酮、蒸馏水超声清洗，每种溶液清洗60～180s；
（2）将还原氧化石墨烯和磁性纳米材料Fe3O4@SiO2分散在超纯水中，超声混匀得到分散液，其中磁性纳米材料Fe3O4@SiO2和还原氧化石墨烯的质量比为1:5~9；还原氧化石墨烯在分散液中质量浓度为0.05~4.5mg/mL，磁性纳米材料Fe3O4@SiO2在分散液中质量浓度为0.01~0.5mg/mL；然后取分散液滴涂于预处理玻碳电极表面，置于30~40℃红外灯下干燥10~20min，得到Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极；
所述还原氧化石墨烯是在1～5mg/mL、pH 9~10的氧化石墨烯分散液100mL中边搅拌边加入1～1.5mmol钼酸钠和750～850mg硼氢化钠，混合均匀后，水浴加热至70~90℃反应1～1.5h后，加入1～2mL双氧水以除去Mo，过滤，去离子水洗涤固体，干燥制得；
磁性纳米材料Fe3O4@SiO2是在1g纳米四氧化三铁中加入200mL无水乙醇、10mL体积浓度25%的氨水，混匀后在40~60℃下搅拌反应，然后将3mL正硅酸四乙酯滴加入反应液中，分3次添加，每次间隔15～20min，固液分离，沉淀用去离子水和乙醇交替洗涤三次，干燥制得；
（3）在Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极表面涂覆浓度为3mmol/L~5mmol/L萘酚溶液，自然晾干；
（4）在磷酸盐缓冲溶液中加入印迹分子溶液和功能单体溶液制得印迹溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05~0.1mol/L，pH为6~8；印迹分子溶液浓度为0.01~0.05mol/L，功能单体溶液浓度为0.01~0.25mol/L；磷酸盐缓冲溶液:印迹分子溶液:功能单体的体积比为9~11:2:1；
所述印迹分子为2,5-二羟基苯甲酸或3,4-二羟基苯甲酸，功能单体为吡咯；
（5）采用电化学聚合方法，在-2.0～+2.0V内，将Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极置于印迹溶液中采用循环伏安法循环扫10～60圈，扫描速率为10~60mV/s，得到印迹聚合物修饰电极，然后将电极置于洗脱溶液中通过恒电位氧化法去除印迹分子，制得分子印迹电极MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE；
所述洗脱溶液为0.1~0.5mol/L，pH为4~6的磷酸二氢钠溶液；恒电位氧化法的电位为0.5～20V，洗脱时间为30～60min。
本发明另一目的是将上述方法制得的分子印迹电极应用在羟基自由基检测中的，将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极与参比电极、对电极连接在电化学工作站上，形成电化学传感器；
将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极放入浓度范围为1.0×10-9 ~1.0×10-6mol/L含印迹分子的pH=2~4 磷酸缓冲溶液中，识别2~10min后，再将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极置于含有pH2~4的磷酸缓冲溶液的电解池中，与对电极铂丝电极，参比电极Ag/AgCl形成三电极体系，连接到电化学工作站进行差分脉冲伏安法（DPV）测定其相应电流值，脉冲幅度为40~60mV，脉冲周期为0.2~0.6s，脉冲宽度为40~50ms，电压增量为3~6mV；以不同浓度下处理的电极的相应电流值为纵坐标，印迹分子浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出标准方程；
检测待测样品时，将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极置于待测样品中，识别2~10min后，置于电解池中，与对电极铂丝电极，参比电极Ag/AgCl形成三电极体系，进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，得到响应电流值，根据标准方程得出羟基自由基的浓度。
本发明的优点：1、采用本发明分子印迹电极，大大提高了电极在反应中检测信号的灵敏度；2、MIPs/rGO/GCE电化学传感器对印迹分子具有快速响应、选择性好、灵敏度高、稳定性好等特点；3、可以实时的对羟基自由基进行在线检测，检测无需取样等过程，简化了检测流程，制备方法简单，适于工业化应用和市场推广应用。
附图说明
图1为实施例1中2,5-二羟基苯甲酸标准曲线；
图2为实施例2中2,5-二羟基苯甲酸标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1
（1）取1mg/mL的氧化石墨烯胶体分散液100mL，用NaOH溶液调节分散液pH至9~10，然后边搅拌边向其中加入1mmol钼酸钠和800mg硼氢化钠，分散液混合均匀后，水浴加热至90℃反应1h，然后加入1mL双氧水以除去Mo，抽滤并用去离子水洗涤，固体室温干燥即得rGO粉末；称取1g纳米四氧化三铁置于三颈烧瓶中，加入200mL无水乙醇，10mL25%氨水，在50℃油浴锅中搅拌（搅拌转速500r/min），用无菌针管向三颈烧瓶中缓缓滴加1mL正硅酸四乙酯，共加入3次，每次间隔20min，所得褐色沉淀用去离子水和乙醇交替洗涤三次，置于60℃真空干燥箱，得磁性纳米材料Fe3O4@SiO2；将磁性纳米材料Fe3O4@SiO2和rGO粉末按质量比1:5的比例，1mg Fe3O4@SiO2和5mg的rGO分散在50mL H2O中超声30min，形成Fe3O4@SiO2-rGO分散溶液；
（2）选用直径为3mm的玻碳电极，使用金相砂纸1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#逐级抛光，再依次用粒径0.05μm、0.3μm、1.0μm氧化铝粉末在抛光布上抛光至镜面，最后依次用50%硝酸溶液、丙酮和蒸馏水超声清洗，每次120s；
（3）取1.0μLFe3O4@SiO2-rGO分散溶液滴涂于步骤（2）玻碳电极（GCE）表面，将Fe3O4@SiO2-rGO修饰的GCE电极置于30℃红外灯下干燥20min；在Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极表面均匀覆盖一层5mmol/L萘酚溶液，自然晾干；在10mL磷酸缓冲盐溶液PBS（0.1mol/L，pH=6.86）中加入2mL 0.03mol/L 2,5-二羟基苯甲酸，1mL 0.1mol/L吡咯制得印迹溶液；设定电位范围－1.0V～＋1.0V，将Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极在印迹溶液中以50mV/s扫速CV循环扫10圈，得到2,5-二羟基苯甲酸印迹聚合物修饰电极MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE，然后在0.2mol/L、pH=5的NaH2PO4溶液中通过恒电位氧化法控制电位1.3V处理30min去除模板分子2,5-DHBA，获得能够对2,5-DHBA进行选择性识别的印迹空腔。
（4）将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极置于含浓度范围为1.0×10-9 ~1.0×10- 6mol/L的2,5-二羟基苯甲酸的PBS溶液中（pH=4），识别5min后，将电极移至25mL电解池中，电解质溶液为pH=4 PBS溶液，MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极与对电极铂丝电极，参比电极Ag/AgCl形成三电极体系，连接到电化学工作站进行差分脉冲伏安法（DPV）测定其相应电流值，脉冲幅度为40mV，脉冲周期为0.2s，脉冲宽度为40ms，电压增量为3mV；得出其标准方程为i=0.086lgC2,5-DHBA+0.719（R2=0.997），见图1；
（5）使用上述方法制备的MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极，进行羟基自由基的检测；在pH=3.0芬顿体系中，H2O2与Fe（Ⅱ）反应，产生羟基自由基，在体系中加入羟基自由基捕捉剂水杨酸，反应一段时间后，将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极置于该待测体系中识别5min，将电极移至25mL电解池中，电解质溶液为PBS溶液中（pH=4）, 与对电极铂丝电极，参比电极Ag/AgCl形成三电极体系，连接到电化学工作站进行差分脉冲伏安法（DPV）测定其相应电流值，脉冲幅度为40mV，脉冲周期为0.2s，脉冲宽度为40ms，电压增量为3mV；其相应电流峰值为0.039μA，带入上述线性方程得C2,5-DHBA为1.31×10-8mol，即为该体系中羟基自由基的浓度；
同时采用荧光光谱分析法测量得浓度为1.30×10-8mol，该传感器与荧光光谱分析法测得结果接近，说明该传感器检测羟基自由基的可行性和准确性。
实施例2
（1）取4mg/mL的氧化石墨烯胶体分散液100mL，用NaOH溶液调节分散液pH至9~10，然后边搅拌边向其中加入1.2mmol钼酸钠和800mg硼氢化钠，分散液混合均匀后，水浴加热至75℃反应1.5h，得到还原氧化石墨烯分散液，加入2mL双氧水以除去Mo，再抽滤并用去离子水洗涤，室温干燥即得rGO粉末；称取1g纳米四氧化三铁于在三颈烧瓶中，加入200mL无水乙醇，10mL25%氨水，在55℃油浴锅中搅拌（搅拌转速在800r/min之间），用无菌针管向三颈烧瓶找中缓缓加入1mL正硅酸四乙酯，共加入3次，每次间隔15min，所得褐色沉淀用去离子水和乙醇交替洗涤三次，置于60℃真空干燥箱，磁性纳米材料Fe3O4@SiO2；将磁性纳米材料Fe3O4@SiO2和rGO按1:7的比例，1mg磁性纳米材料Fe3O4@SiO2和7mg的rGO在50mLH2O中超声分散30min，形成Fe3O4@SiO2-rGO分散溶液；
（2）选用直径为5mm的玻碳电极，使用金相砂纸1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#逐级抛光，再依次用粒径0.05μm、0.3μm、1.0μm氧化铝粉末在抛光布上抛光至镜面，最后依次用45%硝酸溶液、丙酮和蒸馏水超声清洗，每次100s；
（3）取1.5μL Fe3O4@SiO2-rGO均匀滴涂于步骤（2）玻碳电极（GCE）表面，将Fe3O4@SiO2-rGO修饰的GCE电极置于40℃红外灯下干燥10min；在Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极表面涂覆一层4mmol/L萘酚溶液；在11mL磷酸缓冲盐溶液PBS（0.5mol/L，pH=7）中加入2mLL0.05mol/L 2,5-DHBA、1mL0.25mol/L吡咯制得印迹溶液；设定电位范围－2.0V～＋2.0V，将Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极置于印迹溶液中以60mV/s扫速CV循环扫20圈，得到2,5-DHBA印迹聚合物修饰电极MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE，然后在0.3mol/L、pH=4的NaH2PO4溶液中通过恒电位氧化法控制电位2.0V处理40min去除模板分子2,5-DHBA，获得能够对2,5-DHBA进行选择性识别的印迹空腔；
（4）将该传感器置于含浓度范围为1.0×10-9 ~1.0×10-6mol/L的 2,5-二羟基苯甲酸的PBS溶液中（pH=2），识别4min后，将电极移至25mL电解池中，电解质溶液为PBS溶液中（pH=2），与对电极铂丝电极，参比电极Ag/AgCl形成三电极体系，连接到电化学工作站进行差分脉冲伏安法（DPV）测定其相应电流值，脉冲幅度为50mV，脉冲周期为0.4s，脉冲宽度为50ms，电压增量为5mV，得出其线性方程为i=0.047lgC2,5-DHBA+0.671（R2=0.998），见图2；
（5）使用上述方法制备的MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极，进行羟基自由基的检测；在电化学体系中，以PbO2电极作为阳极，石墨为阴极，电解质溶液为0.10mol/L Na2SO4，pH=7.0，控制电极大小均为3cm×5cm×1mm，极间距为5.5cm，调节电流密度为10mA/cm2，恒定电压为7V，在该条件下进行电解，在体系中加入羟基自由基捕捉剂水杨酸，反应一段时间后，将上述制备的洗脱后的电极置于该体系中识别4min，将电极移至25mL电解池中，电解质溶液为PBS溶液中（pH=2）, 与对电极铂丝电极，参比电极Ag/AgCl形成三电极体系，连接到电化学工作站进行差分脉冲伏安法（DPV）测定其相应电流值，脉冲幅度为50mV，脉冲周期为0.4s，脉冲宽度为50ms，电压增量为5mV。其相应电流峰值为0.33μA，带入上述线性方程得C2,5-DHBA为5.62×10-8mol，即为该体系中羟基自由基的浓度；
同时采用荧光光谱分析法测量得浓度为5.60×10-8mol，该传感器与荧光光谱分析法测得结果接近，说明该传感器检测羟基自由基的可行性和准确性。
Claims (7)
1.一种用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
（1）将玻碳电极抛光，超声清洗，自然晾干，制得预处理玻碳电极；
（2）将还原氧化石墨烯和磁性纳米材料Fe3O4@SiO2分散在超纯水中，超声混匀得到分散液，其中磁性纳米材料Fe3O4@SiO2和还原氧化石墨烯的质量比为1:5~9；还原氧化石墨烯在分散液中质量浓度为0.05~4.5mg/mL，磁性纳米材料Fe3O4@SiO2在分散液中质量浓度为0.01~0.5mg/mL；然后取分散液滴涂于预处理玻碳电极表面，置于30~40℃红外灯下干燥10~20min，得到Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极；
（3）在Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极表面涂覆浓度为3mmol/L~5mmol/L萘酚溶液，自然晾干；
（4）在磷酸盐缓冲溶液中加入印迹分子溶液和功能单体溶液制得印迹溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05~0.1mol/L，pH为6~8；印迹分子溶液浓度为0.01~0.05mol/L，功能单体溶液浓度为0.01~0.25mol/L；磷酸盐缓冲溶液:印迹分子溶液:功能单体的体积比为9~11:2:1；
（5）采用电化学聚合方法，在-2.0～+2.0V内，将Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极置于印迹溶液中采用循环伏安法循环扫10～60圈，扫描速率为10~60mV/s，得到印迹聚合物修饰电极，然后将电极置于洗脱溶液中通过恒电位氧化法去除印迹分子，制得分子印迹电极MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE。
2.根据权利要求1所述的用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法，其特征在于：玻碳电极使用金相砂纸1#～7#逐级抛光，再用粒径0.05μm、0.3μm、1.0μm的氧化铝粉末依次抛光打磨，最后电极依次用质量浓度40～50%硝酸溶液、丙酮、蒸馏水超声清洗，每种溶液清洗60～180s。
3.根据权利要求1所述的用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法，其特征在于：还原氧化石墨烯是在1～5mg/mL、pH 9~10的氧化石墨烯分散液100mL中边搅拌边加入1～1.5mmol钼酸钠和750～850mg硼氢化钠，混合均匀后，水浴加热至70~90℃反应1～1.5h后，加入1～2mL双氧水，混匀后过滤，去离子水洗涤固体，干燥制得。
4.根据权利要求1所述的用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法，其特征在于：磁性纳米材料Fe3O4@SiO2是在1g纳米四氧化三铁中加入200mL无水乙醇、10mL体积浓度25%的氨水，混匀后在40~60℃下搅拌反应，然后将3mL正硅酸四乙酯滴加入反应液中，分3次添加，每次间隔15～20min，固液分离，沉淀用去离子水和乙醇交替洗涤三次，干燥制得。
5.根据权利要求1所述的用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法，其特征在于：印迹分子为2,5-二羟基苯甲酸或3,4-二羟基苯甲酸，功能单体为吡咯。
6.根据权利要求1所述的用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法，其特征在于：洗脱溶液为0.1~0.5mol/L，pH为4~6的磷酸二氢钠溶液；恒电位氧化法的电位为0.5～20V，洗脱时间为30～60min。
7.权利要求1-6中任一项所述的用于电化学传感器的分子印迹电极的制备方法制得的分子印迹电极在羟基自由基检测中的应用，其特征在于：将MIPs/Fe3O4@SiO2-rGO/GCE电极与参比电极、对电极连接在电化学工作站上，形成电化学传感器。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115201309A (zh) * | 2022-08-13 | 2022-10-18 | 昆明理工大学 | 一种羟基自由基电化学传感器的制备方法及应用 |
| CN115372437A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-11-22 | 甘肃政法大学 | 一种检测对乙酰氨基酚药物的分子印迹电化学传感器及其检测方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103913499A (zh) * | 2014-03-26 | 2014-07-09 | 青岛大学 | 一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法 |
| CN103926294A (zh) * | 2014-04-24 | 2014-07-16 | 青岛大学 | Cs/il-gr修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备及其应用 |
| CN104374815A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-02-25 | 江南大学 | 一种基于石墨烯分子印迹材料的电化学传感器及其制备方法 |
| CN104407027A (zh) * | 2014-12-16 | 2015-03-11 | 南京医科大学 | 磁控诱导自组装快速成膜制备谷胱甘肽印迹传感器的方法 |
| CN104807874A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-07-29 | 滨州学院 | 一种分子印迹电化学传感器的制备及应用方法 |
| CN105223243A (zh) * | 2015-09-24 | 2016-01-06 | 济南大学 | 一种碳点复合材料修饰的印迹电化学传感器的制备及应用 |
| CN105353021A (zh) * | 2015-09-24 | 2016-02-24 | 济南大学 | 一种检测日落黄的分子印迹电化学传感器的制备方法 |
| CN105891295A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-24 | 南京医科大学 | 基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法 |
| CN106018530A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-10-12 | 广东工业大学 | 一种双酚a分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用 |
| CN106198667A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-12-07 | 肇庆学院 | 一种用于检测微量双酚a的分子印迹电化学传感器 |
| CN110133077A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-08-16 | 长沙理工大学 | 一种基于复合膜修饰电极的苯乙醇胺a检测方法及传感器 |
| CN110423302A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-11-08 | 南华大学 | 一种磁性表面分子印迹聚合物及其制备方法与应用 |
-
2021
- 2021-09-15 CN CN202111081405.9A patent/CN113834866B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103913499A (zh) * | 2014-03-26 | 2014-07-09 | 青岛大学 | 一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法 |
| CN103926294A (zh) * | 2014-04-24 | 2014-07-16 | 青岛大学 | Cs/il-gr修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备及其应用 |
| CN104374815A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-02-25 | 江南大学 | 一种基于石墨烯分子印迹材料的电化学传感器及其制备方法 |
| CN104407027A (zh) * | 2014-12-16 | 2015-03-11 | 南京医科大学 | 磁控诱导自组装快速成膜制备谷胱甘肽印迹传感器的方法 |
| CN104807874A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-07-29 | 滨州学院 | 一种分子印迹电化学传感器的制备及应用方法 |
| CN105223243A (zh) * | 2015-09-24 | 2016-01-06 | 济南大学 | 一种碳点复合材料修饰的印迹电化学传感器的制备及应用 |
| CN105353021A (zh) * | 2015-09-24 | 2016-02-24 | 济南大学 | 一种检测日落黄的分子印迹电化学传感器的制备方法 |
| CN105891295A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-24 | 南京医科大学 | 基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法 |
| CN106018530A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-10-12 | 广东工业大学 | 一种双酚a分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用 |
| CN106198667A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-12-07 | 肇庆学院 | 一种用于检测微量双酚a的分子印迹电化学传感器 |
| CN110133077A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-08-16 | 长沙理工大学 | 一种基于复合膜修饰电极的苯乙醇胺a检测方法及传感器 |
| CN110423302A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-11-08 | 南华大学 | 一种磁性表面分子印迹聚合物及其制备方法与应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115201309A (zh) * | 2022-08-13 | 2022-10-18 | 昆明理工大学 | 一种羟基自由基电化学传感器的制备方法及应用 |
| CN115201309B (zh) * | 2022-08-13 | 2024-01-05 | 昆明理工大学 | 一种羟基自由基电化学传感器的制备方法及应用 |
| CN115372437A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-11-22 | 甘肃政法大学 | 一种检测对乙酰氨基酚药物的分子印迹电化学传感器及其检测方法 |
| CN115372437B (zh) * | 2022-08-30 | 2024-05-10 | 甘肃政法大学 | 一种检测对乙酰氨基酚药物的分子印迹电化学传感器及其检测方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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