CN105891295A - 基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法 - Google Patents

基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，该方法依次包含MGP三元复合纳米粒制备、分子印迹预聚体的形成、聚合反应、模板分子的洗脱与吸附、经磁控诱导形成传感膜、以及电化学检测。本发明方法操作简便、价格低廉、普适性强、响应灵敏、抗干扰能力强、稳定性和重现性良好，可实现血浆中胰岛素的高效、灵敏和快速检测，对临床相关疾病的诊疗有重要意义。

Description

基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种导电性印迹纳米粒及利用该导电性印迹纳米粒检测胰岛素的方法，特别是一种基于导电性印迹纳米粒的胰岛素磁控传感膜的制备方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷(1型糖尿病)或其生物作用受损(2型糖尿病)引起[1]。糖尿病的早期诊断、及时治疗，已得到社会极大的关注。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，血清中其含量水平是糖尿病早期诊断的关键[2]。但由于生物样品中胰岛素的含量水平低，分析易受共存物干扰，难度较大。因此，迫切需要建立更加灵敏、准确的快速检测方法，这对相关疾病的临床诊疗具有重要意义和实用价值。
电化学传感器灵敏度高、设计简单、价格低廉、有良好的稳定性及重复利用性、可实现实时监测因而应用广泛[3]。但选择性差成为其发展的瓶颈，而分子印迹技术具有专一性强、抗恶劣环境能力强的特点，将二者结合在一起相得益彰，在食品检验、环境监测、化学品和医药生产中具有很大的应用前景[4]。分子印迹聚合物用作传感器的敏感材料已成为分子印迹技术的一个重要应用，把这种以分子印迹聚合物作为敏感材料的电化学传感器称为分子印迹电化学传感器。其与近年来研究较多的生物敏感材料电化学传感器相比，不易被生物降解破坏，可重复利用，制备简单，并且耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂，因此有望成为生物材料的理想替代品。
磁性纳米粒具有生物相容性优良、导电性高、毒副作用小和易分离的优点。石墨烯是一种六边形晶格构成的单层片状二维晶体结构，具有优异的导电、导热和力学性能，巨大的比表面积，为新型纳米电化学传感器的发展提供良好的载体。聚苯胺因具有多样的结构，独特的掺杂机制、优异的物理化学性能、良好的稳定性和原料的价廉易得等优点，而成为聚合物研究的热点。将三者相结合形成的三元复合纳米粒充分利用三种纳米材料的优点，得到高比表面积、高导电性，具有催化活性的纳米材料。
近年来，随着人们对粒子在磁场下取向行为的认识逐步走向成熟，磁场已经成为一种新型的自组装动力。利用磁控诱导自组装技术形成结构高度有序的新型材料，在磁场磁化力作用下，使得磁性颗粒的易磁化轴沿着磁场方向一致排列，形成一维有序的磁性纳米结构[5]。将磁控诱导自组装技术引入分子印迹电化学传感器的构建，为在电极﹣溶液界面间定向控制和固定分子，形成均一稳定、可控的新型膜结构提供了可能[6]。目前，通过磁控诱导自组装技术，将具有电磁性的分子印迹聚合物组装到磁性玻碳电极表面形成非固化的磁性传感膜用于生物大分子胰岛素的检测还未见报道。
发明内容
本方法采用自组装技术的研究前沿磁控诱导自组装技术，以磁场诱导电活性的表面分子印迹聚合物修饰电极。在磁场的作用下，电磁性的分子印迹聚合物沿着外磁场方向组装成结构有序的网络结构；去掉电极内部磁芯，分子印迹聚合物可自动脱落，达到电极可再生的效果。使用磁控诱导电磁性的分子印迹聚合物修饰电极，不仅大大增强了电极的灵敏度和选择性，也为通过磁场强度的调节来制备组成和结构可控的传感膜创造了有利的条件。在电磁性三元复合纳米材料Fe3O4@rGO-PANI(Fe3O4@还原氧化石墨烯-聚苯胺)表面，以胰岛素为模板分子，苯胺为功能单体和交联剂，原位聚合制备电磁性的分子印迹聚合物；通过磁控诱导至电极表面完成了对胰岛素具有高效识别性高灵敏的分子印迹电化学传感器，并实现了血浆样品中胰岛素的灵敏快速的检测。该方法快捷简便，印迹聚合物可批量制备，修饰过程可再生，具有良好回收率和重现性，为临床胰岛素的监测过程中大样本的分析提供了一种新方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，该方法包括以下步骤：
a)Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子制备：将Fe2+，Fe3+与氧化石墨烯共沉淀后，加入水合肼还原形成Fe3O4@rGO；随后加入苯胺完成预组装，加入引发剂过硫酸铵，得Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子；
b)分子印迹预聚体的形成：配制含功能单体，胰岛素，Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子和PBS缓冲体系的混合溶液，充氮后密封，室温避光环境中放置3～6h，完成预组装形成分子印迹预聚体溶液；
c)聚合反应：在步骤b)得到的分子印迹预聚体溶液中加入引发剂过硫酸铵，0～20℃温度条件下搅拌反应；
d)模板分子的洗脱：将步骤c)得到的溶液，磁性分离，去除上清液，水洗，加乙酸-乙腈溶液处理，脱去模板分子，得导电性分子印迹纳米粒；
e)模板分子的吸附：将制得的导电性分子印迹纳米粒置于含待测胰岛素的PBS缓冲溶液中，搅拌吸附，得到胰岛素-MIPs溶液；
f)经磁控诱导形成传感膜：将步骤e)得到的含胰岛素-MIPs的溶液置于反应池中，插入含可拆卸的分段式磁芯的磁性玻碳电极，磁性富集纳米粒，在电极表面得到磁控传感膜。
g)电化学测定：测定电流响应。测定电流响应是利用Chi 660D电化学工作站。
步骤“a)”中，苯胺与Fe3O4@rGO的质量比为1:1～10:1。
步骤“a)”中的引发剂过硫酸铵与苯胺的摩尔比为1:5。
步骤“b)”中功能单体为苯胺，胰岛素浓度为0.3～0.5g L-1。
步骤“b)”中胰岛素与功能单体的摩尔浓度比为1:20～1:80，当Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子为100mg,PBS缓冲体系的浓度为0.2mol L-1。
步骤“c)”中搅拌反应时间为1～7h，步骤“c)”中的引发剂过硫酸铵与苯胺的摩尔比为1:5。
步骤“d)”中乙酸-乙腈溶液洗脱模板分子时间为5～30min。乙酸-乙腈溶液中乙酸和乙腈的体积比为1:9。
步骤“e)”中搅拌吸附时间为5～30min。
步骤“f)”中插入磁性玻碳电极的磁性富集纳米粒时间为3～10min，磁性电极可拆卸分段式磁芯的磁场强度为0.032T～0.256T。
步骤“g)”测定电流响应所用的电化学方法为DPV法。
本发明方法依次包含MGP三元复合纳米粒制备、分子印迹预聚体的形成、聚合反应、模板分子的洗脱与吸附、经磁控诱导形成传感膜、以及电化学检测。本发明方法操作简便、价格低廉、普适性强、响应灵敏、抗干扰能力强、稳定性和重现性良好，可实现血浆中胰岛素的高效、灵敏和快速检测，对临床相关疾病的诊疗有重要意义。
采用本发明基于导电性印迹纳米粒和磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法得到测定的线性及检测限：取浓度范围分别为5.0×10-11～6.0×10-6mol·L-1的胰岛素溶液进行测试，所测得浓度分别在5.0×10-11～5.0×10-9mol·L-1与5.0×10-9～2.5×10-7mol·L-1成较好的线性，计算可知检测限为17pmol·L-1(S/N＝3)。
实际样品测定过程：从医院获得受试者血浆，预处理后将其配制pH 7.0的PBS缓冲溶，加入MIPs完成吸附，随后采用磁控诱导MIPs自组装，用DPV法测定样品中胰岛素的浓度。
磁场强度及MIPs浓度的变化对印迹膜的影响：考察了磁场强度从0.032T～0.256T、MIPs浓度从0.55～0.70g·L-1变化时，制备的印迹传感器电流响应的变化，发现磁场强度在0.128T，MIPs浓度为0.625g·L-1时，电流响应值最大，此条件下制备的印迹传感器灵敏度最高。在适中的磁场强度与浓度下，制备的印迹传感器具有较高的电流响应；每个浓度下，都有与之对应的最佳磁场强度来制备灵敏度最佳的印迹传感器。当MIPs的浓度一定时，磁场强度太低，特别是低于0.128T时，可能由于所形成的印迹膜厚度较小，此时导电性较差且印迹效率低，传感器灵敏度差；磁场强度太高，高于0.128T时，所形成的印迹膜厚度较大，表面聚集且不均匀，此时纳米粒的过快聚集导致传质阻力较大，模板分子的嵌入过深导致印迹效率较低，传感器的灵敏度依然较差。进一步通过原子力显微镜的表征考察了磁场强度变化时形成的印迹膜的表面结构的变化。发现随着磁场强度的增加，所形成的印迹膜的表面粗糙度不断增加，进一步证实可以通过磁场强度的改变来制备结构可控的印迹传感膜。
与现有技术比较本发明的有益效果：
1.本发明得益于三元复合纳米粒的高导电性和催化活性，制备了集磁性，特异识别性，导电催化活性于一身的胰岛素印迹传感器。
2.本发明采用表面分子印迹技术在温和的条件下于水介质中完成聚合，保证生物大分子胰岛素结构的完整性，制备印迹效率高，动力学快的大分子印迹聚合物。
3.本发明将分子印迹与电化学传感器结合，提高了电化学传感器的选择性，实现了血浆样品中胰岛素的选择性快速检测。
4.本发明采用磁控自组装技术，可以通过电极内部的磁芯控制传感膜的有无，免去电极复杂的修饰及再生过程，缩短了自组装时间，且操作简单、价格低廉，适用于临床大样本的分析；通过调节磁性电极的磁场强度可控制薄膜的组成及结构，大大增强了电极的灵敏度。
附图说明
图1为基于导电性印迹纳米粒的胰岛素磁控传感膜的制备方法的流程示意图。
图2A为磁性玻碳电极及内部的示意图，图中可见电极内部有可拆卸的磁芯，且磁芯分段；图2B为有无磁芯时MIPs溶液的示意图，图中可见磁芯的有无可以灵活的控制电极表面传感膜的有无，该方法制备的传感膜免去电极复杂的修饰及可再生的过程，方便快捷，可控性强。
图3为传感膜制备过程的CV图(a.裸电极b.三元复合纳米材料修饰的电极c.洗脱前d.洗脱后e.吸附后)。图中，三元复合纳米材料的修饰后(曲线b)，峰电流值相对于裸电极(曲线a)有明显增大，表明该三元复合纳米材料导电性能优越，增加了电极的电流响应。磁场诱导未洗脱的MIPs(曲线c)在MGCE电极表面有序自组装，峰电流值略有下降。这是由于模板分子胰岛素为生物大分子，不具有电活性，也表明了胰岛素被成功聚合于纳米材料的表面。洗脱模板分子后(曲线d)峰电流值明显增加，表明洗脱前包埋有模板分子的印迹聚合物阻碍了探针分子传递至电极表面，而洗脱模板分子后的印迹聚合物内形成了胰岛素的特有识别空穴，可使探针分子通过空穴传递至电极表面发生电化学氧化还原反应从而产生放大的响应电流。吸附模板分子之后(曲线e)，峰电流值几乎恢复到洗脱前的水平，证实模板分子进入了印迹孔穴阻碍探针分子到达电极表面。
图4磁场强度及MIPs的浓度变化时，制备的传感器的电流响应图。
图中可见磁场强度在0.128T，MIPs浓度为0.625g·L-1时，电流响应值最大，此条件下制备的印迹传感器灵敏度最高。在适中的磁场强度与浓度下，制备的印迹传感器具有较高的电流响应；每个浓度下，都有与之对应的最佳磁场强度来制备灵敏度最佳的印迹传感器。
图5为磁场强度变化时形成的传感膜表面结构的变化图。
图中表明磁场强度为0.032，0.128，0.256T时，所形成的印迹膜的表面粗糙度分别为21.1nm,35.9nm和81.2nm。表明随着磁场强度的变化，膜的表面结构发生了改变。说明可以通过改变磁场强度来控制所形成的印迹膜的微观结构，从而提高电极的灵敏度。
图6A为静态吸附试验图。
图中可见MIPs制备的传感器在一定浓度达到了吸附饱和，而NIPs制备的传感器电流几乎不变；且MIPs的电流响应明显高于NIPs，表明MIPs形成有效的印迹孔穴，可完成胰岛素的选择性吸附。
图6B为吸附与解析动力学试验图。
图中可见达到吸附平衡时间为10min，解析平衡时间为15min。表明该传感器有较好的吸附与解析动力学。图6C为选择性吸附实验。本实验中选择另外7种常见干扰物(牛血清白蛋白，BSA；牛血红蛋白，BHB；辣根过氧化物酶，HRP；尿酸，UA；多巴胺，DA；抗坏血酸，AA；谷胱甘肽，GSH)考察了本发明实施例1方法制备的MIPs和非分子印迹聚合物(NIPs)的选择性能：以DPV法测定电极在胰岛素溶液中吸附后的电流响应，记录峰电流值I0；同法分别测定电极在含胰岛素与干扰物的混合溶液中吸附后峰电流值Im，结果表明干扰物对MIPs测定胰岛素的电流响应影响极小，表明制备的传感器选择性优异。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明：
药品和试剂：Al2O3(0.05μm，上海辰华仪器有限公司)，胰岛素(insulin，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)，氯化钾(KCl，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，铁氰化钾(K3Fe(CN)6，分析纯，上海新宝精细化工厂)，六水合氯化铁(国药集团化学试剂有限公司)，四水合氯化亚铁(温州市化学用料厂)，过硫酸铵(上海凌峰化学试剂有限公司)，氢氧化钠(NaOH，南京化学试剂有限公司)，盐酸(HCl，溧阳东方化学试剂有限公司)，苯胺(aniline,分析纯，阿拉丁试剂有限公司)，硫酸(H2SO4，上海化学试剂有限公司)，磷酸二氢钠(NaH2PO4，分析纯，南京化学试剂有限公司)，磷酸氢二钠(Na2HPO4，分析纯，上海凌峰化学有限公司)，水合肼(H2N-NH2，上海实验试剂有限公司)，氮气(工业级，南京五十五所)，实验用水为二次蒸馏水。
实施例1
a)Fe3O4@rGO-PANI(MGP)复合纳米粒子制备：1.72g FeCl2·4H2O，4.72g FeCl3·6H2O及230mg氧化石墨烯溶于110mL去离子水，超声1h。逐滴加入10mL氨水，升温至80℃，加入1.6mL水合肼，搅拌10h，完成Fe3O4@rGO的制备。取0.83g该纳米粒溶于100mL去离子水，加入5mL的苯胺(1.78mol L-1)，随后逐滴加入5mL的过硫酸铵(0.35mol L-1)，于0-5℃反应4h,真空干燥24h，得Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子(又称MGP三元复合纳米材料或MGP纳米粒)。
b)分子印迹预聚体的形成：配制含功能单体苯胺0.15mmol，胰岛素16mg，MGP纳米粒100mg和PBS缓冲体系(0.2mol L-1)的混合溶液40mL，充氮后密封，室温避光环境中放置，完成预组装形成分子印迹预聚体；
c)聚合反应：在步骤b)得到的预聚体溶液中加入引发剂过硫酸铵0.03mmol，0-4℃下搅拌反应4h；
d)模板分子的洗脱：将步骤c)得到的溶液，磁性分离去除上清液，水洗，加乙酸-乙腈(体积比9:1)溶液处理10min，脱去模板分子，得导电性分子印迹纳米粒(MIPs)。
e)模板分子的吸附：将制得的导电性分子印迹纳米粒置于含胰岛素的PBS缓冲溶中，搅拌吸附15min，得到胰岛素-MIPs溶液；
f)经磁控诱导形成传感膜：将含胰岛素-MIPs的溶液置于反应池中，插入含0.128T磁芯的磁性玻碳电极磁性富集纳米粒5min，在电极表面得到磁控传感膜。
g)电化学测定：利用chi 660D电化学工作站测定DPV电流响应，测定电流响应所用的电化学方法为常规的DPV法。
实施例2
a)Fe3O4@rGO-PANI(MGP)复合纳米粒子制备：1.72g FeCl2·4H2O，4.72g FeCl3·6H2O及230mg氧化石墨烯溶于110mL去离子水，超声1h。逐滴加入10mL氨水，升温至80℃，加入1.6mL水合肼，搅拌10h，完成Fe3O4@rGO的制备。取0.83g该纳米粒溶于100mL去离子水，加入5mL的苯胺(3.56mol L-1)，随后逐滴加入5mL的过硫酸铵(0.7mol L-1)，于0-5℃反应4h,真空干燥24h，得Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子(又称MGP三元复合纳米材料或MGP纳米粒)。
b)分子印迹预聚体的形成：配制含功能单体苯胺0.1mmol，胰岛素12mg，MGP纳米粒100mg和PBS缓冲体系(0.2mol L-1)的混合溶液40mL，充氮后密封，室温避光环境中放置，完成预组装形成分子印迹预聚体；
c)聚合反应：在步骤b)得到的预聚体溶液中加入引发剂过硫酸铵0.02mmol，5-10℃下搅拌反应5h；
d)模板分子的洗脱：将步骤c)得到的溶液，磁性分离去除上清液，水洗，加乙酸-乙腈9:1溶液处理20min，脱去模板分子，得导电性分子印迹纳米粒(MIPs)；
e)模板分子的吸附：将制得的导电性分子印迹纳米粒置于含胰岛素的PBS缓冲溶中，搅拌吸附25min，得到胰岛素-MIPs；
f)经磁控诱导形成传感膜：将含胰岛素-MIPs的溶液置于反应池中，插入含0.064T磁芯的磁性玻碳电极磁性富集纳米粒8min，在电极表面得到磁控传感膜。
g)电化学测定：利用chi 660D电化学工作站测定电流响应，测定电流响应所用的电化学方法为常规的DPV法。
实施例3
a)Fe3O4@rGO-PANI(MGP)复合纳米粒子制备：1.72g FeCl2·4H2O，4.72g FeCl3·6H2O及230mg氧化石墨烯溶于110mL去离子水，超声1h。逐滴加入10mL氨水，升温至80℃，加入1.6mL水合肼，搅拌10h，完成Fe3O4@rGO的制备。取0.83g该纳米粒溶于100mL去离子水，加入5mL的苯胺(5.34mol L-1)，随后逐滴加入5mL的过硫酸铵(1.07mol L-1)，于0-5℃反应4h,真空干燥24h，得Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子(又称MGP三元复合纳米材料或MGP纳米粒)。
b)分子印迹预聚体的形成：配制含功能单体苯胺0.2mmol，胰岛素20mg，MGP纳米粒100mg和PBS缓冲体系(0.2mol L-1)的混合溶液40mL，充氮后密封，室温避光环境中放置，完成预组装形成分子印迹预聚体；
c)聚合反应：在步骤b)得到的预聚体溶液中加入引发剂过硫酸铵0.04mmol，3-6℃下搅拌反应3h；
d)模板分子的洗脱：将步骤c)得到的溶液，磁性分离去除上清液，水洗，加乙酸-乙腈9:1溶液处理12min，脱去模板分子，得导电性分子印迹纳米粒(MIPs)；
e)模板分子的吸附：将制得的导电性分子印迹纳米粒置于含胰岛素的PBS缓冲溶中，搅拌吸附15min，得到胰岛素-MIPs；
f)经磁控诱导形成传感膜：将含胰岛素-MIPs的溶液置于反应池中，插入含0.256T磁芯的磁性玻碳电极磁性富集纳米粒8min，在电极表面得到磁控传感膜。
g)电化学测定：利用chi 660D电化学工作站测定电流响应，测定电流响应所用的电化学方法为常规的DPV法。
实施例4
a)Fe3O4@rGO-PANI(MGP)复合纳米粒子制备：1.72g FeCl2·4H2O，4.72g FeCl3·6H2O及230mg氧化石墨烯溶于110mL去离子水，超声1h。逐滴加入10mL氨水，升温至80℃，加入1.6mL水合肼，搅拌10h，完成Fe3O4@rGO的制备。取0.83g该纳米粒溶于100mL去离子水，加入5mL的苯胺(8.9mol L-1)，随后逐滴加入5mL的过硫酸铵(1.78mol L-1)，于0-5℃反应4h,真空干燥24h，得Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子(又称MGP三元复合纳米材料或MGP纳米粒)。
b)分子印迹预聚体的形成：配制含功能单体苯胺0.12mmol，胰岛素15mg，MGP纳米粒100mg和PBS缓冲体系(0.2mol L-1)的混合溶液40mL，充氮后密封，室温避光环境中放置，完成预组装形成分子印迹预聚体；
c)聚合反应：在步骤b)得到的预聚体溶液中加入引发剂过硫酸铵0.024mmol，0-4℃下搅拌反应5h；
d)模板分子的洗脱：将步骤c)得到的溶液，磁性分离去除上清液，水洗，加乙酸-乙腈9:1溶液处理20min，脱去模板分子，得导电性分子印迹纳米粒(MIPs)；
e)模板分子的吸附：将制得的导电性分子印迹纳米粒置于含胰岛素的PBS缓冲溶中，搅拌吸附20min，得到胰岛素-MIPs；
f)经磁控诱导形成传感膜：将含胰岛素-MIPs的溶液置于反应池中，插入含0.192T磁芯的磁性玻碳电极磁性富集纳米粒6min，在电极表面得到磁控传感膜。
g)电化学测定：利用chi 660D电化学工作站测定电流响应，测定电流响应所用的电化学方法为常规的DPV法。
参考文献
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Claims (10)

1.一种基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子制备：将Fe2+，Fe3+与氧化石墨烯共沉淀后，加入水合肼还原形成Fe3O4@rGO；随后加入苯胺完成预组装，加入引发剂过硫酸铵，得Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子；
b)分子印迹预聚体的形成：配制含功能单体，胰岛素，Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子和PBS缓冲体系的混合溶液，充氮后密封，室温避光环境中放置3～6h，完成预组装形成分子印迹预聚体溶液；
c)聚合反应：在步骤b)得到的分子印迹预聚体溶液中加入引发剂过硫酸铵，0～20℃温度条件下搅拌反应；
d)模板分子的洗脱：将步骤c)得到的溶液，磁性分离，去除上清液，水洗，加乙酸-乙腈溶液处理，脱去模板分子，得导电性分子印迹纳米粒；
e)模板分子的吸附：将制得的导电性分子印迹纳米粒置于含待测胰岛素的PBS缓冲溶液中，搅拌吸附，得到胰岛素-MIPs溶液；
f)经磁控诱导形成传感膜：将步骤e)得到的含胰岛素-MIPs的溶液置于反应池中，插入含可拆卸的分段式磁芯的磁性玻碳电极，磁性富集纳米粒，在电极表面得到磁控传感膜；
g)电化学测定：测定电流响应。
2.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“a)”中，苯胺与Fe3O4@rGO的质量比为1:1～10:1。
3.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，步骤“a)”中的引发剂过硫酸铵与苯胺的摩尔比为1:5。
4.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“b)”中功能单体为苯胺，胰岛素浓度为0.3～0.5g L-1。
5.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“b)”中胰岛素与功能单体的摩尔浓度比为1:20～1:80，当Fe3O4@rGO-PANI复合纳米粒子为100mg,PBS缓冲体系的浓度为0.2mol L-1。
6.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“c)”中搅拌反应时间为1～7h，步骤“c)”中的引发剂过硫酸铵与苯胺的摩尔比为1:5。
7.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“d)”中乙酸-乙腈溶液洗脱模板分子时间为5～30min，乙酸-乙腈溶液中乙酸和乙腈的体积比为1:9。
8.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“e)”中搅拌吸附时间为5～30min。
9.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒及磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“f)”中插入磁性玻碳电极的磁性富集纳米粒时间为3～10min，磁性电极可拆卸分段式磁芯的磁场强度为0.032T～0.256T。
10.根据权利要求1所述的基于导电性印迹纳米粒和磁控诱导成膜对胰岛素的电化学检测方法，其特征在于步骤“g)”测定电流响应所用的电化学方法为DPV法。
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