CN113832155A - 一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用 - Google Patents

一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113832155A
CN113832155A CN202111221030.1A CN202111221030A CN113832155A CN 113832155 A CN113832155 A CN 113832155A CN 202111221030 A CN202111221030 A CN 202111221030A CN 113832155 A CN113832155 A CN 113832155A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
liver cancer
lncc2orf49
expression
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111221030.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113832155B (zh
Inventor
廖卫捷
张雅鸥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Original Assignee
Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University filed Critical Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Priority to CN202111221030.1A priority Critical patent/CN113832155B/zh
Publication of CN113832155A publication Critical patent/CN113832155A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113832155B publication Critical patent/CN113832155B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了生物技术领域的一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用。本发明提供肝癌相关的肿瘤标志物为LncRNA,命名为LncC2orf49‑DT,其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。LncC2orf49‑DT的高表达与肝癌患者的不良预后密切相关,将LncC2orf49‑DT作为肝癌的标志物,为肝癌的预后评估及疗效监测提供有效信息,可作为指导肝癌治疗的新生物靶点。本发明提供的LncC2orf49‑DT表达抑制剂siRNA,在用于LncC2orf49‑DT的表达抑制时,干扰效果好,具有临床应用潜力。

Description

一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用。
背景技术
2020年最新的全球癌症统计数据显示,肝癌是极为常见的恶性肿瘤之一,其发病率居第6位,死亡率居第4位。肝癌严重危害居民的健康,我国肝癌患者的5年生存率仅为14.1%。目前,手术切除联合放化疗被认为是治疗早期肝癌的最有效手段。但其疗效仍十分有限,术后复发率较高,导致肝癌患者的总体预后极差。因此,进一步寻找肝癌治疗的新型靶标迫在眉睫。
长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)是指超过200个核苷酸但没有蛋白编码功能的的非编码RNA,但其可参与多种表观遗传调控过程,如基因印迹、转录调控及染色质修饰等。近年来,LncRNA被发现与恶性肿瘤相关。已有多个LncRNA被揭示参与恶性肿瘤的发生发展,例如LncRNA H19在食管癌中高表达,介导癌细胞的EMT进程,而促进其转移;LncRNA HOTAIR在乳腺癌中显著高表达,上调HOXD10、PCDH等原癌基因的表达,促进了癌细胞的增殖及转移能力。LncC2orf49-DT是一个新发现的长链非编码RNA。但LncC2orf49-DT是否参与恶性肿瘤的发生发展的过程及是否可以作为一种新的治疗靶点应用于肝癌的治疗至今未见有报道。
发明内容
为了解决现有技术中的不足,本发明的目的在于提供一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用。具体地:
本发明第一方面提供一种肝癌相关的肿瘤标志物,其为LncRNA,命名为LncC2orf49-DT,具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。编码该LncC2orf49-DT的基因GenBank号为100506473,2021年7月24号。
本发明第二方面提供一种所述肝癌相关的肿瘤标志物的检测引物对,所述引物对具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示,或如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
具体地,肝癌相关的肿瘤标志物的检测引物对如下:
引物对1:
正向引物:5’-TTGAAAGAAAGGAGGAGGG-3’;(SEQ ID NO.2)
反向引物:5’-TGTTGAGTGCGTTATGGTT-3’。(SEQ ID NO.3)
引物对2:
正向引物:5’-AAGGTTACTCCCGCTACAC-3’;(SEQ ID NO.4)
反向引物:5’-GTCCCAGAGGAACTCACAA-3’。(SEQ ID NO.5)
本发明第三方面提供所述的肿瘤标志物在制备肝癌辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明第四方面提供一种肝癌辅助诊断试剂,包括检测所述LncC2orf49-DT的特异性引物对和内参基因的特异性引物对;
优选地,所述检测LncC2orf49-DT的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示,或如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示;
优选地,所述内参基因为ACTB;
优选地,所述ACTB的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
具体地,LncC2orf49-DT的特异性引物对、ACTB的特异性引物对如下:
LncC2orf49-DT的特异性引物对:
引物对1:
正向引物:5’-TTGAAAGAAAGGAGGAGGG-3’;(SEQ ID NO.2)
反向引物:5’-TGTTGAGTGCGTTATGGTT-3’。(SEQ ID NO.3)
引物对2:
正向引物:5’-AAGGTTACTCCCGCTACAC-3’;(SEQ ID NO.4)
反向引物:5’-GTCCCAGAGGAACTCACAA-3’。(SEQ ID NO.5)
ACTB的特异性引物对:
正向引物:5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’;(SEQ ID NO.6)
反向引物:5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。(SEQ ID NO.7)
本发明第五方面提供一种肝癌辅助诊断试剂盒,包括所述的肝癌辅助诊断试剂。
本发明第六方面提供一种LncC2orf49-DT表达抑制剂,所述表达抑制剂为抑制LncC2orf49-DT表达的siRNA或shRNA;
优选地,所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示,或如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示;
优选地,所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示,或如SEQID NO.14和SEQ ID NO.15所示;
优选地,所述shRNA连接在质粒表达载体或病毒表达载体上。
具体地,所述siRNA的核苷酸序列为:
siRNA-1序列:
正义链5’-GCUACACUAUCAUCUGUAA-3’,(SEQ ID NO.8)
反义链5’-UUACAGAUGAUAGUGUAGC-3’;(SEQ ID NO.9)
siRNA-2序列:
正义链5’-GGAGAGUUCUUGUAUCCUA-3’,(SEQ ID NO.10)
反义链5’-UAGGAUACAAGAACUCUCC-3’。(SEQ ID NO.11)
所述shRNA的核苷酸序列为:
shLncC2orf49-DT-1序列:
正义链5’-CCGGGCTACACTATCATCTGTAACTCGAGTTACAGATGATAGTGTAGCTTTTTG-3’,(SEQ ID NO.12)
反义链5’-AATTCAAAAAGCTACACTATCATCTGTAACTCGAGTTACAGATGATAGTGTAGC-3’;(SEQ ID NO.13)
shLncC2orf49-DT-2序列:
正义链5’-CCGGGGAGAGTTCTTGTATCCTACTCGAGTAGGATACAAGAACTCTCCTTTTTG-3’,(SEQ ID NO.14)
反义链5’-AATTCAAAAAGGAGAGTTCTTGTATCCTACTCGAGTAGGATACAAGAACTCTCC-3’。(SEQ ID NO.15)
本发明第七方面提供LncC2orf49-DT表达抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明第八方面提供一种治疗肝癌的药物组合物,包括LncC2orf49-DT表达抑制剂。
进一步地,所述的药物组合物中,所述LncC2orf49-DT表达抑制剂为siRNA,所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示,或如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示。
本发明的有益效果为:
1、本发明发现肝癌中LncC2orf49-DT表达较癌旁组织显著升高(P<0.001),LncC2orf49-DT高表达不利于肝癌患者的总体生存(P=0.0011),且敲低LncC2orf49-DT时,肝癌细胞HepG2的克隆形成和迁移显著被抑制。LncC2orf49-DT的高表达与肝癌患者的不良预后密切相关,提示LncC2orf49-DT可以作为肝癌的预后标志物,为肝癌的预后评估及疗效监测提供有效信息。因此,LncC2orf49-DT可作为指导肝癌治疗的新生物靶点。
2、本发明提供的LncC2orf49-DT表达抑制剂siRNA,在用于LncC2orf49-DT的表达抑制时,干扰效果好,具有临床应用潜力。
附图说明
图1示出了TCGA数据分析肝癌中LncC2orf49-DT的表达。肝癌组织中LncC2orf49-DT的表达量显著高于正常组织(P<0.001),LncC2orf49-DT的表达量与病人病程进展(stageI-II-III)显著相关(P<0.05)。
图2示出了TCGA数据分析LncC2orf49-DT高表达对肝癌患者生存的影响。LncC2orf49-DT高表达不利于肝癌患者的总体生存(P=0.0011)。
图3示出了稳定敲低LncC2orf49-DT的细胞株中LncC2orf49-DT的RNA水平显著降低。
图4示出了敲低LncC2orf49-DT后,HepG2细胞的增殖显著下降。
图5示出了敲低LncC2orf49-DT后,HepG2细胞的迁移能力显著下降。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明,现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中,各原始试剂材料均可商购获得,未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件,或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
本实施例用于说明TCGA数据分析肝癌中LncC2orf49-DT的表达量变化。
1.TCGA数据分析过程:
进入TCGA官网(https://cancergenome.nih.gov),使用官网的GDC client工具下载肝癌(LIHC)RNA-Seq中的HTSeq-FPKM数据,获得包含样本编号和基因HTSeq-FPKM数据的表达矩阵。使用GraphPad Prism 8.0分析肝癌组织和癌旁组织的HTSeq-FPKM矩阵中LncC2orf49-DT的表达数据并绘图,统计分析方法为Mann-Whitney U检验。
进入TCGA官网(https://cancergenome.nih.gov),使用GDC client工具下载肝癌(LIHC)的临床数据(clinical)获得样本编号与各项临床数据的矩阵。提取各样本中LncC2orf49-DT的HTSeq-FPKM数据和肿瘤TNM分期数据中的stage(T)数据。使用GraphPadPrism 8.0分析不同肿瘤分期的肝癌组织的HTSeq-FPKM矩阵中LncC2orf49-DT的表达量并绘图,统计分析方法为one way ANONA。
2.结果:肝癌组织中LncC2orf49-DT的表达量显著高于正常组织(P<0.001),如图1中的A所示。随着肿瘤发展的进程,LncC2orf49-DT的表达量逐渐升高(p<0.05),如图1中的B所示。表明LncC2orf49-DT的表达量的升高与肝癌的发生和发展相关。
实施例2
本实施例用于说明TCGA数据分析表明LncC2orf49-DT高表达与肝癌患者的预后关系。
1.TCGA数据分析过程:
进入TCGA官网(https://cancergenome.nih.gov),使用GDC client工具下载肝癌(LIHC)的临床数据(clinical)获得样本编号与各项临床数据的矩阵。提取各样本中LncC2orf49-DT的HTSeq-FPKM数据,样本的生存状态及生存天数数据。使用Kaplan-Meier法获得生存曲线,log-rank检验生存曲线差异,P<0.05表明具有统计学意义。
2.结果:LncC2orf49-DT的高表达不利于肝癌患者的总体生存(P<0.01),如图2所示。
实施例3
本实施例提供一种稳定敲低LncC2orf49-DT的细胞株的构建方法,细胞株具体的为HepG2肝癌细胞株。HepG2肝癌细胞购于美国ATCC公司,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基(购于Thermo Fisher Scientific公司)置于37℃、5%的CO2条件下进行培养。
1.构建方法为:
(1)设计用于阴性对照shRNA和干扰LncC2orf49-DT表达的和2个shRNA
阴性对照shRNAshNC序列:
正义链5’-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3’;(SEQ ID NO.16)
反义链5’-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-3’。(SEQ ID NO.17)
shLncC2orf49-DT-1序列:
正义链5’-CCGGGCTACACTATCATCTGTAACTCGAGTTACAGATGATAGTGTAGCTTTTTG-3’,(SEQ ID NO.12)
反义链5’-AATTCAAAAAGCTACACTATCATCTGTAACTCGAGTTACAGATGATAGTGTAGC-3’;(SEQ ID NO.13)
shLncC2orf49-DT-2序列:
正义链5’-CCGGGGAGAGTTCTTGTATCCTACTCGAGTAGGATACAAGAACTCTCCTTTTTG-3’,(SEQ ID NO.14)
反义链5’-AATTCAAAAAGGAGAGTTCTTGTATCCTACTCGAGTAGGATACAAGAACTCTCC-3’。(SEQ ID NO.15)
(2)利用shRNA法构建可稳定过表达LncC2orf49-DT特异性siRNA的HepG2细胞系
分别将上述(1)中的shNC、shLncC2orf49-DT-1和shLncC2orf49-DT-2的正义链和反义链退火后插入到pLKO.1载体(购自addgene公司)的限制性内切酶Agel和EcoRl识别位点之间得到shNC、shLncC2orf49-DT-1和shLncC2orf49-DT-2的shRNA质粒。将上述质粒分别用Lipofectamine3000转染至HepG2细胞系,48小时后开始用2ug/ml的嘌呤霉素筛选,存活的细胞即为可以表达阴性对照shNC和干扰LncC2orf49-DT的表达的shLncC2orf49-DT-1和shLncC2orf49-DT-2细胞系。
(3)基因敲低效果检测
使用RNAiso plus(购于TaKaRa公司)提取的(2)中细胞的总RNA,然后用ReverTraAceqPCR RT试剂盒(购于TOYOBO公司)反转录成cDNA。使用SYBR Green RealTimePCRMaster Mix(购于TOYOBO公司)进行荧光定量PCR,以β-actin(ACTB)作为内参基因,每实验重复三次。
用于实时荧光定量检测LncC2orf49-DT表达的引物对为以下两对中的任意一对:
引物对1:
正向引物:5’-TTGAAAGAAAGGAGGAGGG-3’;(SEQ ID NO.2)
反向引物:5’-TGTTGAGTGCGTTATGGTT-3’。(SEQ ID NO.3)
引物对2:
正向引物:5’-AAGGTTACTCCCGCTACAC-3’;(SEQ ID NO.4)
反向引物:5’-GTCCCAGAGGAACTCACAA-3’。(SEQ ID NO.5)
内参基因ACTB PCR引物对:
正向引物:5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’;(SEQ ID NO.6)
反向引物:5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。(SEQ ID NO.7)
2.结果:图3显示稳定敲低LncC2orf49-DT的细胞株(shLncC2orf49-DT-1和shLncC2orf49-DT-2)与对照细胞株(shNC)中LncC2orf49-DT的RNA表达情况,由图3可知,与对照组细胞相比,构建的稳定敲低LncC2orf49-DT的细胞株中LncC2orf49-DT的表达量下降约60%,说明细胞株中LncC2orf49-DT敲低成功,该方法可筛选得到LncC2orf49-DT稳定低表达的肝癌细胞。
实验例4
本实施例利用实施例3中构建的稳定敲低LncC2orf49-DT的细胞株,检测LncC2orf49-DT对肝癌细胞增殖及迁移的影响。
1.具体检测内容为:
(1)细胞克隆形成实验
将shNC细胞和shLncC2orf49-DTsh-1以及shLncC2orf49-DT-2细胞制成浓度为5×103个/ml的悬液,加入2ml于6孔板中。待细胞长到大小肉眼可见的细胞团后,去除培养基,用甲醇固定15分钟,然后用PBS洗两次,晾干。随后加入0.5%的结晶紫溶液染色10分钟,在用超纯水洗干净,晾干后拍照。
(2)细胞迁移实验
实验前48h,将肿瘤细胞接种于10cm的培养皿中(以2×106/皿)。采用胰酶消化使细胞浓度为2×105/ml。将3×104个细胞(于150μl无血清DMEM中)接种到24孔小室中进行迁移实验,下室加入650ul的含血清的DMEM中。常规条件培养24h后,使用甲醇固定5min,再用0.5%结晶紫染色15分钟,自来水清洗,用棉签去除未迁移的细胞。室温晾干,在光学显微镜下拍照观察。
2.结果:图4显示稳定敲低LncC2orf49-DT的细胞株与对照细胞株的细胞增殖检测结果。由图4可知,LncC2orf49-DT的表达对肝癌细胞的增殖有显著影响。图5显示稳定敲低LncC2orf49-DT的细胞株与对照细胞株的细胞迁移检测结果。由图5可知,肝癌细胞在敲低LncC2orf49-DT后,其迁移能力明显降低,表明肝癌细胞的迁移与LncC2orf49-DT的表达显著相关。说明LncC2orf49-DT参与肝癌的发生发展,可作为临床对肝癌的疗效监测、预后评估的指标,为肝癌的诊断及靶向治疗提供有力依据,提高患者的生存率。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学深圳国际研究生院
<120> 一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用
<130> CP121011027C
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3449
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
augccgggcu ccuucucucg cugcugguuc ggguguuggg gccugguccc gcuugcaaaa 60
gcucccacgg accagagaaa agaggaggau gucagacgua gaaacaaaug gcgugucaag 120
uuucgcagga agagagggaa gagugaagcu ccgggagcca gccacgauua gucgcgccuu 180
cugugacguc caauggcaga ggucaaaggg auuccugggg caaccucgag ggaaagaauu 240
cuggcuccga gggccggugu acagugcuuu aaauauggca gugguuaugu gugaaauuau 300
cguguuuuuc uguuuaaccu guuucuuguc ucuucaucgc cuuucuauau aauguaagac 360
cagaggcuuu auguagugaa uucccuguaa ccccggcugc uuggacagau agguauucaa 420
guauuuguuu cuugaaguaa uccucugaau uaacuugcuc acauguaaaa aauaauaacg 480
ggcugggaaa cgccaguaau agccgccaaa cguuuguuag acauuuacag ugugccaggg 540
acugcauuuu acguguauua ucacauuccu cagaacagcc uaaugaggua uauauuacua 600
gaaugccuau uuuucagaug aggaaacuga ugcauagaaa ggauaauuua cucaagagcg 660
aggaaguagc aagcauaaaa uccgaguaca uuuuuuucug cauguauuaa uagguacaau 720
gaaguaacuu uuuaaauugc uguagguauc aaucauaguc uuaauuccca guaauucacu 780
uacuaagaaa uauuuucugc uucucuuuca ucauucaugg gagagauaca uaucccuaaa 840
uauuuugcac auuuaaaacu uaaacuuggg uaugguggcu uaugccugua aucacggcgu 900
uuugggaggc ucagguggga ggauugcuug aguccaggag uuccaggcca gccugggcca 960
cauaguaaga ccccguaucu acaaaaaaua aaaaaaaaau uaaccgggca ugguaguguc 1020
ucuguaguac uagcuacucg ggaggcugag gugguaggau cacuggcgcc cagcaauucc 1080
agccugcagu uaggauuacc acacugcacu ucagccugag cggcagaaug ggaccauguc 1140
ugaaaaaaua aauaaaaaau aaaacuugca gguauguucu gaauguuuau uguaugcauc 1200
cucuaugagg uaucauuuua uuggaaauua uugcauuguc uacaaaaaua ugaagaacuc 1260
ugaagaugcc aaaagauaaa ccgugaaaga guacuagaag ugagcuccuc aaaaagauaa 1320
agcugagaag uguuucccaa uuuuucuuac ucauuuaugu auguaauacu uuaugucuag 1380
aaacugaauu ucagagcugg gagggaacuu aaaaguuagu ccaguucuuu cauguuagug 1440
ccaagaaagc ugaucagaaa gagauuaaau gacuugccca aaauugaaua gucuuaaauc 1500
ugagcugagg caggcgucug aaugucuuaa auuggaguua aauguauuag cgucauagua 1560
uuaacaucau cauauuccau aucucucaaa ucugauuuga uuuucauuac aauagagaaa 1620
uaagugugau uaguauuauc cccauuuccu ucaccgggag gcacauuguu uuaguaucaa 1680
aagcagcuac cuugggagaa uccggggcua gaaaccugac uucauuucaa guuuuacucu 1740
uguugcacca aaaccuuggg ugaguuaguu ucucagccuc aguccccuca ucaggaaaau 1800
gcuguguuag cacuuucugu gaagaaugau caaaggagug gagauuaugg agauuauaaa 1860
cacacuugac acaguaagug uuuaagaacu gguagcugau uuuuacaaag uuauggguca 1920
uagaaggcag uuuagagaaa agggcaggcu uuggaguagc ucaguuguau uauaaccuug 1980
gcuucuuuac ucaccuagga cauacauucu cucuuuagcu guagcuuccu cccuucugag 2040
auggaaauua uaagccaucu cacaguguug ugaggauugg agcucaagug uguaaaaugc 2100
cuccucugug ggcucuccuu ggagaguucu uguauccuau ugauugucau caaaggaaaa 2160
aaguggcagg augauggcau aagugggaag aaccuugagu uuaauagucu gaaaaagugg 2220
uuacagguuc uugcuaugcu uuuccucucu gugguuuucu gaacccaucg ccuaaccuga 2280
agccuuaaac uucaucugca aaaauguuuu guggcaggua agaugucuuu uuuuucuucc 2340
aguacuuccc aguuuaaaac uaagaguacu uccuugcuua uaacuaauuc uauuaauauu 2400
auucuaggug acucugaagc agaacucuug agauggaagg auugucaucu gaggaaaaaa 2460
aaucaagauu aagagaggag gaacuagaau gagauucaca uaccgucucu ccuccaaggg 2520
aaggagagag uggugaugcc ugcccacucc uuccugggca gaacauuugu agcauggaac 2580
auuggagaau uugcagucug cugacuuucu gauuuaggag guugaugggg aggccuuaua 2640
auuugcauuu cuaacaaguu cugaggugau gcuucaagua uguccaggca gaagggcugc 2700
cucacagaga auucugccau accacauggg aauugaaguc acagacaucu cuaacccuca 2760
agccugaaac caaaagacug aaaaccaaca cuacagugga caaagaacau cucugaacuu 2820
guguggggac cagugacaca aggaccuaag gucucucucu ucucaucuug gcacuucaga 2880
agucucccca aucuugacaa agcccuggag aaagggccgg gccucccguu gauaagaaua 2940
ucacugcaga uaaauggagg uuucaaauug aaagaaagga ggagggccuc cuguugauaa 3000
gauuauuguc acugcaggua aauggaggcu ucaaauagaa auacauuuca guuacagaaa 3060
aaaaaauuau cuuuguuaca cauuugaguu ugcaggccua agguuacucc cgcuacacua 3120
ucaucuguaa ccauaacgca cucaacauuu uaagcuaacu auaaggauug uugcuucacu 3180
caaagauccu gagguuuuau ucacuaacau uuuuauuugg ugacuauagu ugacaagaac 3240
aaagcugugg ggaaccaaca aacacugcaa ugccuggcau ugucaccuca cuagauugug 3300
aguuccucug ggacaggguc cguacauuuu cuuagaaucc cucacuuagc cauuagccug 3360
cacagugcuu guacuuagua agugcucagu aaauguuugu ggaaugaaug caugaugaac 3420
aaaauauaua cugaggacuc uugguguug 3449
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttgaaagaaa ggaggaggg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgttgagtgc gttatggtt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaggttactc ccgctacac 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcccagagg aactcacaa 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgacgtggac atccgcaaag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctggaaggtg gacagcgagg 20
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcuacacuau caucuguaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
uuacagauga uaguguagc 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggagaguucu uguauccua 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
uaggauacaa gaacucucc 19
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgggctaca ctatcatctg taactcgagt tacagatgat agtgtagctt tttg 54
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aattcaaaaa gctacactat catctgtaac tcgagttaca gatgatagtg tagc 54
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccggggagag ttcttgtatc ctactcgagt aggatacaag aactctcctt tttg 54
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aattcaaaaa ggagagttct tgtatcctac tcgagtagga tacaagaact ctcc 54
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccggttctcc gaacgtgtca cgtctcgaga cgtgacacgt tcggagaatt tttg 54
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aattcaaaaa ttctccgaac gtgtcacgtc tcgagacgtg acacgttcgg agaa 54

Claims (9)

1.一种肝癌相关的肿瘤标志物,其特征在于,所述肿瘤标志物为LncRNA,命名为LncC2orf49-DT,其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述肝癌相关的肿瘤标志物的检测引物对,其特征在于,所述引物对具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示,或如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的肿瘤标志物在制备肝癌辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。
4.一种肝癌辅助诊断试剂,其特征在于,包括检测权利要求1所述LncC2orf49-DT的特异性引物对和内参基因的特异性引物对;
优选地,所述检测LncC2orf49-DT的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示,或如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示;
优选地,所述内参基因为ACTB;
优选地,所述ACTB的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
5.一种肝癌辅助诊断试剂盒,其特征在于,包括权利要求3所述的肝癌辅助诊断试剂。
6.一种LncC2orf49-DT表达抑制剂,其特征在于,所述表达抑制剂为抑制LncC2orf49-DT表达的siRNA或shRNA;
优选地,所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示,或如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示;
优选地,所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示,或如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示;
优选地,所述shRNA连接在质粒表达载体或病毒表达载体上。
7.LncC2orf49-DT表达抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。
8.一种治疗肝癌的药物组合物,其特征在于,包括LncC2orf49-DT表达抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物,其特征在于,所述LncC2orf49-DT表达抑制剂为siRNA,所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示,或如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
CN202111221030.1A 2021-10-20 2021-10-20 一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用 Active CN113832155B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111221030.1A CN113832155B (zh) 2021-10-20 2021-10-20 一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111221030.1A CN113832155B (zh) 2021-10-20 2021-10-20 一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113832155A true CN113832155A (zh) 2021-12-24
CN113832155B CN113832155B (zh) 2024-01-02

Family

ID=78965426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111221030.1A Active CN113832155B (zh) 2021-10-20 2021-10-20 一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113832155B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287174A (zh) * 2016-04-12 2017-10-24 中国科学技术大学 肝癌标志物oxct1及其在肝癌诊断、治疗以及预后中的应用
CN111500734A (zh) * 2020-05-28 2020-08-07 南通大学 一种肝癌诊断标志物及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287174A (zh) * 2016-04-12 2017-10-24 中国科学技术大学 肝癌标志物oxct1及其在肝癌诊断、治疗以及预后中的应用
CN111500734A (zh) * 2020-05-28 2020-08-07 南通大学 一种肝癌诊断标志物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113832155B (zh) 2024-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111778338B (zh) 一种环状rna生物标志物的应用
WO2021022888A1 (zh) 靶向长链非编码rna ddx11-as1的aso、试剂盒及在肝癌治疗中的应用
CN110066875B (zh) 一种长链非编码RNA lncLCIR-1作为肺癌分子标志物的应用
CN107805663B (zh) Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用
US20170073775A1 (en) Compositions and methods for prognosis of ovarian cancer
CN108753969B (zh) 长链非编码rna在肝细胞癌诊疗中的应用
CN113462780A (zh) 一种用于前列腺癌辅助诊断的标志物及试剂盒
CN107519193B (zh) 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
CN111455059A (zh) 检测及靶向生物标志物的试剂在口腔鳞癌中的应用
CN112094913B (zh) 结直肠癌生物标志物及其用途
CN111455061A (zh) lncRNA生物标志物在口腔鳞癌诊疗中的应用
CN111455060A (zh) 诊断和治疗口腔鳞癌的相关生物标志物及应用
CN111440874A (zh) 口腔鳞癌诊断和治疗用生物标志物
CN109652529B (zh) 骨质疏松特异性miRNA、组合物及其诊疗用途
CN109486816B (zh) 一种用于肿瘤治疗的多聚核苷酸及其应用
CN113832155B (zh) 一种肝癌相关的肿瘤标志物及其应用
CN112641797B (zh) 抑制结直肠癌生长、转移的靶标与诊断标志物及其应用
CN111172161B (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗子痫前期中的应用
CN110607368B (zh) miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物的应用
CN111321226B (zh) 用于检测或抑制LncRNA PPP1R14B-AS1的核酸的应用
CN108504740B (zh) 在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的ucr序列、检测试剂盒及检测方法
CN111440875A (zh) 基于生物标志物的诊断和治疗癌症的用途
CN110577952A (zh) 一种长非编码rna在诊断和治疗乳腺癌中的应用
CN111471682A (zh) miR-23a作为诊断和治疗胃癌伪管生成标志物的应用
CN107184983B (zh) 一种肺腺癌的诊治靶标

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant