CN113832056A - 提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂及其制备方法和应用，所述复合益生菌制剂由4种益生菌组成，分别为Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens。四种菌株分别接种到液态培养基中富集培养，得到四种细菌悬液；将制得的四种细菌悬液分别离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS重悬细菌沉淀，将四种活菌悬液混合均匀，得到复合益生菌制剂；本发明的益生菌制剂的制作过程简单，生产成本较低，具有显著的提高动物肌内脂肪含量的效果。

Description

提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及动物生物制剂，具体涉及一种提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
我国是肉类消费大国，肉品质关系国民生活质量、营养水平及饮食安全。为满足市场需求，生产者过度追求动物的生长速度，使动物的生长周期越来越短，却因此忽略甚至降低了肉品质，生产的畜禽肉粗糙、肌内脂肪含量低，食之无味。畜禽肉品质的改良亦逐渐成为畜牧工作者的关注焦点和工作重心。
肌内脂肪含量是评定肉品质的重要指标，其决定肉的嫩度、风味等重要指标。如何挖掘新型高效的提高动物肌内脂肪含量，改善肉品质的微生态制剂成为当前的研究热点。动物肌内脂肪含量是一个多基因控制的数量性状。当前，提高动物肌内脂肪的方法主要是运用分子辅助标记技术、全基因组关联分析及转基因技术进行品种选育，但是存在试验成本高，技术不成熟，试验周期长等问题。因此，我们通过添加益生菌制剂，调控肠道微生物组成，实现动物肌内脂肪含量的有效提升，改善我国畜禽肉品质。
复合益生菌制剂是由两种或两种以上的微生物构成的制剂，微生物之间可优势互补，具有协同作用，为改善动物肌内脂肪提供新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种提升动物肌内脂肪的复合益生菌制剂及其制备方法和应用，该复合益生菌制剂由4种益生菌组合而成，4个微生物之间可优势互补，具有协同作用，用于提高动物的肌内脂肪含量，具有显著的效果，从而达到益生菌调控动物肌内脂肪含量，提高畜禽肉品质的目的。
为实现上述目的，本发明所设计一种提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂由4种益生菌组成，分别为Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacterpiscolens。
进一步地，所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为101～1010CFU/mL。
再进一步地，所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为106～1010CFU/mL。
再进一步地，所述复合益生菌制剂中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacterpiscolens的活菌数量比为1:1～3:1～3:1～3。
再进一步地，所述复合益生菌制剂中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacterpiscolens的活菌数量比为1:1:1:1。
本发明还提供了一种上述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens四种菌株分别接种到液态培养基中富集培养，得到四种细菌悬液；
2)将制得的四种细菌悬液分别离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS重悬细菌沉淀，将四种活菌悬液混合均匀，得到复合益生菌制剂；其中，复合益生菌制剂中，活菌数量为101～1010CFU/mL。
作为优选方案，所述复合益生菌制剂中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacterpiscolens的活菌数量比为1:1:1:1。
本发明还提供了一种上述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂在提高动物肌内脂肪中的应用。
作为优选方案，所述应用方法：将制备的复合微生态制剂灌服至幼龄动物胃中，灌服剂量为0.1～10毫升/次，隔日服一次。
上述4种益生菌均购于德国生物资源保藏中心(DSMZ)。
如需长途运输或者长期存放，为了保持复合益生菌制剂中菌株的活性，可以使用以下两种方法：
1)向不同菌株的活菌悬液中分别加入10％甘油，混匀得到细菌冻存液，置于液氮中低温保存。使用前通过37℃水浴快速解冻菌液，然后将制得的细菌悬液分别离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细菌沉淀，按Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacterpiscolens的活菌数量比为1:1:1:1混合均匀，得到复合益生菌制剂。
2)向制得的复合益生菌制剂中加入10％甘油，混匀得到细菌冻存液，置于液氮中低温保存。使用前通过37℃水浴快速解冻菌液，离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细菌沉淀，得到复合益生菌制剂。
本发明的有益效果：
本发明的益生菌制剂的制作过程简单，生产成本较低，具有显著的提高动物肌内脂肪含量的效果。
附图说明
图1为复合益生菌制剂灌服小鼠后提高小鼠的肌内脂肪含量图；
图2为复合益生菌制剂灌服小鼠后提高小鼠体脂和皮下脂肪含量的micro-CT图及统计图；
图3为复合益生菌制剂灌服小鼠后提高小鼠肌肉脂肪合成相关基因的表达图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
任意一种菌株的菌液制备方法如下：
1)复苏：将Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacteriumsaccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens任意一种的液氮冻存的菌液于37℃水浴快速复苏，并接种到新鲜的液态培养基中富集培养。待液态培养基变浑浊，用接种环沾取适量菌液划线接种于固态培养基中；
2)固态培养基中长出单菌落后，挑取单菌落接种到新鲜的液态培养基中富集培养。待液态培养基变浑浊，提取菌液中细菌基因组DNA，PCR扩增16S rDNA全长并纯化回收。将回收的16S rDNA片段送至测序公司进行测序，经测序结果与NCBI数据库进行比对，验证挑取的单菌落是否为Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacteriumsaccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens菌种中任意一种；
3)扩大培养：将经测序比对验证成功的菌液接种到新鲜的液态培养基扩大培养。采用活菌计数法对菌液中的活菌计数，并根据计数结果将菌液中的活菌数量调整为106～1010CFU/mL；向不同菌株的菌液中分别加入甘油得到细菌冻存液(甘油的体积分数为10％)，置于液氮中低温保存。
按上述方法得到Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacteriumsaccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens的四种菌液，冻存，备用。
提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂1的制备方法，包括以下步骤：
1)将Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens四种菌株分别接种到液态培养基中富集培养，得到四种细菌悬液；
2)将制得的细菌悬液离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS重悬细菌沉淀，按活菌数量比为1:1:1:1将活菌悬液混合均匀，得到复合益生菌制剂1；其中，复合益生菌制剂1中，总活菌数量为106～1010CFU/mL。
上述复合益生菌制剂1的应用：
在小鼠3-11周，将制备的复合益生菌制剂1灌服至C57BL/6J小鼠的胃中，灌服剂量为0.1～1毫升/次，隔日服一次。与实施磷酸盐缓冲液(PBS)灌服的对照组相比，该复合益生菌制剂1灌服组在小鼠11周龄肌内脂肪含量显著提高。
该复合益生菌制剂1有效提高了动物的肌内脂肪含量(P<0.05)。此外，复合益生菌制剂1灌服组提高小鼠体脂沉积(图2)，提高小鼠皮下脂肪含量。对小鼠肌肉中脂肪合成相关基因的表达进行定量检测，发现复合益生菌1能提高小鼠肌肉中脂肪合成相关基因Cd36、Dgat2和Fasn的表达(图3)。
实施例2
本实施例2制备复合益生菌制剂2的方法与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：
复合益生菌制剂2中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacteriumsaccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens的活菌数量比为1:2:3:2。
实施例3
本实施例3制备复合益生菌制剂3的方法与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：
复合益生菌制剂3中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacteriumsaccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens的活菌数量比为1:3:2:3。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂，其特征在于：所述复合益生菌制剂由4种益生菌组成，分别为Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacteriumsaccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens。
2.根据权利要求1所述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂，其特征在于：所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为101～1010CFU/mL。
3.根据权利要求1所述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂，其特征在于：所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为106～1010CFU/mL。
4.根据权利要求1所述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂，其特征在于：所述复合益生菌制剂中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens的活菌数量比为1:1～3:1～3:1～3。
5.根据权利要求1所述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂，其特征在于：所述复合益生菌制剂中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens的活菌数量比为1:1:1:1。
6.一种权利要求1所述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens四种菌株分别接种到液态培养基中富集培养，得到四种细菌悬液；
2)将制得的四种细菌悬液分别离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS重悬细菌沉淀，将四种活菌悬液混合均匀，得到复合益生菌制剂；其中，复合益生菌制剂中，活菌数量为101～1010CFU/mL。
7.根据权利要求6所述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于：所述复合益生菌制剂中，Bacteroides uniformis、Hydrogenoanaerobacteriumsaccharovorans、Sphaerochaeta globosa和Pyramidobacter piscolens的活菌数量比为1:1:1:1。
8.一种权利要求1所述提高动物肌内脂肪含量的复合益生菌制剂在提高动物肌内脂肪中的应用。
9.一种权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用方法：将制备的复合微生态制剂灌服至幼龄动物胃中，灌服剂量为0.1～10毫升/次，隔日服一次。
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