CN113817866A - 一种主效qtl位点的ssr分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及葡萄分子育种领域,具体涉及主效QTL位点的SSR分子标记及其筛选方法和应用,本技术方案利用特定的筛选方法筛选出新的SSR分子标记P1_VvMETK5,并将其应用在鉴定葡萄果实无核中。上述技术方案中提供的鉴定葡萄果实无核主效QTL位点,该位点的贡献率为78.95%,基于该位点筛选到了连锁的SSR新分子标记P1_VvMETK5,该标记在有核和无核品种中只扩增出aa/ab和AA/AB两种基因型,在自然群体中无核性状ab杂合基因型解释率为57.70%,有核性状BB基因型解释率为78.95%。

Description

一种主效QTL位点的SSR分子标记及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及葡萄分子育种技术领域,具体涉及一种主效QTL位点的SSR分子标记及其筛选方法和应用。
背景技术
葡萄是多年生落叶木质藤本植物。随着葡萄品种的不断更新,无核葡萄因具有丰产、优质、食用方便等优点,在鲜食和制干葡萄市场中占有重要地位,也是目前葡萄育种的重要发展方向。当前无核葡萄的育种方法有:常规杂交育种、芽变选种、多倍体育种、胚挽救育种和分子标记辅助选择育种。分子标记辅助选择因不受发育阶段、外界环境及组织特异性的影响,可以高效的在幼苗期进行检测,克服杂交育种周期长的缺点,提高育种效率。
目前,研究人员已开发出一系列的无核分子标记,包括SCAR标记SCC8、SCF27、SCP18、39970524-5、39970524-6;SSR标记VMC7F2、P1_VvAGL11、P2_VvAGL11、P3_VvAGL11、VvSD10(申请号为201711115462.8的中国发明专利)以及探针GSLP1,但其在不同类型无核葡萄及不同群体中的鉴定效率不同,通用性不高。
基于此,筛选高效无核分子标记,开发新的用于鉴定葡萄无核性状的分子标记至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记及其应用,能有效解决现有无核分子标记在不同类型无核葡萄及不同群体中的鉴定效率不同、通用性不高的问题。
为解决上述技术问题,本发明采用了以下技术方案:
一种主效QTL位点的SSR分子标记,所述SSR分子标记为P1_VvMETK5,且SSR分子标记的引物对的正向引物序列为:5’-GGATCTGGTTGTTGTCAGCA-3’,反向引物序列为:3’-CGAAGTATCACTCCAGAAACG-5’。
同时提供了上述主效QTL位点的SSR分子标记的筛选方法,包括以下步骤:
S1.根据已统计的无核分子标记的序列,筛选无核分子标记附近1Kb范围内的基因;
S2.利用赤霉素和清水处理的种子/核区的转录组数据,并对赤霉素和清水处理种子各个阶段的差异表达基因进行聚类分析;
S3.筛选到与无核基因VvAGL11表达趋势相似的若干基因,将筛选到的基因与无核分子标记附近1Kb范围内的基因进行比对,鉴定到一个无核候选基因VvMETK5;
S4.对比赤霉素和清水处理的测序数据中VvMETK5基因启动子上的SSR位点发现在(A)14的SSR位点与VvMETK5基因启动子之间存在20bp的差异序列,基于此序列,筛选出新分子标记P1_VvMETK5。
同时还提供了上述主效QTL位点的SSR分子标记的应用,其是利用上述SSR分子标记鉴定葡萄果实无核的;包括以下步骤:
用所述引物对扩增待检测葡萄样本和有核、无核对照样本的全基因组DNA,扩增产物后进行电泳检测,若扩增产物的电泳条带与开发预测的P1_VvMETK5标记条带一致,则代表待检测葡萄样本为无核品种。
上述应用是利用PCR进行扩增产物的;且PCR的反应体系为25μL体系,其中:PCR反应酶12.5μL;上下游引物各1μL;稀释后的DNA1μL;灭菌后的去离子水9.5μL。
PCR反应条件为:94℃预变性,5 min;95℃变性、30 s,59℃、30 s,72℃延伸、30 s,30个循环;72℃延伸,10 min;16℃下保存。
标记扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中因条带大小被区分,将引物扩增的多态性条带数记为该位点的等位基因数,根据DNA marker判读条带大小,用Excel进行统计。
之后根据记录条带的大小,使用GenAlex软件进行遗传学参数分析,包括:观察等位基因数Na,有效等位基因数Ne,观测杂合度Ho,期望杂合度He和Shannon’s信息指数I;最后使用Powermarker 软件计算多态信息含量(PIC)。
上述技术方案中提供的鉴定葡萄果实无核主效QTL位点,通用性高,且该位点的贡献率为78.95%,基于该位点筛选到了连锁的SSR新分子标记P1_VvMETK5,该标记在有核和无核品种中只扩增出aa/ab和AA/AB两种基因型,在自然群体中无核性状ab杂合基因型解释率为57.70%,有核性状BB基因型解释率为78.95%。
附图说明
图1为CK和GA处理下VvAGL11在种子发育过程中的相对表达比较图;
图2为CK和GA处理下VvMETK5在种子发育过程中的相对表达比较图;
图3为启动子序列差异图;
图4中的(A)为P1_VvAGL11标记在新杂交群体中的扩增结果;
图4中的(B)为P2_VvAGL11标记在新杂交群体中的扩增结果;
图4中的(C)为P3_VvAGL11标记在新杂交群体中的扩增结果;
图4中的(D)为P1_VvMETK5标记在新杂交群体中的扩增结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行具体说明。应当理解,以下文字仅仅用以描述本发明的一种或几种具体的实施方式,并不对本发明具体请求的保护范围进行严格限定。
分子标记 P1_VvMETK5的开发
根据已统计的无核分子标记的序列,在无核分子标记附近1 Kb范围内的基因,共统计到1261个基因。利用GA-藤稔(GA3处理)和CK-藤稔(清水处理)的种子/核区的转录组数据,使用K均值聚类算法(K-means)对CK-藤稔和GA-藤稔在种子发育差异基因进行聚类分析。
筛选到与无核基因VvAGL11表达趋势相似的41个基因,并将差异基因分为30类,其中,无核基因VvAGL11属于第14类;将41个基因与已开发标记附近1Kb 的位置范围内的1261个基因进行比对,筛选到VvMETK5(VIT_07s0005g02230)为种胚败育相关基因。
进一步比对GA-藤稔和CK-藤稔测序数据中VvMETK5基因启动子上的SSR位点,发现在(A)14的SSR位点与VvMETK5基因启动子之间存在20bp的差异序列,基于此序列,开发了P1_VvMETK5的新分子标记。如图1、图2和图3所示。
分子标记 P1_VvMETK5的检测和评价
(1)分子标记P1_VvMETK5在无核群体(表1中的W群体)中的检测:对分子标记 P1_VvMETK5 在无核群体中扩增出的条带进行统计分析,发现在无核群体中,11个品种在61 bp处扩增出纯合位点,记为aa,另11个品种同时扩增出61 bp和72 bp杂合位点,记为ab。进一步分析无核群体中表现为两种基因型的无核类型,如表2所示,结果显示欧美和欧亚无核葡萄中aa纯合基因型和ab杂合基因型频率相同,表现为软核类型均表现ab杂合基因型;两个三倍体品种分别表现为aa和ab基因型,而残核类型表现为aa基因型频率高于ab基因型,表明P1_VvMETK5标记在不同无核类型中表现的基因型存在一定的差异。
表1 P1_VvMETK5标记在验证群体中的扩增结果
Figure 163204DEST_PATH_IMAGE001
Figure 611503DEST_PATH_IMAGE002
Figure 407552DEST_PATH_IMAGE003
Figure 333920DEST_PATH_IMAGE004
表中,W:无核群体;Z:自然群体;数字:扩增的条带大小。
表2 22个无核葡萄品种信息
Figure 413871DEST_PATH_IMAGE005
(2)分子标记P1_VvMETK5在自然群体(表1中的Z群体)中的检测:自然群体中的扩增结果显示,共有56个品种在61 bp处扩增出纯合位点;参考表3,其中无核品种为11个,有核品种为45个,其基因型分别记为aa和AA;27个品种扩增出长度为61和72 bp的杂合条带,无核品种和有核品种各占15个和12个,基因型分别记为ab和AB。综合分析发现,无核品种中aa和ab的频率分别为42.30%和57.70%,ab基因型在无核品种中的频率要高于aa;而在有核品种中AA基因型的频率高于AB基因型,其频率分别为78.95%和21.05%。表明在自然群体中,无核品种主要以ab杂合基因型出现,而有核品种中主要以AA纯合基因型出现。
表3 自然群体的品种信息
Figure 767492DEST_PATH_IMAGE006
Figure 300105DEST_PATH_IMAGE007
Figure 279431DEST_PATH_IMAGE008
(3)分子标记P1_VvMETK5对无核群体和自然群体的遗传多样性分析及综合评价:对P1_VvMETK5应用于无核群体和自然群体所得位点进行分析,其多样性参数如表4。两个群体中等位基因数Na均为2;无核群体中有效等位基因数Ne是1.600,观测杂合度Ho均值为0.500,期望杂合度He为0.375,Shannon's信息指数I为0.562,多态信息含量PIC为0.305;自然群体的有效等位基因数Ne为1.374,观测杂合度Ho为0.325,期望杂合度He为0.272;Shannon's信息指数I和多态信息含量PIC为分别为0.444和0.235。在无核群体中,P1_VvMETK5引物的多态信息含量PIC大于0.25,为中度多态性引物;但在有核群体中,P1_VvMETK5引物的多态信息含量PIC小于0.25,为低度多态性引物。
相较于与P1_VvAGL11、P2_VvAGL11、P3_VvAGL11标记,P1_VvMETK5在无核和有核葡萄品种中同样出现了不同的基因型,且在自然群体中P1_VvMETK5的多态信息含量PIC最低,在无核品种中ab基因型解释率为58%,有核品种中BB基因型解释率为79%,均超过了50%,表明P1_VvMETK5在自然群体中能较好的验证有核和无核性状。
表4 无核群体和自然群体遗传差异的SSR分析
Figure 213889DEST_PATH_IMAGE009
无核分子标记的应用
(1)新开发标记P1_VvMETK5对新杂交群体的鉴定:新开发的P1_VvMETK5标记检测新杂交群体(图4和表5);在编号为7、11、14、15和18的个体中扩增出61 bp的纯合位点,记为aa;编号为1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、13、16、17的个体均扩增出61 bp和72 bp的杂合位点,记为ab。两种基因型aa和ab频率分别为27.78%和72.22%。
结合P1_VvMETK5在无核群体和自然群体中的鉴定结果,推断表现为杂合基因型的个体具有无核性状,因此推断编号为1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、13、16、17的个体为无核植株。
表5 SSR标记在新杂交群体中的扩增结果
Figure 738411DEST_PATH_IMAGE010
(2)新杂交群体无核植株的分析
新开发标记P1_VvMETK5标记的检测结果显示编号为1,2,3,4,5,6,8,9,10,12,13,16,17的个体可能为无核植株,结合P1_VvMETK5标记和高效SCF27和39970524-5在新杂交群体中的鉴定结果,发现编号为1,2,3,4,5和17的个体在三种标记的检测下,均被预测为无核植株,且聚类分析显示编号为1,4,5的个体亲缘关系较近,编号为3和17的个体具有较近的亲缘关系。编号为6,8,9,10,12,13,16,18的个体只在一种或两种标记中被检测到,但根据聚类分析的结果,显示编号为6的植株与预测为无核的个体(编号为2)具有较近的亲缘关系;编号为10,12的植株与预测为无核的个体(编号为3和17)具有较近的亲缘关系,由此推测编号6,10,12的个体也可能具有无核性状。
本发明确定了葡萄果实无核性状的主效QTL位点构建的遗传连锁图谱的第18连锁群上,检测到葡萄果实无核主效QTL位点,该位点贡献率为78.95%,基于该位点筛选到了连锁的SSR新分子标记P1_VvMETK5。
本发明筛选的葡萄无核主效QTL位点的SSR分子标记,根据有核和无核品种中VvMETK5基因启动子序列上SSR位点,开发了P1_VvMETK5新分子标记。该标记在有核和无核品种中只扩增出aa/ab和AA/AB两种基因型,在自然群体中无核性状ab杂合基因型解释率为57.70%,有核性状BB基因型解释率为78.95%,均超过了50%。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施方式,对于本技术领域的普通技术人员来说,在获知本发明中记载内容后,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对其作出若干同等变换和替代,这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种主效QTL位点的SSR分子标记,其特征在于:所述SSR分子标记为P1_VvMETK5,且SSR分子标记的引物对的正向引物序列为:5’-GGATCTGGTTGTTGTCAGCA-3’,反向引物序列为:3’-CGAAGTATCACTCCAGAAACG-5’。
2.一种主效QTL位点的SSR分子标记的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.根据已统计的无核分子标记的序列,筛选无核分子标记附近1Kb范围内的基因;
S2.利用赤霉素和清水处理种子的转录组数据,并对赤霉素和清水处理种子各个阶段的差异表达基因进行聚类分析;
S3.筛选到与无核基因VvAGL11表达趋势相似的若干基因,并将筛选到的基因与无核分子标记附近1Kb范围内的基因进行比对,鉴定到一个无核候选基因VvMETK5;
S4.对比赤霉素和清水处理的测序数据中VvMETK5基因启动子上的SSR位点,发现在(A)14的SSR位点与VvMETK5基因启动子之间存在20bp的差异序列,基于此序列,筛选出新分子标记P1_VvMETK5。
3.一种主效QTL位点的SSR分子标记的应用,其特征在于:利用权利要求1所述的SSR分子标记鉴定葡萄果实无核。
4.根据权利要求3所述的主效QTL位点的SSR分子标记的应用,其特征在于,其应用包括以下步骤:
用所述引物对扩增待检测葡萄样本和有核、无核对照样本的全基因组DNA,扩增产物后进行电泳检测,若扩增产物的电泳条带与开发预测的P1_VvMETK5标记条带一致,则代表待检测葡萄样本为无核品种。
5.根据权利要求4所述的主效QTL位点的SSR分子标记的应用,其特征在于,是利用PCR进行扩增产物的。
6.根据权利要求5所述的主效QTL位点的SSR分子标记的应用,其特征在于,PCR的反应体系为25μL体系,其中:PCR反应酶12.5μL;上下游引物各1μL;稀释后的DNA1μL;灭菌后的去离子水9.5μL。
7.根据权利要求5所述的主效QTL位点的SSR分子标记的应用,其特征在于,PCR反应条件为:94℃预变性,5 min;95℃变性、30 s,59℃、30 s,72℃延伸、30 s,30个循环;72℃延伸,10 min;16℃下保存。
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